Uso di tessuto congelato nel saggio Cometa per la valutazione del danno del DNA

Riepilogo

Questo protocollo descrive diverse procedure per la preparazione di campioni di tessuto congelato di alta qualità al momento della necroscopia per l'uso nel saggio della cometa per valutare il danno al DNA: 1) tessuto macinato, 2) cellule epiteliali raschiate dal tratto gastrointestinale e 3) tessuto immatolato campioni, richiedendo l'omogeneizzazione utilizzando un dispositivo di mincing dei tessuti.

Abstract

L'analisi della cometa sta guadagnando popolarità come mezzo per valutare il danno del DNA nelle cellule e nei tessuti coltivati, in particolare dopo l'esposizione a sostanze chimiche o altri fattori di stress ambientali. L'uso del saggio della cometa nei test normativi per il potenziale genotossico nei roditori è stato guidato dall'adozione di una linea guida di prova dell'Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE) nel 2014. Cometa sdolcino i vetrini sono tipicamente preparati da tessuto fresco al momento della necropsia; tuttavia, il congelamento dei campioni di tessuto può evitare le sfide logistiche associate alla preparazione simultanea di vetrini da più organi per animale e da molti animali per studio. Il congelamento consente inoltre la spedizione di campioni dall'impianto di esposizione a un altro laboratorio per l'analisi, e lo stoccaggio di tessuto congelato facilita il rinvio della decisione di generare dati sui danni al DNA per un determinato organo. Il saggio di cometa alcalina è utile per rilevare le rotture del DNA a doppio e singolo filamento correlate all'esposizione, le lesioni alcali-labile e le rotture del filamento associate alla riparazione incompleta dell'escissione del DNA. Tuttavia, il danno al DNA può anche derivare da una tosatura meccanica o da procedure di elaborazione del campione improprie, confondendo i risultati del test. La riproducibilità nella raccolta e nella lavorazione di campioni di tessuto durante le necroscopia può essere difficile da controllare a causa della fluttuazione del personale di laboratorio con diversi livelli di esperienza nella raccolta dei tessuti per il saggio della cometa. Migliorare la coerenza attraverso la formazione di aggiornamento o l'impiego di unità mobili con personale di laboratorio esperto è costoso e potrebbe non essere sempre fattibile. Per ottimizzare la generazione coerente di campioni di alta qualità per l'analisi del saggio della cometa, è stato valutato un metodo per omogeneizzare i cubi congelati flash di tessuto utilizzando un dispositivo di mincing dei tessuti personalizzato. I campioni preparati per il test della cometa con questo metodo sono stati confrontati favorevolmente in termini di qualità a campioni di tessuto fresco e congelato preparati dalla maciazione durante la necropsia. Inoltre, il basso danno del DNA di base è stato misurato in cellule da cubetti congelati di tessuto dopo un accumulo prolungato.

Introduzione

Il test della cometa è sempre più usato come mezzo per valutare il danno del DNA nelle cellule coltivate e nei tessuti esposti a sostanze chimiche o altri fattori di stress ambientali¹. L'analisi è in grado di rilevare rotture a doppio e singolo filamento del DNA, lesioni alcali-labili e rotture a singolo filamento associate alla riparazione incompleta del DNA. L'International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) guideline for Pharmaceutical testing raccomanda una rottura del filamento di DNA, come il saggio della cometa come secondo test per integrare il micronucleo eritrocite del roditore per la valutazione della genotossicità in vivo e come test di follow-up per valutare la modalità di azione degli organi nel bersaglio di induzione tumorale². L'Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA) raccomanda il test della cometa in vivo come test di follow-up adeguato per studiare la pertinenza di un risultato positivo in un test di genotossicità in vitro³. Nel 2014 è stata approvata una linea guida per i test dell'OCSE per il test della cometa sui roditori, aumentando così l'accettabilità del saggio da utilizzare nei test normativi del potenziale genotossico. Il saggio si basa sulla separazione elettroforetica di loop di DNA rilassati e frammenti che migrano dai nucleoidi delle cellule lisci. Fondamentalmente, singole cellule sono incorporate in agarose che è stato stratificato su vetrini al microscopio. I vetrini vengono poi immersi nel buffer di lisi seguita da una soluzione alcalina (pH > 13), che consente al DNA nucleare strettamente arrotolato di rilassarsi e rilassarsi. Le diapositive vengono poi collocate in un campo elettrico, che stimola la migrazione del DNA caricato negativamente verso l'anodo, creando immagini che assomigliano alle comete; la quantità relativa di DNA nella coda della cometa rispetto alla testa della cometa è direttamente proporzionale alla quantità di danno del DNA; Il contenuto di DNA nella coda viene in genere quantificato utilizzando un software di imaging digitale.

