שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א

Summary

פרוטוקול זה מתאר מספר הליכים להכנת דגימות רקמה באיכות גבוהה קפואה בזמן נקרוזה לשימוש במערכת שביט להעריך נזק DNA: 1) רקמות טחון, 2) מגורד תאים אפיתל ממערכת העיכול, ו 3) לקוביות רקמה דגימות, הדורשות הומוגון באמצעות מכשיר משתמש ברקמה.

Abstract

הטיפול שביט הוא צובר פופולריות כאמצעי להערכת נזק DNA בתאים מתורבתים ורקמות, במיוחד בעקבות חשיפה כימיקלים או שלחצים סביבתיים אחרים. השימוש שיטת שביט בבדיקת הרגולציה של פוטנציאל גנומיק של מכרסמים כבר מונע על ידי אימוץ של ארגון לשיתוף פעולה כלכלי ופיתוח (ה-OECD) בדיקת מנחה ב 2014. שקופיות של שביט מכינים בדרך כלל מרקמה טרייה בזמן נקרופסי; עם זאת, דוגמאות לרקמות מקפיא יכולות להימנע מאתגרים לוגיסטיים הקשורים להכנה בו של שקופיות מאיברים מרובים לכל בעל חיים ומבעלי חיים רבים ללימוד. ההקפאה גם מאפשרת דגימות משלוח ממתקן החשיפה למעבדה שונה לניתוח, ואחסון של רקמה קפואה מאפשר מאוד החלטה ליצור נתונים נזק DNA עבור איבר נתון. שיטת השביט האלקליין היא שימושית לזיהוי חשיפה של דנ א כפול ומעברי-גדיל בודדים, נגעים אלקלי-לבנה, והפסקות שלמות הקשורות לתיקון כריתה DNA לא מלאה. עם זאת, נזק לדנ א יכול לנבוע גם מהטיה מכנית או הליכי עיבוד לדוגמה פסולים, הקמת תוצאות הטיפול. שינוי באוסף ועיבוד של דגימות רקמות במהלך נקרוזים עלול להיות קשה לשלוט בשל העובדים מעבדה ברמות שונות של ניסיון בקצירת רקמות עבור שביט השביט. שיפור עקביות באמצעות הדרכה מרענן או הפריסה של יחידות ניידות מאויש עם אנשי מעבדה מנוסים הוא יקר ולא תמיד יכול להיות אפשרי. כדי לייעל את הדור העקבי של דגימות באיכות גבוהה עבור ניתוח שביט כוכב, שיטה עבור הומוגניזציה קוביות פלאש קפוא של רקמות באמצעות מכשיר מותאם אישית רקמת העור הוערך. דגימות שהוכנו לצורך שביט בשיטת השביט על ידי שיטה זו בהשוואה לטובה באיכות לדוגמיות של רקמות טריות וקפואות שהוכנו על-ידי מינויה במהלך נקרופסי. יתר על כן, נזק DNA בסיסית נמוכה נמדד בתאים מקוביות קפואות של רקמות לאחר אחסון ממושך.

Introduction

שיטת השביט משמשת יותר ויותר כאמצעי להערכת נזקי DNA בתאים מתורבתים ורקמות חשופים לכימיקלים או לחצים סביבתיים אחרים¹. האפשרות הניתנת לזיהוי הפסקות דנ א כפולות ויחיד, נגעים אלקלי-לבנה, ומעברי-גדיל בודדים הקשורים לתיקון DNA לא שלם. המועצה הבינלאומית להרמוניה של דרישות טכניות עבור תרופות לשימוש האדם (העליונה) מנחה עבור בדיקות התרופות ממליץ על הצירוף DNA שבירה כגון שיטת השביט כמבחן השני כדי להשלים את הטיפול מכרסם מיקרוקליאוס מיקרו להערכת vivo גנורעילות וכמבחן מעקב להערכת מצב של פעולה באברי היעד^{של אינדוקציה גידול} הרשות האירופית לבטיחות מזון (EFSA) ממליצה על שיטת שביט vivo כמבחן המשך המעקב המתאים לחקירת הרלוונטיות של תוצאה חיובית במבחן הרעילות של מבחנה³. ב-2014 אושרה מבחן ה-OECD לצורך הבחינה של כוכב השביט המכרסמים, ובכך הגבירה את יכולת ההתמדה לשימוש בבדיקות רגולטוריות של פוטנציאל הגנוטוקסיס. המנה מבוססת על הפרדה אלקטרופיניטית של לולאות DNA רגוע ושברי העוברים מתוך נוקלאונואידים של תאים ליטיים. ביסודו של דבר, תאים בודדים מוטבעים agarose כי כבר שכבתית על שקופיות מיקרוסקופ. שקופיות לאחר מכן שקוע במאגר הליזה ואחריו בסיסי (pH > 13) פתרון, אשר מאפשר את ה-DNA הגרעינית היטב מתפתל להירגע ולהירגע. שקופיות ממוקמות לאחר מכן בשדה חשמלי, אשר מעורר הגירה של דנ א טעונה שלילית לקראת האנדה, יצירת תמונות הדומות לשביט; הכמות היחסית של ה-DNA בזנב השביט בהשוואה לראש כוכב השביט הוא פרופורציונלי באופן ישיר כמות של נזק DNA; תוכן ה-DNA בזנב הוא בדרך כלל בכמת באמצעות תוכנת דימות דיגיטלי.

