Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويرد وصفها بروتوكولات لتحرير الجينوم عاليه الكفاءة من الجذعية التي تكون الدم murine والخلايا سلف (hspc) من قبل نظام crispr/كاس 9 لتطوير بسرعة أنظمه نموذج الماوس مع التعديلات الجينية الخاصة بالنظام التي تكون الدم.

Abstract

يمكن ان يكون التلاعب بالجينات في الخلايا الجذعية للدم باستخدام مقاربات التكوين التقليدية مضيعه للوقت ومكلفه وصعبه. الاستفادة من التقدم المحرز في تكنولوجيا تحرير الجينوم ونظم إيصال الجينات عبر اللينتيفيروس ، فان طريقه فعاله واقتصاديه توصف هنا بأنها تنشئ فئران يتم فيها التلاعب بالجينات علي وجه التحديد في الخلايا الجذعية للدم. وتستخدم لينتيفيروسيس لنقل كاس 9-التعبير عن خلايا نخاع العظم السالبة مع دليل RNA (gRNA) استهداف جينات محدده والجينات مراسل الأحمر الفلورية (المناقصة) ، ثم يتم زرع هذه الخلايا في قاتل المشع C57BL/6 الفئران. تستخدم الفئران المزروعة باللينتيفيروس التي تعبر عن عدم استهداف gRNA كعناصر تحكم. يتم تقييم الخلايا الجذعية التي يتم توصيلها بالدم من خلال تحليل تدفق الكريات البيضاء الايجابيه لعروض العروض الدموية للدم المحيطي. باستخدام هذه الطريقة ، ~ 90 ٪ محول الخلايا النخاعية و ~ 70 ٪ من الخلايا اللمفاوية في 4 أسابيع بعد زرع يمكن ان يتحقق. يتم عزل الحمض النووي الجيني من خلايا الدم الايجابيه لعروض العروض ، ويتم تضخيم أجزاء من الحمض النووي للموقع المستهدف من قبل PCR للتحقق من تحرير الجينوم. يوفر هذا البروتوكول تقييما عالي الانتاجيه للجينات التنظيمية للدم ويمكن توسيعه ليشمل مجموعه متنوعة من نماذج امراض الفئران مع مشاركه خلايا الدم.

Introduction

العديد من الدراسات في امراض الدم والمناعة تعتمد علي توافر الفئران المعدلة وراثيا, بما في ذلك التقليدية والشرطية الوراثية/ضرب الخروج الفئران التي تستخدم البرامج الغذائية الخاصة بنظام Cre السائقين مثل Mx1, Vav-Cre, وغيرها 1،2،3،4،5. وتتطلب هذه الاستراتيجيات إنشاء سلالات فاره جديده ، يمكن ان تستغرق وقتا طويلا وتثقل كاهل المالية. في حين ان التقدم الثوري في تكنولوجيا التحرير الجينوم مكنت توليد سلالات الماوس جديده في عدد قليل من 3-4 أشهر مع الخبرة التقنية المناسبة6,7,8,9 ، يلزم المزيد من الوقت لتضخيم مستعمره الماوس قبل متابعه التجارب. الاضافه إلى ذلك ، فان هذه الإجراءات مكلفه. فعلي سبيل المثال ، يسرد مختبر جاكسون السعر الحالي لخدمات جيل الفئران التي تبلغ $16,845 لكل سلاله (اعتبارا من كانون الأول/ديسمبر 2018). التالي ، فان الأساليب الأكثر اقتصادا وكفاءه من النهج الوراثية التقليدية لmurine هي أكثر فائده.

متفاوتة المسافات بانتظام متباعدة المتقاربة متكررة/CRISPR البروتين المرتبطة 9 (CRISPR/كاس 9) التكنولوجيا قد أدت إلى تطوير أدوات جديده لسرعه وكفاءه المستندة إلى RNA ، تسلسل الجينوم الخاصة التحرير. اكتشف أصلا كاليه مناعية بكتيرية متكيفة لتدمير الحمض النووي المسبب للمرض الغازي ، وقد استخدم نظام CRISPR/كاس 9 كاداه لزيادة فعاليه تحرير الجينوم في الخلايا النواة والنماذج الحيوانية. وقد استخدم عدد من النهج لنقل آلات CRISPR/كاس 9 إلى الخلايا الجذعية التي تكون الدم (اي ، الكهربية ، النيوفيكشن ، ليبوكشن ، والولادة الفيروسية ، وغيرها).