Poiché il saggio della cometa rileva il DNA frammentato, la quantificazione accurata del danno del DNA indotto dall'esposizione può essere confusa dalla frammentazione della cromatina associata alla necrosi o all'apoptosi derivante dalla citotossicità o dallo stress indotta dal trattamento. Inoltre, il danno al DNA può verificarsi a causa di tosatura meccanica o elaborazione impropria del campione⁴. L'importanza di mantenere il tessuto raccolto raffreddato prima della preparazione dello scivolo per ridurre al minimo il livello di base del danno al DNA è stata precedentemente dimostrata^5,6. Molti laboratori preparano scivoli di assaggio cometa da tessuti freschi; tuttavia, questo può essere logisticamente impegnativo quando si preparano diapositive da più tipi di tessuto per animale in uno studio con un gran numero di animali. Inoltre, questo presenta un problema quando la preparazione e l'analisi delle diapositive devono avvenire in un laboratorio remoto, che richiede la spedizione di campioni. Ad esempio, il National Toxicology Program degli Stati Uniti include il saggio della cometa come componente del suo programma di test di tossicologia genetica (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) e talvolta incorpora il saggio in studi di tossicità a dose ripetuta di 28 o 90 giorni; ciò richiede la raccolta di tessuti da parte del laboratorio in vita e il trasferimento di campioni in un altro laboratorio per l'analisi. Per raggiungere questo obiettivo, i pezzi di tessuto vengono macinati e/o le cellule epiteliali del tratto gastrointestinale vengono raschiate e le sospensioni cellulari vengono congelate flash e conservate in un congelatore per la successiva spedizione e conservazione da parte del laboratorio ricevente fino all'analisi⁷. Una corretta gestione dei campioni è fondamentale per ottenere dati di alta qualità utilizzando tessuti congelati; tuttavia, la manipolazione riproducibile di campioni di tessuto durante le necropsie eseguite da personale in continua evoluzione è difficile da controllare, soprattutto nei laboratori in vita che non raccolgono regolarmente tessuti per il saggio della cometa. La formazione di aggiornamento del personale necropy o l'uso di un'unità mobile composta da personale di laboratorio esperto per raccogliere campioni di tessuto freschi o congelati è spesso troppo costosa, non fattibile o semplicemente sottovalutata.

Per garantire una migliore generazione coerente di campioni di tessuto di alta qualità per il trasferimento in un sito remoto per l'analisi del test della cometa, è stata esplorata l'utilità di un metodo pubblicato⁶ di conservazione dei tessuti da cubi di tessuto congelati flash. In questo metodo, i cubetti di tessuto congelati vengono caricati in un dispositivo di mintura del tessuto in acciaio inossidabile (Figura 1) che viene collocato in un tubo di microcentrifuga contenente tampone freddo. Il cubo di tessuto viene quindi spinto attraverso una piccola rete di calibro alla fine del dispositivo. Forzando ripetutamente la sospensione del tessuto attraverso il setaccio di maglia in entrambe le direzioni più volte si traduce in una sospensione a cella singola relativamente uniforme. I campioni preparati con questo metodo confrontano favorevolmente la qualità acampioni di tessuto fresco e congelato preparati mediante la macidia. Come ulteriore vantaggio, a differenza dei campioni macinati, i cubi di tessuto possono essere conservati congelati per periodi prolungati di tempo e ancora producono risultati di alta qualità nel saggio della cometa.

Protocollo

I tessuti sono stati raccolti durante lo svolgimento di studi effettuati presso impianti accreditati Da AALAC presso i laboratori contrattuali NTP in conformità con le norme sulla buona pratica di laboratorio (21 CFR Part 58) e i protocolli di utilizzo degli animali approvati dall'Institutional Animal Comitato per la cura e l'uso (IACUC) in ogni laboratorio.