בגלל שיטת השביט מזהה דנ א מפוצל, כימות מדויק של הנזק לחשיפה DNA המושרה יכול להיות מבולבל על ידי פיצול כרומטין הקשורים נמק או אפופטוזיס הנובע הטיפול המושרה ציטוזה או מתח. יתר על כן, נזק DNA יכול להתרחש כתוצאה של הטיה מכני או עיבוד לדוגמה לא תקין⁴. החשיבות של שמירה על רקמות שנקטפו מקורר לפני הכנת שקופית כדי למזער את רמת בסיסית של נזק DNA הפגינו בעבר^5,6. מעבדות רבות מכינות שביט מתוך רקמה טרייה; עם זאת, הדבר יכול להיות מאתגר לוגיאני כאשר מכינים שקופיות מסוגי רקמות מרובים לכל בעל חיים במחקר עם מספר רב של בעלי חיים. כמו-כן, מדובר בבעיה כאשר ההכנה והניתוח של השקופיות מתרחשות במעבדה מרוחקת, הדורשת משלוח של דגימות. לדוגמה, תוכנית הטוקסיקולוגיה הלאומית של ארצות הברית כוללת את שיטת השביט כרכיב של תוכנית הרעלים הגנטית שלה בדיקה (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) ולפעמים משלבת את הערך לתוך 28 או 90 יום לימודי הרעילות במינון; זה מחייבת אוסף של רקמות על ידי המעבדה בחיים והעברת דגימות למעבדה אחרת לניתוח. כדי להשיג את זה, חתיכות רקמה הם כתוש, ו/או תאים אפיתל של מערכת העיכול הם מגורד ושתלים סלולריים הם פלאש קפואים ומאוחסנים במקפיא עבור המשלוח הבאים ואחסון על ידי המעבדה המקבלת עד ניתוח⁷. טיפול נאות של דגימות חיוני להשגת נתונים באיכות גבוהה באמצעות רקמה קפואה; עם זאת, מניפולציה בלתי משתנה של דגימות רקמה במהלך נקרוזים שבוצעו על ידי אנשים שמשתנים אי פעם קשה לשלוט, במיוחד במעבדות בחיים כי לא באופן שגרתי הקציר רקמות עבור שביט השביט. רענון האימון של צוות נמק או שימוש ביחידה ניידת מאויש על ידי אנשי מעבדה מנוסים כדי לאסוף דגימות רקמות טריות או קפואות הוא לעתים קרובות יקר מדי, לא ריאלי, או פשוט חסר ערך.

כדי להבטיח בצורה טובה יותר את הדור העקבי של דגימות רקמה באיכות גבוהה עבור העברה לאתר מרוחק עבור ניתוח שביט כוכב, השירות של שיטה שפורסמה⁶ של שימור רקמות מפני קוביות פלאש קפוא של רקמות נחקרו. בשיטה זו, קוביות קפוא של רקמות נטענים לתוך מכשיר מיקרו של רקמת נירוסטה (איור 1) הממוקם לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל מאגר קר. הקוביה של רקמות הוא דחף לאחר מכן דרך מד קטן שינוי בסוף המכשיר. שוב ושוב השעיית רקמות דרך מסננת שינוי בשני הכיוונים מספר פעמים גורמת השעיית תא אחיד בודד יחסית. דגימות שהוכנו על ידי שיטה זו בהשוואה לטובה באיכות לדגימות רקמות טריות וקפואות שהוכנו על ידי מינויה. כתוספת תועלת, בניגוד דגימות בשר טחון, קוביות רקמה ניתן לאחסן קפוא לפרקי זמן ממושך ועדיין להניב תוצאות באיכות גבוהה בתוך שביט השביט.