هنا ، يتم استخدام نظام لينتيفيروس لتحويل الخلايا بسبب قدرتها علي الاصابه بشكل فعال كاس 9-التعبير عن الخلايا الجذعية التي تكون الدم murine وحزمه معا دليل الحمض الريبي النيبالي بناء ، والمروجين ، وتسلسل التنظيمية ، والجينات التي ترميز البروتينات الفلورية مراسل (اي ، GFP ، وعروض العروض). باستخدام هذه الطريقة ، وقد تم السابقة الجسم الفيفو التحرير من الخلايا الجذعية الماوس الدم التي تم تحقيقها ، تليها أعاده ناجحه من نخاع العظم في الفئران قاتل المشع10. ويعبر الناقل اللينتيفيروس المستخدم لهذه الدراسة عن جينات مراسل كاس 9 و GFP من المروج EF1a الأساسي المشترك مع موقع دخول ريبوسومال داخلي من الجينات المراسلة. يتم التعبير عن تسلسل الدليل RNA من مروج U6 منفصل. ويستخدم هذا النظام بعد ذلك لخلق طفرات الادراج والحذف في المرشح التي تكون الدم المورثات سائق الجينات Tet2 و Dnmt3a10. ومع ذلك ، فان كفاءه المحولات بهذه الطريقة منخفضه نسبيا (~ 5 ٪-10 ٪) بسبب الحجم الكبير للمتجه ادراج (13 Kbp) الذي يحد من كفاءه المحول ويقلل من الفيروسات اثناء الإنتاج.

وفي دراسات أخرى ، تبين ان حجم الحمض الريبي الفيروسي الأكبر يؤثر سلبا علي كل من إنتاج الفيروس وكفاءه المحول. علي سبيل المثال ، يتم الإبلاغ عن زيادة 1 كيلوبايت في حجم الادراج لإنقاص إنتاج الفيروسات بنسبه ~ 50% ، ستنخفض كفاءه التوصيل إلى أكثر من 50% في الخلايا الجذعية للدم التي تكون الخلية11. التالي ، فانه من المفيد للحد من حجم ادراج الفيروسية قدر الإمكان لتحسين كفاءه النظام.

ويمكن التغلب علي هذا القصور عن طريق استخدام كاس 9 الفئران المحورة وراثيا ، والتي يتم التعبير عن بروتين كاس 9 في اما بطريقه تاسيسيه أو محرض12. التاسيسيه CRISPR/كاس 9 تدق في الفئران يعبر عن كاس 9 كريات الوحيدة النوى و EGFP من المروج CAG في Rosa26 موضع في كل مكان. التالي ، يمكن تسليم بناء مع sgRNA تحت سيطرة U6 المروج والجينات مراسل تقديم العروض تحت سيطرة المروج EF1a الاساسيه باستخدام ناقل اللينتيفيروس لتحقيق تحرير الجينوم. مع هذا النظام ، تم تحرير جينات الخلايا الجذعية التي تكون الدم بنجاح ، والتي تبين كفاءه المحولة ~ 90 ٪. التالي ، فان هذا البروتوكول يوفر طريقه سريعة وفعاله لإنشاء الفئران التي يتم إدخال طفرات الجينات المستهدفة في نظام التي تكون الدم. في حين ان لدينا مختبر يستخدم في الغالب هذا النوع من التكنولوجيا لدراسة دور تكون الدم النسيلي في عمليات امراض القلب والاوعيه الدموية13,14,15, وهو ينطبق أيضا علي دراسات الدموية الأورام الخبيثة16. وعلاوة علي ذلك ، يمكن توسيع هذا البروتوكول ليشمل تحليل كيفيه تاثير طفرات الحمض النووي في HSPC علي الامراض الأخرى أو العمليات التنموية في النظام الغذائي.

لإنشاء نظام ناقلات لينتيفيروس قويه, المخزونات الفيروسية عيار عاليه والظروف الأمثل لنقل وزرع الخلايا التي تكون الدم مطلوبه. وفي البروتوكول ، تقدم التعليمات بشان اعداد المخزون الفيروسي العالي الارتفاع في القسم 1 ، بما يحسن الظروف الثقافية للخلايا الجذعية التي تشكل الدم في المادة 2 ، وأساليب زرع نخاع العظم في القسم 3 ، وتقييم في القسم 4.

