DNA Hasarının Değerlendirilmesinde Kuyruklu Yıldız Testinde Donmuş Dokunun Kullanımı

Özet

Bu protokol, DNA hasarı değerlendirmek için kuyruklu yıldız testinde kullanılmak üzere nekropsi sırasında yüksek kaliteli dondurulmuş doku örnekleri hazırlamak için çeşitli prosedürler açıklar: 1) kıyılmış doku, 2) gastrointestinal sistemden kazınmış epitel hücreleri, ve 3) küp doku bir doku kıyma cihazı kullanarak homojenizasyon gerektiren örnekler.

Özet

Kuyruklu yıldız tsay, özellikle kimyasallara veya diğer çevresel strese maruz kaldıktan sonra, kültürlü hücre ve dokularda DNA hasarını değerlendirmek için bir araç olarak popülerlik kazanıyor. Kemirgenlerdeki genotoksik potansiyel için yapılan düzenleyici testlerde kuyruklu yıldız titrelerinin kullanımı, 2014 yılında Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü (OECD) test kılavuzunun benimsenmesi ile yürütülmüştür. Kuyruklu yıldız asa slaytları genellikle nekropsi sırasında taze dokudan hazırlanır; ancak, dondurucu doku örnekleri hayvan başına birden fazla organdan ve çalışma başına birçok hayvandan slaytların eşzamanlı hazırlanması ile ilişkili lojistik zorlukları önleyebilir. Donma aynı zamanda maruz kalma tesisinden analiz için farklı bir laboratuvara numune lerin sevkiyatını sağlar ve dondurulmuş dokunun depolanması, belirli bir organ için DNA hasar verileri oluşturma kararının ertelenmesini kolaylaştırır. Alkali kuyruklu yıldız testi, pozlamaya bağlı DNA çift ve tek iplikçikli kırıkları, alkali-labile lezyonlarını ve eksik DNA eksizyonu onarımı ile ilişkili iplikçik kırıklarını tespit etmek için yararlıdır. Ancak, DNA hasarı da mekanik kesme veya yanlış numune işleme prosedürleri, tahsin sonuçları kafa karıştırıcı neden olabilir. Nekropsiler sırasında doku örneklerinin toplanması ve işlenmesinde tekrarlanabilirlik, kuyruklu yıldız tadına göre dokuların hasat edilmesinde farklı düzeyde deneyime sahip laboratuvar personelinin dalgalanması nedeniyle kontrol edilmesi zor olabilir. Deneyimli laboratuvar personeliyle çalışan tazeleme eğitimi veya mobil ünitelerin konuşlandırılması yoluyla tutarlılığın artırılması maliyetlidir ve her zaman mümkün olmayabilir. Kuyruklu yıldız tahlil analizi için yüksek kaliteli örneklerin tutarlı nesil optimize etmek için, özelleştirilmiş doku kıyma cihazı kullanarak doku flaş dondurulmuş küpleri homojenleştirme için bir yöntem değerlendirildi. Bu yöntemle kuyruklu yıldız tadına göre hazırlanan numuneler, nekropsi sırasında kıyma ile hazırlanan taze ve dondurulmuş doku örnekleriile kalite açısından olumlu karşılaştırılabı. Ayrıca, uzun süreli depolandıktan sonra dondurulmuş doku küplerinden hücrelerde düşük bazsatır DNA hasarı ölçüldü.

Giriş

Kuyruklu yıldız tsay giderek kimyasallar veya diğer çevresel stres 1 maruz kültürlü hücre ve dokularda DNA hasarı değerlendirmek için bir araç olarak^{kullanılır.} Titrek, DNA çift ve tek iplikçikli sonları, alkali-labile lezyonlarını ve eksik DNA onarımı ile ilişkili tek iplikçikli sonları tespit edebilir. Farmasötik testler için Farmasötik Ürünler için Teknik Gerekliliklerin Uyumlaştırılması Uluslararası Konseyi (ICH) farmasötik testler için kılavuz, kemirgen eritrosit mikronükleus testini sağlamak için ikinci bir test olarak kuyruklu yıldız testi gibi bir DNA iplikçik kırılması testi önerir ve tümör indüksiyonu hedef organlarında eylem modunu değerlendirmek için bir takip testi^{olarak 2}. Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi (EFSA) in vivo kuyruklu yıldız testi bir in vitro genotoksisite testi olumlu bir sonucun alaka araştırmak için uygun bir takip testi olarak önerir³. 2014 yılında, kemirgen kuyruklu yıldız testi için bir OECD test kılavuzu onaylanarak, genotoksik potansiyelin düzenleyici testlerinde kullanılmak üzere testin kabul edilebilirliği artırıldı. Test, sakinleştirilmiş DNA döngüleri ve lized hücrelerin çekirdeklerinden göç eden parçaların elektroforetik olarak ayrılmasına dayanır. Temel olarak, tek hücreler mikroskop slaytlar üzerine katmanlı olmuştur agarose gömülüdür. Slaytlar daha sonra bir alkalin (pH > 13) çözeltisi, sıkıca sarılmış nükleer DNA dinlenmek ve gevşemek için izin veren bir lysis tampon batırılır. Slaytlar daha sonra bir elektrik alanına yerleştirilir, bu da negatif yüklü DNA'nın atota doğru göçüne neden olur ve kuyruklu yıldıza benzeyen görüntüler oluşturur; kuyruklu yıldız kuyruğundaki göreceli DNA miktarı, kuyruklu yıldız kafasıyla karşılaştırıldığında DNA hasarının miktarıyla doğru orantılıdır; Kuyruktaki DNA içeriği genellikle dijital görüntüleme yazılımı kullanılarak ölçülür.