Protocol

רקמות נקצרו במהלך התנהלות המחקרים שבוצעו במתקני AAALAC-מוסמך במעבדות החוזה NTP בהתאם לתקנות המעבדה הטובה לתרגול (21 CFR Part 58) ולהשתמש בפרוטוקולים בעלי חיים שאושרו על ידי החיה המוסדית הוועדה טיפול ושימוש (IACUC) בכל מעבדה.

1. הקציר ועיבוד רקמות

הערה: זה שימושי להכין צינורות לדוגמה כפולים (למשל, כבד) או להעביר כמחצית של מדגם לצינור אחסון אחר (למשל, התריסריון, הבטן) כדי לאפשר ניתוח מחדש, במידת הצורך. כדי למזער את השונות הפוטנציאלית לדוגמה לדוגמאות לרקמות מערכת העיכול, מומלץ לקחת טיפול כדי לדגום את אותו אזור של רקמה ביחס לקיבה עבור כל חיה, ומדגם להיות מחולק ליצירת דגימות כפולות. מלקחיים פלסטיק מומלצים להעברת רקמות דביקות כגון מוח. כאופציה, בשר טחון, שפשוף או מולגניים ההכנות רקמות ניתן לסנן כדי להשיג הומוגנית תא יחיד השעיות באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר המצורפת צינור חרוט.