Protocol

وقد تمت الموافقة علي جميع الإجراءات المتعلقة بالمواد الحيوانية من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام (IACUC) في جامعه فيرجينيا.

1-توليد وتنقيه الجزيئات اللينتيفيروسه

ملاحظه: يمكن ان تنتج جزيئات لينتيفيروس التي تحتوي علي الدليل الأمثل RNA بواسطة البروتوكولات المفصلة المقدمة من Addgene: ال< https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf) >. تناقشت طرق محسنه ل [هيغ-تيتر] لينتيفيروس تحضير وتخزين في مكان آخر17,18. وباختصار ، يتم إنتاج لينتيفيروسيس بواسطة النقل المشترك من plasmid لينتيفيروس متجهة ، psPAX2 ، و pMD2 في الخلايا يشيك 293T. يتم جمع الثقافة سوبرناتانت في 48 h بعد النقل العابر وتتركز بواسطة ultracentrifugation حلول. يتم تحديد لينتيفيرال عيار بواسطة فحص المستندة إلى qpcr المتاحة تجاريا. وينبغي تنفيذ هذا الاجراء في مجلس الوزراء من الفئة الثانية للسلامة البيولوجية.

  1. اعداد حل 1:200 من الكولاجين (0.0005%) في 1x تلفزيوني.
  2. معطف 6 لوحه جيدا مع محلول الكولاجين واحتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 ل ~ 30 دقيقه.
  3. البذور 293T الخلايا في كثافة 1 × 106 خلايا في بئر واحتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 ل ~ 2 h.
  4. لاعداد خليط من ثلاثه البلازميدات الانتقال لبئر واحد ، والجمع بين 0.9 ميكروغرام من ناقلات لينتيفيروس ، 0.6 ميكروغرام من psPAX2 ، و 0.3 ميكروغرام من pMD2 ، ثم تحقيق حجم إجمالي من 10 μL عن طريق أضافه المياه منزوعة الأيونات. ضبط المبالغ تبعا لعدد الآبار. كميه ونسبه كل البلازميد قد تحتاج إلى مزيد من الأمثل لتتناسب مع احتياجات الباحثين.
  5. بعناية أضافه 50 μl من 1x تلفزيوني و 5 μl من المخفف PEI MAX (1.0 mg/mL) إلى الخليط البلازميد واحتضان لمده 15 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT) (الجدول 1).
  6. أضف 1 مل من DMEM إلى الخليط.
  7. الشفط وسائل الاعلام من لوحه 6 جيدا ، أضافه 1 مل من الخليط البلازميد ، واحتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 ل ~ 3 h.
  8. استبدال وسائل الاعلام مع 2 مل من DMEM الطازجة واحتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 لمده 24 ساعة.
  9. أضافه 1 مل من DMEM الطازجة واحتضانها في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 لمده 24 ساعة اضافيه (مجموع وقت الحضانة هو 48 h).
  10. نقل الثقافة ماده طافي إلى أنبوب 50 mL والطرد المركزي في 3,000 x g لمده 15 دقيقه لأزاله اي الخلايا العائمة الحرة.
  11. تصفيه ماده طافي من خلال فلتر 0.45 μm.
  12. نقل الترشيح إلى أنابيب الطرد المركزي البولي بروبيلين.
  13. Ultracentrifuge في 4 درجه مئوية و 72,100 x g في rماكس ل 3 ح.
  14. يستنشق بعناية supernatant ، تاركا وراءه بيليه بيضاء.
  15. أعاده تعليق بيليه مع 100 μL من المصل خاليه من الخلايا العضوية توسيع المتوسطة دون تهويه.
  16. الحفاظ علي 10 μl قسامه لقياس عيار الفيروسية وتخزين جميع قسامه المتبقية في-80 درجه مئوية حتى المطلوبة.
  17. معايره الفيروس مع فحص المستندة إلى qPCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام 10 μL الفيروسية aliquot.

2. العزلة والتوصيل من الخلايا السالبة النسب من نخاع العظم الماوس (الشكل 1A)

ملاحظه: عاده ، لعزل الخلايا بما فيه الكفاية ، يتم حصاد أزواج من tibias ، femurs ، و العضد من كل ماوس. ويمكن أيضا حصاد عظام الحوض والعمود الفقري كمصدر للخلايا السالبة لنسب.