1. Raccolta e lavorazione dei tessuti

NOT: È utile preparare tubi campione duplicati (ad esempio, fegato) o trasferire circa la metà di un campione in un altro tubo di stoccaggio (ad esempio, duodenum, stomaco) per consentire la rianalisi, se necessario. Per ridurre al minimo la potenziale variabilità campione-campione per i tessuti del tratto intestinale, si raccomanda di prelevare la stessa regione di tessuto rispetto allo stomaco per ogni animale e di dividere un campione per generare campioni duplicati. I pinze plastiche sono raccomandati per il trasferimento di tessuti appiccicosi come il cervello. Come opzione, i preparati di tessuto macinati, raschiati o omogeneizzati possono essere filtrati per ottenere sospensioni omogenee a singola cellula utilizzando un colino a cellule da 40 m attaccato ad un tubo conico.

1. Rimuovere qualsiasi tessuto di collegamento collegato, organi e detriti dagli organi di interesse. Immediatamente dopo la rimozione, swish l'organo vigorosamente in una barca di pesatura di medie dimensioni contenente 7 mL di fredda soluzione di macinazione appena preparata (Mg^,Ca , e fenolo rosso-libero Hank's Up, 10% v / v DMSO, e 20 mM EDTA pH 7.5) per rimuovere il sangue residuo e detriti.
2. Trasferire ogni organo in un'altra barca a pesatura pulita contenente una soluzione di mintura fredda sufficiente (7 mL) per mantenere il tessuto immerso, sul ghiaccio, fino a un'ulteriore elaborazione.
3. Rimuovere una sezione di ogni organo di interesse e inserirla in una cassetta di incorporamento. Fissare il 10% di formalina, trim e paraffina neutra secondo le procedure standard del laboratorio per una possibile futura valutazione dell'istopatologia.
4. Per il fegato, tagliare una sezione longitudinale di 5 mm del lobo sinistro e swish delicatamente in 7 mL di soluzione di mincing freddo. Posizionare la striscia di tessuto in una barca di pesatura di medie dimensioni pulita contenente 7 mL di soluzione di mincing freddo e mantenere sul ghiaccio fino a quando pronto per il processo ulteriormente (passaggio 1.8 o 1.11).
5. Per il duodenum, tagliare una porzione di 10 mm del duodenum proximal allo stomaco. Utilizzando un ago 21–25 G, lavare per rimuovere detriti e batteri.
   1. Inserire l'ago in un'estremità del duodenum e sciacquare con 1 mL di soluzione di mincing freddo.
   2. Svuotare l'altra direzione capovolgendo il duodenum e ripetendo con un altro 1 mL di soluzione di mincing. Scartare l'ago.
   3. Affettare il duodenum aprire e risciacquarlo in soluzione di mincing di 7 ml prima di metterlo in un pescheresta di medie dimensioni contenente 7 mL di soluzione di mincing pulito; mantenere il ghiaccio fino a quando non è pronto per essere ulteriormente processato (passaggio 1.8 o 1.11).
6. Per il cervello, può essere utile prima dividere il cervello in due emisferi; un emisfero può essere salvato per una possibile istopatologia (vedi passo 1.2).
   1. Dissezionare le regioni del cervello di interesse e delicatamente swish in 7 mL di soluzione di mincing freddo.
   2. Trasferire i tessuti a una barca di pesatura di medie dimensioni pulita contenente 7 mL di soluzione di macisatura fredda e mantenerla sul ghiaccio fino a quando non è pronta per essere ulteriormente lavorata (passaggio 1.8 o 1.11; si noti che piccole regioni come il cervelletto e l'ippocampo potrebbero non richiedere ulteriori tagli).
7. Per lo stomaco
   1. Rimuovere e scartare la parte della prua. Tagliare lo stomaco ghiandolare e lavare senza cibo utilizzando 7 mL di tampone di mincing freddo in una barca di peso di medie dimensioni.