Kuyruklu yıldız testi parçalanmış DNA'yı algıladığı için, maruziyete bağlı DNA hasarının doğru niceliği, tedaviye bağlı sitotoksisite veya stresten kaynaklanan nekroz veya apoptozla ilişkili kromatin parçalanması yla şaşırtılabilir. Ayrıca, DNA hasarı mekanik kesme veya yanlış numune^işleme4 sonucu oluşabilir. Dna hasarının temel düzeyini en aza indirmek için slayt hazırlama öncesinde soğutulmuş hasat doku bakımının önemi daha önce gösterilmiştir^5,6. Birçok laboratuvar taze dokudan kuyruklu yıldız adaçayı slaytları hazırlar; ancak, bu çok sayıda hayvan ile yapılan bir çalışmada hayvan başına birden fazla doku türünden slaytlar hazırlarken lojistik zor olabilir. Ayrıca, bu durum, uzak bir laboratuvarda slayt hazırlama ve analizlerin yapılacağı ve numunelerin sevkiyatının gerekli olduğu bir sorun teşkil ediyor. Örneğin, ABD Ulusal Toksikoloji Programı, genetik toksikoloji test programının bir bileşeni olarak kuyruklu yıldız tökezlemeyi içerir (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) ve bazen 28 veya 90 gün tekrar doz toksisite çalışmaları içine test içerir; bu, dokuların yaşam içi laboratuvar tarafından toplanmasını ve numunelerin analiz için başka bir laboratuvara aktarılmasını gerektirir. Bunu başarmak için, doku parçaları kıyılmış ve / veya gastrointestinal sistem epitel hücreleri kazınmış ve hücresel süspansiyonlar dondurulmuş ve analiz⁷kadar alıcı laboratuvar tarafından sonraki sevkiyat ve depolama için bir dondurucuda saklanır . Numunelerin doğru şekilde işlenmesi, dondurulmuş doku kullanılarak yüksek kaliteli veri elde edilmesi için çok önemlidir; ancak, sürekli değişen personel tarafından gerçekleştirilen nekropsiler sırasında doku örneklerinin tekrarlanabilir manipülasyonu kontrol etmek zordur, özellikle kuyruklu yıldız tayı için rutin olarak doku hasat olmayan yaşam laboratuvarlarında. Nekropsi personelinin tazelemesi eğitimi veya deneyimli laboratuvar personeli tarafından taze veya dondurulmuş doku örnekleri toplamak için personele ait bir mobil ünitenin kullanımı genellikle çok maliyetlidir, mümkün değildir veya sadece küçümsenmez.

Kuyruklu yıldız tahlil analizi için uzak bir bölgeye transfer için yüksek kaliteli doku örnekleritutarlı nesil sağlamak için, doku flash dondurulmuş küpleri doku koruma yayınlanan bir yöntem⁶ programı araştırıldı. Bu yöntemde, dondurulmuş doku küpleri, soğuk tampon içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilen paslanmaz çelik doku kıyma cihazına(Şekil 1)yüklenir. Doku küpü daha sonra cihazın sonunda küçük bir ölçer örgü ile itilir. Tekrar tekrar her iki yönde de örgü elek yoluyla doku süspansiyon zorlayarak nispeten düzgün tek hücreli süspansiyon ile sonuçlanır. Bu yöntemle hazırlanan numuneler, kalite olarak hem taze hem de dondurulmuş doku örnekleri ile karşılaştırıldı. Ek bir yararı olarak, kıyma örnekleri aksine, doku küpleri uzun süre dondurulmuş saklanabilir ve hala kuyruklu yıldız tahsini yüksek kaliteli sonuçlar verim.