  1. عزل خلايا نخاع العظم
    1. موت ببطء 8-10 الأسبوع القديمة الذكور CRISPR/كاس 9 تدق في الفئران بنسبه 5 ٪ ايزوفلوراني تليها خلع عنق الرحم ، ثم تطهير بشرتهم مع الايثانول 70 ٪.
    2. باستخدام مقص تشريح ، وجعل شق عرضيه في الجلد تحت القفص الصدري مباشره وقشر الجلد بشكل منتفخ في كلا الاتجاهين لفضح الساقين والذراعين.
    3. افصل الأطراف السفلية بعناية عن عظم الورك عن طريق فصل مفصل الورك. قطع علي طول راس عظم الفخذ لأزاله عظم الفخذ تماما من الورك. فك الركبة وقطع في المفصل لفصل عظم الفخذ والساق ، مع الحفاظ علي العظم الخلوي سليمه. تفكيك مفصل الكاحل وقشر بعيدا القدم والعضلات الاضافيه.
    4. باستخدام مقص تشريح ، وقطع علي الكتف لفصل الأطراف العليا. فك الكتف ، ثم قطع في مفصل الكوع لحصاد عظم العضد.
    5. استخدام مناديل السليلوز ألياف لأزاله العضلات بعناية من الإناث ، التحيز ، و humeri. اتخاذ احتياطات اضافيه للتاكد من ان العظام لا كسر اثناء هذه العملية.
    6. وضع العظام المعزولة في أنبوب مخروطي 50 mL التي تحتوي علي RPMI ، ومكان علي الجليد.
      ملاحظه: يجب تنفيذ الخطوات التالية في خزانه الفئة الثانية للسلامة البيولوجية.
    7. انقل العظام إلى طبق ثقافة معقم 100 ملم.
    8. فهم العظم مع ملقط حاده ، واستخدام مقص تشريح ، وقطع بعناية علي حد سواء ابيهيسيس.
      ملاحظه: سيؤدي القطع غير كافيه إلى تدفق غير مكتملة من نخاع العظم ، في حين ان القطع العدوانية بشكل مفرط سيؤدي إلى فقدان الخلايا.
    9. ملء حقنه 10 مل مع RPMI الجليد الباردة, وباستخدام ابره 22 G, مسح نخاع العظم من رمح إلى جديد 100 mm الثقافة طبق.
      ملاحظه: العظام سوف تصبح بيضاء وشفافة إذا كان رمح العظام تم مسح جيدا. إذا لم يكن كذلك ، وأعاده قطع العظام ينتهي ودافق مره أخرى.
    10. بعد كل نخاع العظم قد تم جمعها ، وجعل تعليق خليه واحده عن طريق تمرير نخاع العظم عده مرات من خلال حقنه 10 مل مع ابره 18 ز. كرر 10x لضمان تعليق خليه واحده.
    11. تصفيه تعليق الخلية من خلال مصفاه الخلية 70 μm في أنبوب مخروطي 50 mL.
    12. جهاز الطرد المركزي في 310 x g ل 10 دقيقه في 4 °c.
    13. يستنشق ماده طافي وأعاده التعليق الكريات الخلية في حجم مناسب من العازلة الفصل الأمثل لعمليه فصل الخلية التالية.
  2. العزلة واللينتيفيروسه من الخلايا السالبة لنسب
    ملاحظه: يتم عزل الفئران النسب-الخلايا السالبة من نخاع العظم من كاس 9 الماوس المحورة وراثيا3، أو سلالات أخرى من الفئران ، وذلك باستخدام مجموعه استنزاف النسب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. عاده ، تمثل الخلايا السالبة للنسب 2%-5% من خلايا نواه النخاع العظمي الكاملة ، والنقاء عاده أكبر من 90% بعد العزلة. يتم استزراع الخلايا المعزولة النسب السلبية في مصل خاليه من الدم الخلايا العضوية توسيع المتوسطة تستكمل مع 20 نانوغرام/مل المؤتلف murine TPO و 50 ng/mL المؤتلف murine ، ثم محوله مع ناقل لينتيفيروس ل 16 ح في تعدد العدوى (وزاره الداخلية) = 100.
    1. لعزل الخلايا السالبة للسلالة ، استخدم مجموعه استنفاد خلايا النسب وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    2. بعد العزلة أعاده تعليق الخلايا السالبة النسب في 1 مل من المصل خاليه من الدم توسيع الخلية المتوسطة.
    3. بذور الخلايا في 6 لوحه جيدا في كثافة 1.5 x 106 خلايا/مل (5 × 105 نسب-الخلايا السالبة/الماوس.)
    4. أضافه المؤتلف murine TPO والصندوق الدائم في الآبار في التركيزات النهائية من 20 نانوغرام/مل و 50 ng/mL ، علي التوالي.
    5. قبل احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO2 ل ~ 2 h.
    6. أضافه لينتيفيروس في موي = 100 ، 4 ميكروغرام/مل بوليبيرين ، والبنسلين/ستربتوميسين إلى الآبار واحتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 ل 16-20 h (الشكل 1b).
    7. في اليوم التالي ، وجمع الخلايا لينتيفيروس محوله إلى أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي في 300 g لمده 10 دقيقه.
    8. يستنشق بعناية ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 200 μl من rpmi لكل ماوس. الحفاظ علي الخلايا في RT حتى زرع في الفئران (القسم 3).