1. הסר את כל הרקמה, האיברים והפסולת המחוברים מאברים מעניינים. מיד לאחר ההסרה, מוהים את האיבר במרץ בסירה שוקלים בגודל בינוני המכיל ~ 7 מ ל של הצטננות קר⁺⁺ טרי מוכן פתרון מלח, 10% v/v dmso^{, ו}20 מ"מ edta pH 7.5) כדי להסיר דם שיורית פסולת.
2. העבר כל איבר לסירת שקילה נקייה אחרת המכילה מספיק (~ 7 mL) פתרון מינורי קר כדי לשמור על הרקמה שקוע, על קרח, עד לעיבוד נוסף.
3. הסר מקטע של כל אחד מאברי העניין והציבו אותו בקלטת הטבעה. תקן בתוך 10% פורמאלין מאגור נייטרלי, לקצץ, ו פרפין להטביע על פי הנהלים הסטנדרטיים של המעבדה להערכת העתיד העתידי האפשרי.
4. עבור הכבד, לחתוך קטע האורך 5 מ"מ של האונה השמאלית ומסושת בעדינות ב-~ 7 מ ל של פתרון מינוב קר. מניחים את רצועת הרקמה לתוך הסירה נקי בגודל בינוני שוקל המכיל ~ 7 מ ל של פתרון קריר קר ולשמור על הקרח עד מוכן לעבד עוד (שלב 1.8 או 1.11).
5. עבור התריסריון, לחתוך חלק 10 מ"מ של התריסריון האבובית לבטן. שימוש a 21 – 25 גרם מחט, סומק להסיר פסולת וחיידקים.
   1. הכנס את המחט לקצה אחד של התריסריון ואת הסומק עם 1 מ ל של פתרון מינוב קר.
   2. ריקון הכיוון השני על-ידי היפוך התריסריון שוב ושוב עם 1 מ ל של פתרון מחדש. להיפטר המחט.
   3. פורסים את התריסריון פתוח ולשטוף אותו ב ~ 7 מ ל של פתרון לפני לשים אותו לתוך סירת שקילה בינונית בגודל המכיל ~ 7 מ ל של פתרון נקי מיותר; לשמור על הקרח עד מוכנים לעבד עוד (שלב 1.8 או 1.11).
6. עבור המוח, זה עשוי להיות שימושי לחלק תחילה את המוח לשתי אונות; כמחצית אחת ניתן לשמור עבור histopathology אפשרי (ראה שלב 1.2).
   1. לנתח את אזור המוח (עם) של עניין ומסושת בעדינות ב-~ 7 מ ל של פתרון מינוב קר.
   2. העברת רקמות (s) לסירה נקיה בגודל בינוני המכיל ~ 7 מ ל של פתרון מועט קר ולשמור על הקרח עד מוכן לתהליך נוסף (שלב 1.8 או 1.11; שים לב כי אזורים קטנים כגון המוח הקטן וההיפוקמפוס עשויים לא לדרוש קיצוץ נוסף).
7. לבטן
   1. להסיר ולמחוק את היער. לחתוך לפתוח את הבטן בלוטות ולשטוף חינם מהאוכל באמצעות ~ 7 מ ל של מאגר מינורי קר בסירה שקילה בינונית.
   2. הסר רצועה של 5 מ"מ של בטן הבלוטות האבובית לתריסריון עבור קיבעון אפשרי הערכה histopathology (ראה שלב 1.2).
   3. מניחים את הבטן הנותרת ל ~ 7 מ ל של מאגר מינורי קר בסירת שקילה בינונית בגודל ומודטה על הקרח במשך 15 – 30 דקות.
      הערה: ייתכן ששלב הדגירה הזה אינו הכרחי; שלב זה נכלל בפרוטוקול האימות של הג, אך אינו מוזכר במבחן ה-OECD מנחה^8,9.
   4. העבר את הקיבה לחתיכת מנקה של פרפין (או צלחת פטרי או סירה שוקלת) ובעדינות לגרד את האפיתל פני השטח פעמיים או יותר באמצעות להב אזמל או המגרד polyארבאואפן (מצופה) להסיר פסולת. להרים את רירית הקיבה עם מלקחיים ולשטוף עם 1 מ ל של מאגר מינורי קר באמצעות pipet. להעביר את רקמת הקיבה למשטח נקי או צלחת.
   5. בזהירות לגרד את האפיתל הקיבה 4 – 5 פעמים (יותר, אם יש צורך) בפתרון מינורי (בדרך כלל 250 μL/עכבר או 500-1000 μL/עכברוש) עם הגב של להב אזמל או מגרד לשחרר את התאים. באופן אופציונלי, לשטוף את הרקמה עם נפח שווה בקירוב של פתרון מינורי כדי לשחזר תאים נוספים. לאסוף את הפתרון הכולל המכיל תאים שפורסמו באמצעות pipet ולהעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה על הקרח.
8. לקבלת דגימות רקמה מבית הקירור, חותכים סעיף 3 – 4 מ"מ של רקמת הכבד או המוח או ~ 5 מ"מ של התריסריון והעברת תווית 1.5 או 2.0 mL מיקרוצנטריפוגה שפופרת המכיל 1 מ ל של פתרון מינוגה קר. המאדות במהירות (≤ 30 s) עם מספריים מינ, עד דק התפזרו, תוך שמירה על המדגם קר. המדגם צריך להיראות מעט מעונן; עם זאת, מקובל שחלק מהחלקים יישארו מתפשרים בתחתית הצינורית.
9. כדי להשתמש ברקמה טרי, לשמור על צינורות המכילים רקמה טחון או תאים אפיתל שפשוף על הקרח; השתמשו ברקמה כדי להכין שקופיות של שביט בתוך כ 1 h של קציר (המתואר בסעיף 2).
10. על הקפאת דגימות הרקמה, מיד לאחר מקור או אוסף של תאים אפיתל מגורד
    1. אבטחו את מכסה הצינור והצינור הנפתח לתוך בקבוקון מלחמתי המכיל חנקן נוזלי; צינורות עשויים להישמר חנקן נוזלי למשך נקרופסי (≤ 3 h).
    2. לאחזר צינורות באמצעות מצקת ומקום על קרח יבש למיין. העברת צינורות לתוך המקפיא על קרח יבש ותיבת החנות במקפיא-80 ° c.
11. להכנת קוביות קפואות של רקמה, חותכים כמה חתיכות קטנות של רקמה (≤ 4 מ"מ בקוטר ~ 6 מ"מ באורך; איור 1).
    1. שחרר אותם בנפרד ישירות לתוך סירת שקילה בינונית או כלי מתאים אחרים המכילים חנקן נוזלי.
    2. המתן כמה שניות לחתיכות כדי להקפיא לחלוטין ולהעביר קוביות רקמה קפואה בודדים לצינור מיקרוצנטריפוגה בתווית או קריוצינור מתוחזק על קרח יבש; אל תאפשר לחלקים להתאחד במהלך תהליך ההקפאה.
    3. העברת צינורות לתוך המקפיא על קרח יבש ותיבת החנות במקפיא-80 ° c.