   2. Rimuovere una striscia di 5 mm di stomaco ghiandolare prossimale al duodenum per la fissazione per una possibile valutazione istopatologica (vedere il passaggio 1.2).
   3. Collocare lo stomaco rimanente in 7 mL di tampone di mintura fredda in una barca di pesatura di medie dimensioni e incubare sul ghiaccio per 15-30 minuti.
      NOT: Questa fase di incubazione potrebbe non essere necessaria; questo passaggio è stato incluso nel protocollo di convalida JaCVAM, ma non è menzionato nelle linee guida del test dell'OCSE^8,9.
   4. Trasferire lo stomaco in un pezzo pulito di paraffina (o parabola Petri o pescherezza barca) e raschiare delicatamente l'epitelio superficiale due o più volte utilizzando una lama bisturi o un raschietto politetrafluoreee (PTFE) per rimuovere i detriti. Raccogliere la mucosa gastrica con pinze e risciacquare con 1 mL di tampone di mincing freddo utilizzando un pipet. Trasferire il tessuto dello stomaco su una superficie o un piatto pulito.
   5. Raschiare con cura l'epitelio dello stomaco 4-5 volte (più se necessario) in soluzione di macinocing (tipicamente 250 l/topi o 500-1.000 l/ratto) con la parte posteriore di una lama bisturio o raschietto PTFE per rilasciare le cellule. Facoltativamente, risciacquare il tessuto con un volume approssimativamente uguale di soluzione di mincing per recuperare più cellule. Raccogliere la soluzione di macisatura contenente le cellule rilasciate utilizzando un pipet e trasferire in un tubo di microcentrifuga sul ghiaccio.
8. Per i campioni di tessuto di mincing, tagliare una sezione di 3-4 mm di tessuto epatico o cerebrale o 5 mm di duodenum e trasferirlo in un tubo di microcentrismo da 1,5 o 2,0 mL etichettato contenente 1 mL di soluzione di mincing freddo. Trita rapidamente (30 s) con forbici macistrate fino a disperdersi finemente, mantenendo il campione freddo. Il campione dovrebbe apparire leggermente torbida; tuttavia, è comune per alcuni pezzi di rimanere che si stabilirà sul fondo del tubo.
9. Per utilizzare il tessuto fresco, mantenere tubi contenenti tessuto macinato o cellule epiteliali raschiate sul ghiaccio; utilizzare il tessuto per preparare i vetrini delle comete entro circa 1 h di raccolta (delineati nella sezione 2).
10. Per il congelamento dei campioni di tessuto, subito dopo la mintura o la raccolta di cellule epiteliali raschiate
    1. Fissare il coperchio del tubo e far cadere il tubo in una fiaschetta Dewar contenente azoto liquido; i tubi possono essere mantenuti in azoto liquido per tutta la durata della necropsia (3 h).
    2. Recuperare i tubi utilizzando un mestolo e mettere sul ghiaccio secco per ordinare. Trasferire i tubi in una scatola congelante su ghiaccio secco e conservare in un congelatore -80 gradi centigradi.
11. Per preparare cubetti di tessuto congelati, tagliare diversi piccoli pezzi di tessuto (4 mm di diametro e 6 mm di lunghezza; Figura 1).
    1. Li lasci direttamente su una barca di pesatura di medie dimensioni o in un altro recipiente adatto contenente azoto liquido.
    2. Attendere qualche secondo che i pezzi si congelino completamente e trasferiscano singoli cubetti di tessuto congelato in un tubo di microcentrifuga etichettato o criotubo mantenuto su ghiaccio secco; non permettere che i pezzi si aggregano durante il processo di congelamento.
    3. Trasferire i tubi in una scatola congelante su ghiaccio secco e conservare in un congelatore -80 gradi centigradi.