Protokol

Dokular, İyi Laboratuvar Uygulamaları yönetmelikleri (21 CFR Bölüm 58) ve Kurumsal Hayvan tarafından onaylanan hayvan kullanım protokolleri uyarınca NTP sözleşme laboratuvarlarında AAALAC akredite tesislerde yapılan çalışmaların yürütülmesi sırasında hasat edildi Her laboratuvarda Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC).

1. Doku Hasat ve İşleme

NOT: Gerekirse yeniden analiz yapabilmek için yinelenen numune tüplerinin (örn. karaciğer) hazırlanması veya numunenin yaklaşık yarısının başka bir depolama tüpüne (örn. duodenum, mide) aktarılması yararlıdır. Bağırsak sistemi dokuları için olası numuneden numuneye değişkenliği en aza indirmek için, her hayvan için mideye göre aynı doku bölgesinin örnekalınmasına özen gösterilmelidir ve bir örnek çoğaltılabilir numuneler oluşturmak üzere bölünür. Plastik forseps beyin gibi yapışkan dokuların transferi için tavsiye edilir. Bir seçenek olarak, konik bir tüpe bağlı 40 μm hücreli süzgeç kullanılarak homojen tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için kıyma, kazınmış veya homojen doku preparatları filtrelenebilir.

1. Herhangi bir bağlı bağlı doku, organ ve enkaz kaldırın organ (lar) ilgi. Çıkarıldıktan hemen sonra, kalan kan ve enkazkaldırmak için ,7 mL soğuk taze hazırlanmış kıyma çözeltisi (Mg⁺⁺, Ca⁺⁺ ve fenol kırmızısız Hank's Balanced Salt Solution, 10% v/v DMSO ve 20 mM EDTA pH 7.5) içeren orta büyüklükte bir tartım teknesinde organı şiddetle swish.
2. Her organı, daha fazla işleme yapılına kadar, dokuların buz üzerinde, buzun altında tutmak için yeterli (~7 mL) soğuk kıyma solüsyonu içeren başka bir temiz tartı teknesine aktarın.
3. İlgi çeken her organın bir bölümünü çıkarın ve katıştırma kasetine yerleştirin. Gelecekteki histopatoloji değerlendirmesi için laboratuvarın standart prosedürlerine göre %10 nötr tamponlu formalin, trim ve parafin ilerler.
4. Karaciğer için sol lobun 5 mm boyuna kısmını kesin ve ~7 mL soğuk kıyma çözeltisinde hafifçe swish. Doku şeridini ~ 7 mL soğuk kıyma çözeltisi içeren temiz bir orta boy tartım teknesine yerleştirin ve daha fazla işlemeye hazır olana kadar buz üzerinde bakım ını yapın (adım 1.8 veya 1.11).
5. Duodenum için, mideye duodenum proksimal 10 mm kısmını kesti. 21-25 G iğne kullanarak, enkaz ve bakterileri temizlemek için floş.
   1. İğneyi duodenumun bir ucuna yerleştirin ve 1 mL soğuk kıyma çözeltisi ile yıkayın.
   2. Duodenumu ters çevirerek ve 1 mL kıyma çözeltisi ile tekrarlayarak diğer yönü temizleyin. İğneyi at.
   3. Duodenumu açık dilimleyin ve ~7 mL kıyma çözeltisi içeren orta boy bir tartım teknesine koymadan önce kıyma çözeltisinin ~7 mL'sinde durulayın; daha fazla işlemeye hazır olana kadar buzüzerinde muhafaza edin (adım 1.8 veya 1.11).
6. Beyin için, ilk iki yarımküreye beyin bölmek için yararlı olabilir; bir yarımküre olası histopatoloji için kaydedilebilir (bkz. adım 1.2).
   1. İlgi beyin bölgesi (ler) diseksiyon ve yavaşça soğuk kıyma çözeltisi ~ 7 mL swish.
   2. Doku(lar) ~7 mL soğuk kıyma çözeltisi içeren temiz bir orta boy tartım teknesine aktarın ve daha fazla işlemeye hazır olana kadar buzüzerinde bakım ını yapın (adım 1.8 veya 1.11; beyincik ve hipokampus gibi küçük bölgelerin daha fazla budama gerektirmeyebileceğini unutmayın).
7. Mide için
   1. Ön mideyi çıkarın ve atın. Glandüler mideyi kesin ve orta büyüklükteki bir tartı teknesinde ~7 mL soğuk kıyma tamponu kullanarak gıdalardan arınarak yıkanın.
   2. Olası histopatoloji değerlendirmesi için fiksasyon için duodenuma 5 mm'lik salgı bezi mide proksimal şeridini çıkarın (bkz. adım 1.2).
   3. Kalan mideyi orta boy bir tartı teknesinde soğuk kıyma tamponunun ~7 mL'sine yerleştirin ve 15-30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
      NOT: Bu kuluçka adımı gerekli olmayabilir; Bu adım JaCVAM doğrulama protokolüne dahil edildi, ancak OECD test^{kılavuzunda belirtilmemiştir 8,9}.
   4. Mideyi temiz bir parafin parçasına (veya Petri kabına veya tartı teknesine) aktarın ve enkazları temizlemek için neşter bıçağı veya politetetraflorotenen (PTFE) kazıyıcı kullanarak yüzey epitelini iki veya daha fazla kez kazıyın. Bir pipet kullanarak 1 mL soğuk kıyma tamponu ile forceps ve durulamak ile gastrik mukozayı almak. Mide dokusunu temiz bir yüzeye veya tabağa aktarın.
   5. Hücreleri serbest bırakmak için mide epitelini kıyma çözeltisinde (genellikle 250 μL/fare veya 500-1.000 μL/rat) 4-5 kez (gerekirse daha fazla) bir neşter bıçağının veya PTFE kazıyıcının arkasına kazıyın. İsteğe bağlı olarak, daha fazla hücre kurtarmak için kıyma çözeltisi yaklaşık eşit hacimli doku durulayın. Bir pipet kullanarak serbest hücreleri içeren kıyma çözeltisi toplamak ve buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpü ne aktarım.
8. Doku örnekleri için, karaciğer veya beyin dokusunun 3-4 mm'lik bir bölümünü veya ~5 mm duodenum'u kesip 1 mL soğuk kıyma solüsyonu içeren 1,5 veya 2,0 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Numunesoğuk tutarken, ince dağılana kadar kıyma makası ile hızlı bir şekilde kıyma (≤30 s). Örnek biraz bulutlu görünmelidir; ancak, tüpün altına yerleşecek bazı parçaların kalması yaygındır.
9. Taze doku kullanmak için, buz üzerinde kıyılmış doku veya kazınmış epitel hücreleri içeren tüpler korumak; yaklaşık 1 saat hasat içinde kuyruklu yıldız slaytları hazırlamak için doku kullanın (bölüm 2'de özetlenmiştir).
10. Doku örneklerinin dondurulması için, kazınmış epitel hücrelerinin kıyma veya toplanmasından hemen sonra
    1. Tüp kapağını ve damla tüpünü sıvı nitrojen içeren bir Dewar şişesine sabitle; tüpler nekropsi (≤3 h) süresince sıvı nitrojende tutulabilir.
    2. Bir kepçe kullanarak tüpleri alın ve sıralamak için kuru buz üzerine yerleştirin. Tüpleri -80 °C'lik bir dondurucuda kuru buz ve saklama kutusuna aktarın.
11. Dondurulmuş doku küplerini hazırlamak için birkaç küçük doku parçası (≤4 mm çapında ve ~6 mm uzunluğunda; Şekil 1).
    1. Ayrı ayrı doğrudan orta ölçekli bir tartma tekne veya sıvı nitrojen içeren diğer uygun gemi içine bırakın.
    2. Parçaların tamamen donması ve tek tek dondurulmuş doku küplerini kuru buz üzerinde tutulan etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne veya kriyotube'a aktarması için birkaç saniye bekleyin; parçaların donma işlemi sırasında bir araya toplanmış olmasını izin vermez.
    3. Tüpleri -80 °C'lik bir dondurucuda kuru buz ve saklama kutusuna aktarın.

2. Slayt Hazırlama

1. Kıymalı/kazınmış dokular için
   1. Islı buz üzerinde taze dokular içeren tüpleri bakımını yapıtın.
   2. Dondurulmuş doku tüplerini, numuneler tamamen eriyene kadar oda sıcaklığındaki su banyosuna yerleştirin ve soğuk tutulmalarını sağlar. Tüpleri hemen buza aktarın.
   3. Agarose'a (adım 2.3) transfer için hücreleri geri çekmeden hemen önce, her hücresüspansiyonuna hafifçe karıştırın; filtrelenmemiş numuneler için, büyük parçaların tüpün altına yerleşmesine izin verin. Tüm numuneler için slaytlar hazırlanana kadar tüm tüpleri buzüzerinde saklayın.
2. Küplü doku için
   1. 80 °C'lik dondurucudan doku küpleri içeren tüpleri alın ve slayt hazırlanınceye kadar kuru buzüzerinde muhafaza edin.
   2. Aliquot 1 mL Merchant's orta (0.14 M NaCl, 1.47 mM KH₂PO₄, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na₂HPO₄, 10 mM NaEDTA, pH 7.4) veya miskasyon çözeltisi her örnek için etiketli 1,7 mL mikrosantrifüj tüp içine ve buz üzerinde korumak.
   3. Doku erimesini önlemek için hızla çalışarak, oda sıcaklığındaki doku kıyma cihazının açık ucuna bir doku küpü yerleştirin (Şekil 1). Birden fazla doku parçaları kullanılabilir; gerekirse, dondurulmuş doku kesilebilir veya cihaza sığacak şekilde küp boyutunu azaltmak için soğuk bir harç ve havaneli kullanarak küçük parçalara çatlayabilir.
   4. Hızlı bir şekilde daha sonra soğuk kıyma solüsyonu içeren mikrocentrifuge tüp içine yerleştirilmelidir örgü ucuna doku itmek için cihaza bir boyut uyumlu şırınga piston takın; sıvıyı tüpü nakışmaya zorlamaktan kaçının. Dokunun tamamen erimesini sağlamak için cihazın örgü ucunu soğuk kıyma çözeltisine yaklaşık 5-10 s kadar batırın.
   5. Hücreler örgü gözenekleri ile ekstrüzyon görülene kadar tamamen piston depress. Daha sonra pistonu yaklaşık 2,5 cm yukarı çekin ve tekrar tamamen bastırın; kıyma çözeltisi bulanık hale gelene kadar işlemi birkaç kez tekrarlayın.
   6. Gerekirse, örnek 1100 rpm 5 dakika için soğutulmuş santrifüj ve supernatant bir kısmını n için hücre yoğunluğunu artırmak için konsantre olabilir.
   7. Her örnek için temiz bir doku kıyma cihazı kullanarak tüm numuneler için işlemi tekrarlayın.
3. 37 °C'de %0,5 düşük erime noktası nın 450 μL'sini içeren bir tüpe 50 μL hücre süspansiyonu aktarın.
   NOT: Hacimler ayarlanabilir, ancak agarose miktarı ≤%1 olmalıdır.
4. Daha önce açıklandığı gibi slaytları hazırlayın ve puanlayın^10,11.

Sonuçlar

Çalışma 1
Karaciğer erkek Sprague Dawley sıçanlar iki kohorthas hasat edildi 4 gün boyunca mısır yağı uygulanan, bir hafta ile sendeledi. Slaytlar taze kıyılmış doku, dondurulmuş kıyma doku ve dondurulmuş küp doku Merchant'S orta veya kıyma çözeltisi doku kıyma cihazı kullanılarak işlenmiş hazırlanmıştır. İlk kohorttan hayvanlardan elde edilen dondurulmuş dokular yaklaşık 3,5 ay boyunca dondurucu muhafazasından sonra değerlendirildi. İkinci kohorttan hayvanlardan ...

Tartışmalar

Daha önce gösterildiği gibi^7,12,13, düzgün flaş dondurulmuş kıyma doku ele kuyruklu yıldız tahsiniyi iyi sonuçlar sağlar. Aslında, laboratuarımızda hazırlanan dondurulmuş kıyılmış sıçan ve fare karaciğeri için temel % kuyruk DNA değerleri, yeni kıyılmış fare karaciğeri örnekleri için OECD test rehberi⁹ tarafından tavsiye edilen genellikle ≤%6'dır. Dondurulmuş olarak d...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryovials	Corning Costar	430488
Dental Wax Sheets	Electron Microscopy Sciences	72670
Dissecting (Mincing) Micro Scissors	Fisher Scientific	08-953-1B
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175-079
KCl	Teknova	P0315-10
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791
Low Melting Point Agarose	Lonza	50081
Microfuge Tubes (1.7 mL)	Corning	3207
Na2EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
Neutral Buffered Formalin	Leica	600
Scalpel Blades	Miltex	4-110
Syringe Plunger (1 mL)	Fisher Scientific or Vitality Medical	14-826-88; 8881901014	Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe
Tissue Mincing Device	NorGenoTech (Oslo, Norway)	None	Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger.
Tweezers, plastic	Trade Winds Direct	DF8088N	Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com
Weigh Boats	Krackler Scientific/Heathrow Scientific	6290-14251B