2. הכנת שקופיות

1. לרקמת בשר טחון
   1. שמרו על צינורות המכילים רקמות טריות על קרח רטוב.
   2. מניחים צינורות של רקמה קפואה לתוך הטמפרטורה בחדר אמבט מים עד הדגימות מופשרים לחלוטין, תוך הקפדה שהם נשמרים קר. מיד להעביר את הצינורות על הקרח.
   3. מיד לפני הנסיגה תאים עבור העברה agarose (שלב 2.3), לערבב כל תא השעיה בעדינות; עבור דגימות שאינן מסוננות, אפשר לגושים גדולים להתיישב בתחתית הצינורית. לשמור על כל הצינורות על הקרח עד שקופיות הוכנו עבור כל הדגימות.
2. לקוביות רקמה
   1. לאחזר צינורות המכילים קוביות רקמה ממקפיא 80 ° c ולשמור על קרח יבש עד הכנת השקופיות.
   2. מחלק 1 mL של בינונית של הסוחר (0.14 M היאl, 1.47 mM KH₂PO₄, 2.7 mm Kcl, 8.1 mm Na₂Hpo₄, 10 מ"מ naedta, pH 7.4) או מיניגה פתרון לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה המסומנים בשנת mL עבור כל מדגם ולשמור על קרח.
   3. עובד במהירות כדי למנוע את הרקמה הרקמות, למקם קוביית של רקמה לתוך הקצה הפתוח של מכשיר מהפך רקמת טמפרטורת חדר (איור 1). ניתן להשתמש בחלקים מרובים ברקמות; במידת הצורך, ניתן לגזור את הרקמה הקפואה או לחדור לחלקים קטנים יותר באמצעות מרגמה קרה ומכתש כדי להקטין את גודל הקוביה כדי להשתלב במכשיר.
   4. במהירות להוסיף מזרק גודל בהתאמה לתוך המכשיר כדי לדחוף את הרקמה לקצה שינוי שצריך להציב לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל פתרון מהיר קר; להימנע מאלץ את הנוזל לגלוש בשפופרת. לטבול את קצה הרשת של המכשיר עבור כ 5-10 בפתרון קריר קר כדי לאפשר את הרקמה להפשיר לחלוטין.
   5. לדכא לחלוטין את הבוכנה עד התאים נראים הבלטת ממד דרך נקבוביות רשת. לאחר מכן משוך את הבוכנה למעלה כ 2.5 ס מ ולחץ שוב לחלוטין; חזור על התהליך מספר פעמים עד שהפתרון הזמני הופך להיות מבולבל.
   6. במקרה הצורך, המדגם עשוי להיות מרוכז כדי להגדיל את צפיפות התא על ידי צנטריפוגה בקירור עבור 5 דקות ב 1100 סל ד והסרה של חלק supernatant.
   7. חזור על התהליך עבור כל הדגימות באמצעות מכשיר ניקוי רקמות נקי עבור כל דוגמה.
3. העבר 50 μL של השעיית התא לצינור המכיל 450 μL של 0.5% נקודת התכה נמוכה agarose ב-37 ° c.
   הערה: ניתן לכוונן אמצעי אחסון, אך כמות האגבה צריכה להיות ≤ 1%.
4. להכין ולהבקיע שקופיות כמתואר בעבר^10,11.

תוצאות

מחקר 1
הכבד נקצרו משני גדודים של עכברושים גבריים מנוהלים בשמן תירס במשך 4 ימים, התנודדו בשבוע אחד. השקופיות היו מוכנות מרקמות טריות, מרקמות קפואות ומוקפאות, ורקמת העור הקפואה המעובדת בתמיסה המדיום של הסוחר או בשימוש במכשיר הרקמות. רקמות קפואות שהתקבלו מבעלי חיים מן הקבוצה הראשונ...

Discussion

כפי שמתואר בעבר^7,12,13, מטופלים כראוי פלאש קפוא ברקמות בשר טחון מספק תוצאות טובות שיטת שביט. למעשה, בסיסית% הזנב ערכי ה-DNA עבור עכברוש קצוץ וכבד העכבר המוכן במעבדה שלנו הם בדרך כלל ≤ 6%, כפי שמומלץ על-ידי מבחן ה-OECD מנחה⁹ עבור טרי דגי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryovials	Corning Costar	430488
Dental Wax Sheets	Electron Microscopy Sciences	72670
Dissecting (Mincing) Micro Scissors	Fisher Scientific	08-953-1B
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175-079
KCl	Teknova	P0315-10
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791
Low Melting Point Agarose	Lonza	50081
Microfuge Tubes (1.7 mL )	Corning	3207
Na2EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
Neutral Buffered Formalin	Leica	600
Scalpel Blades	Miltex	4-110
Syringe Plunger (1 mL )	Fisher Scientific or Vitality Medical	14-826-88; 8881901014	Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe
Tissue Mincing Device	NorGenoTech (Oslo, Norway)	None	Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger.
Tweezers, plastic	Trade Winds Direct	DF8088N	Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com
Weigh Boats	Krackler Scientific/Heathrow Scientific	6290-14251B