2. Preparazione del vetrino

1. Per tessuto macinato/graffiato
   1. Mantenere i tubi contenenti tessuti freschi sul ghiaccio bagnato.
   2. Mettere i tubi di tessuto congelato in un bagno d'acqua a temperatura ambiente fino a quando i campioni sono completamente scongelati, garantendo al contempo che siano mantenuti freddi. Trasferire immediatamente i tubi sul ghiaccio.
   3. Immediatamente prima di ritirare le celle per il trasferimento in agarose (passaggio 2.3), mescolare ogni sospensione cellulare delicatamente; per i campioni non filtrati, lasciare che grandi pezzi si depositino sul fondo del tubo. Mantenere tutti i tubi sul ghiaccio fino a quando i vetrini sono stati preparati per tutti i campioni.
2. Per tessuti a cubetti
   1. Recuperare i tubi contenenti cubetti di tessuto dal congelatore a 80 gradi e mantenerli sul ghiaccio secco fino alla preparazione del vetrino.
   2. Aliquota 1 mL del mezzo del commerciante (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH₂PO₄, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 10 mM NaEDTA, pH 7.4) o soluzione di macineria in un tubo di microcentrismo da 1,7 ml etichettato per ogni campione e mantenimento sul ghiaccio.
   3. Lavorando rapidamente per evitare lo scongelamento dei tessuti, inserire un cubo di tessutoFigure 1nell'estremità aperta di un dispositivo di maci; Possono essere utilizzati più pezzi di tessuto; se necessario, il tessuto congelato può essere tagliato o incrinato in pezzi più piccoli utilizzando un mortaio freddo e pestello per ridurre la dimensione del cubo per adattarsi al dispositivo.
   4. Inserire rapidamente uno stantuffo di siringa abbinato alle dimensioni nel dispositivo per spingere il tessuto verso l'estremità della rete che deve poi essere collocato nel tubo di microcentrifuga contenente soluzione di maciiniera fredda; evitare di forzare il liquido a traboccare il tubo. Immergere l'estremità della rete del dispositivo per circa 5-10 s nella soluzione di maciazione fredda per consentire al tessuto di scongelarsi completamente.
   5. Deprimere completamente lo stantuffo fino a quando le cellule non vengono viste estruso attraverso i pori della maglia. Quindi tirare lo stantuffo di circa 2,5 cm e premere di nuovo verso il basso completamente; ripetere il processo più volte fino a quando la soluzione di maciètura diventa torbida.
   6. Se necessario, il campione può essere concentrato per aumentare la densità cellulare mediante centrifugazione refrigerata per 5 min a 1100 giri/m e la rimozione di una porzione del supernatante.
   7. Ripetere il processo per tutti i campioni utilizzando un dispositivo di macino di tessuto pulito per ogni campione.
3. Trasferire 50 - L di sospensione cellulare su un tubo contenente 450 gradi L dello 0,5% di aga roseo a 37 gradi centigradi.
   NOT: I volumi possono essere rettificati, ma l'importo di agarose dovrebbe essere pari all'1%.
4. Preparare e segnare diapositive come descritto in precedenza^10,11.

Risultati

Studio 1
Il fegato è stato raccolto da due coorti di ratti Maschi Sprague Dawley somministrato olio di mais per 4 giorni, sfalsati da una settimana. I vetrini sono stati preparati da tessuto appena macinato, tessuto macinato congelato e tessuto a cubetti congelato lavorato nella soluzione media o di maciazione del tessuto utilizzando il dispositivo di maci; I tessuti congelati ottenuti da animali della prima coorte sono stati valutati dopo lo stoccaggio del congelatore per 3,5 mesi. I tessuti congela...

Discussione

Come dimostrato in precedenza^7,12,13, correttamente gestito flash tessuto macinato congelato fornisce buoni risultati nel test cometa. Infatti, i valori del DNA della coda % di base per il ratto macinato congelato e il fegato di topo preparati nel nostro laboratorio sono in genere ,6%, come raccomandato dalla guida del test dell'OCSE⁹ per campioni di fegato di ratto appena macinato. Buoni risultati sono s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryovials	Corning Costar	430488
Dental Wax Sheets	Electron Microscopy Sciences	72670
Dissecting (Mincing) Micro Scissors	Fisher Scientific	08-953-1B
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175-079
KCl	Teknova	P0315-10
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791
Low Melting Point Agarose	Lonza	50081
Microfuge Tubes (1.7 mL )	Corning	3207
Na2EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
Neutral Buffered Formalin	Leica	600
Scalpel Blades	Miltex	4-110
Syringe Plunger (1 mL )	Fisher Scientific or Vitality Medical	14-826-88; 8881901014	Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe
Tissue Mincing Device	NorGenoTech (Oslo, Norway)	None	Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger.
Tweezers, plastic	Trade Winds Direct	DF8088N	Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com
Weigh Boats	Krackler Scientific/Heathrow Scientific	6290-14251B