3-زرع الخلايا المحولة في الفئران المشعة قاتل

  1. في يوم من زرع نخاع العظم, مكان الفئران المتلقي في قفص فطيره ثمانيه شريحة وتعريضهم لجرعين من تشعيع الجسم كله (550 راد/الجرعة, الجرعة الاجماليه = 1100 راد), مع ما يقرب من 4 ساعة بين كل جلسة التشعيع.
  2. بعد الجلسة التشعيع الثانية ، حقن الخلايا السالبة النسب المحولة إلى كل الفئران المتلقي التخدير عن طريق الضفيرة الوريد المداري الرجعية (200 μL في المجموع) باستخدام حقنه الانسولين (الشكل 1C).
  3. بعد التشعيع ، يجب ان تكون الفئران موجودة في أقفاص معقمه ومزوده بنظام غذائي لين ومياه الشرب تستكمل بالمضادات الحيوية ل 14 د.
  4. في 3-4 أسابيع بعد زرع نخاع العظم ، وتحليل الدم المحيطي للتحقق من الفحص من الخلايا المتبرعة محوله (القسم 4).

4. تقييم تشيميريسم الدم المحيطي

  1. تخدير الفئران مع 5 ٪ ايزوفلوان والحصول علي عينه الدم من الوريد الرجعية المدارية باستخدام أنابيب الشعرية ، وجمعها في K2أنابيب أدتا (حجم في أنبوب واحد الشعرية كافيه لمقايسة التالية).
  2. نقل 20 μL من الدم من أنابيب K2EDTA في 5 مل جولة أسفل أنابيب البوليسترين اختبار ، ووضعت علي الجليد.
  3. أضافه 1.5 mL من المخزن المؤقت تحلل إلى خلايا الدم الحمراء lyse. احتضان لمده 5 دقائق علي الجليد.
  4. لتحييد العازلة تحلل ، وغسل العينات مع العازلة FACS (1.5 mL/عينه).
  5. جهاز الطرد المركزي في 609 x g في rماكس لمده 5 دقائق في 4 ° c. تجاهل الخارقة.
  6. احتضان الخلايا مع كوكتيل من الأجسام المضادة الاحاديه (المخفف في 100 μL FACS العازلة/عينه) في RT لمده 20 دقيقه في الظلام. يتم توفير قائمه كامله من الأجسام المضادة في قسم المواد أعلاه.
  7. غسل الخلايا مره واحده مع العازلة FACS (2 مل/عينه). جهاز الطرد المركزي في 609 x g في rماكس (1,800 دوره في الدقيقة) لمده 5 دقائق في 4 ° c. تجاهل الخارقة تماما.
  8. إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد التي تحتوي علي تثبيت العازلة (100 μL/tube) لمده 10 دقيقه في 4 ° c.
  9. اغسل الخلايا مره واحده مع العازلة FACS (3 مل/عينه). جهاز الطرد المركزي في 609 x g في rماكس (1,800 دوره في الدقيقة) لمده 5 دقائق في 4 ° c. تجاهل الخارقة تماما.
  10. تعليق بيليه في 400 μL من المخزن المؤقت FACS.
  11. الحفاظ علي العينات في 4 درجه مئوية حتى التحليل عن طريق تدفق الخلوي.

النتائج

باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه ، تم الحصول علي ما يقرب من 0.8-1.0 x 108 خلايا نخاع العظم لكل ماوس. عدد الخلايا السالبة النسب نحصل علي ما يقرب من 3 × 106 خلايا لكل ماوس. عاده ، الغلة من نخاع العظم سلاله-الخلايا السالبة هي 4 ٪-5 ٪ من تلك الخلايا النووية نخاع العظم الكلي.<...

Discussion

وتتمثل ميزه هذا البروتوكول في إنشاء نماذج حيوانيه تاوي طفرات محدده في الخلايا التي تكون فيها الدم بطريقه سريعة وفعاله من حيث التكلفة مقارنه بالنهج المعدلة وراثيا للماوس التقليدي. وقد وجد ان هذه المنهجية تمكن جيل من الفئران مع التلاعب الجينات الخلية التي تكون الدم في غضون 1 شهر. وهناك عده خ...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

[س. س.] كان ساندت بامريكيه قلب جمعيه دكتوراه زمالة [17 بوس33670076]. تم دعم k. w. من قبل المعاهد القومية للصحة المنح R01 HL138014 ، R01 HL141256 ، و R01 HL139819.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim injectionTEVA0703-9526-01
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGEEXELINT26028general supply
293T cellsATCCCRL-3216--Cell line
APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21)BD Biosciences560599Antibodies
APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)BD Biosciences552094Antibodies
BD Luer-Lok disposable syringes, 10 mlBD309604general supply
BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA addedBD Bioscience365974general supply
BD Precisionglide needle, 18 GBD305195general supply
BD Precisionglide needle, 22 G BD305155general supply
BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7)Biolegend100752Antibodies
BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11)Biolegend100349Antibodies
Collagen from calf skinSigma-Aldrich9007-34-5general supply
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well Millipore SigmaCLS3471general supply
CRISPR/Cas9 knock-in miceThe Jackson Laboratory028555mouse
DietGel 76AClear H2O70-01-5022general supply
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucoseSigma AldrichD6429Medium
eBioscience 1X RBC Lysis BufferThermo fisher Scientific00-4333-57Solution
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture DishLife Sciences353003general supply
Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tubeLife Sciences352054general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific352098general supply
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate Life Science353046general supply
Fisherbrand microhematocrit capillary tubesThermo Fisher Scientific22-362566general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μmFisher Scientific22363548general supply
FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5)Invitrogen11-0042-85Antibodies
Fixation BufferBD Bioscience554655Solution
Guide-it Compete sgRNA Screening SystemsClontech632636Kit
Isothesia (Isoflurane) solutionHenry Schein29404Solution
Lenti-X qRT-PCR Titration Kit Takara631235Kit
Lineage Cell Depletion Kit, mouseMiltenyi Biotec130-090-858Kit
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mmMillipore SigmaSLHV004SLgeneral supply
PBS pH7.4 (1X)Gibco10010023Solution
PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)eBioscience25-1152-82Antibodies
PEI MAXPolysciences24765-1Solution
Penicillin-Streptomycin MixtureLonza17-602FSolution
PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)BD Biosciences560602Antibodies
pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP Addgene57823Plasmid
pMG2DAddgene12259Plasmid
Polybrene Infection/Transfection ReagentSigma AldrichTR-1003-GSolution
Polypropylene Centrifuge TubesBECKMAN COULTER326823general supply
psPAX2 Addgene12260Plasmid
RadDisk – Rodent Irradiator DiskBraintree ScientificIRD-P Mgeneral supply
Recombinant Murine SCFPeprotech250-03Solution
Recombinant Murine TPO Peprotech 315-14Solution
StemSpan SFEMSTEMCELL Technologies09600Solution
TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coliThermo fisher ScientificK457501Kit
Zombie Aqua Fixable Viability KitBioLegend423102Solution 

References

  1. Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
  2. Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment. Blood. 91, 419-430 (1998).
  3. Meyer, S. E., et al. DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia. Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).
  4. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
  5. Cole, C. B., et al. PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia. Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).
  6. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
  7. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  8. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
  9. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).
  10. Sano, S., et al. CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease. Circulation Research. 123, 335-341 (2018).
  11. Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters. BMC Research Notes. 9 (312), (2016).
  12. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).
  13. Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355, 842-847 (2017).
  14. Sano, S., et al. Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).
  15. Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease. Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).
  16. Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).
  17. Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
  18. Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).
  19. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).
  20. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  21. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561, 416-419 (2018).
  22. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).
  23. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).
  24. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568, 193-197 (2019).
  25. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568, 259-263 (2019).
  26. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
  27. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
  28. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).
  29. Fuster, J. J., Walsh, K. Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease. Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).
  30. Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. Blood. , (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

152CRISPR 99

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved