질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

요약

설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.

초록

기존의 종족 형성 접근법을 사용하여 조혈 줄기 세포에서 유전자를 조작하는 것은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 도전적일 수 있습니다. 게놈 편집 기술 및 렌티바이러스 매개 이식 유전자 전달 시스템의 발전으로부터 이익을 얻는 효율적이고 경제적인 방법은 조혈 줄기 세포에서 유전자가 특별히 조작되는 마우스를 확립하는 데 설명되어 있습니다. 렌티바이러스는 Cas9 발현 계보 음성 골수 세포를 특정 유전자 및 적색 형광 리포터 유전자(RFP)를 표적으로 하는 가이드 RNA(gRNA)로 트랜스듀싱한 다음, 이들 세포는 Lethally-조사된 C57BL/6 마우스로 이식됩니다. 비표적GRNA를 발현하는 렌티바이러스로 이식된 마우스는 대조군으로 사용된다. 형질전환된 조혈 줄기 세포의 생착은 말초 혈액의 RFP 양성 백혈구의 유세포 분석으로 평가된다. 이 방법을 사용하여 이식 후 4 주에 골수성 세포의 ~ 90 % 이식 및 ~ 70 %의 림프세포를 달성 할 수 있습니다. 게놈 DNA는 RFP 양성 혈액 세포로부터 분리되고, 표적 부위 DNA의 일부는 게놈 편집을 검증하기 위해 PCR에 의해 증폭된다. 이 프로토콜은 조혈-조절 유전자의 높은 처리량 평가를 제공하고 조혈 세포 침범을 가진 다양한 마우스 질환 모델로 확장될 수 있다.

서문

혈액학 및 면역학에 있는 많은 연구 결과는 Mx1-Cre, Vav-Cre 및 그 외와 같은 조혈 계통 특정 Cre 드라이버를 이용하는 종래의 조건부 형질전환/녹아웃 마우스를 포함하여 유전자 변형마우스의 가용성에 의존합니다 ^1,2,^3,4,5. 이러한 전략은 시간이 많이 걸리고 재정적으로 부담이 될 수있는 새로운 마우스 균주의 설립을 필요로한다. 게놈 편집 기술의 혁명적 인 발전은 적절한 기술 전문 지식으로 3-4 개월 만에 새로운 마우스 균주의 생성을 가능하게하는 동안^6,7,8,9 실험을 추구하기 전에 마우스 콜로니를 증폭하는 데 훨씬 더 많은 시간이 필요합니다. 또한 이러한 절차는 비용이 많이 듭니다. 예를 들어, 잭슨 연구소는 균주당 $16,845(2018년 12월 현재)에 녹아웃 마우스 생성 서비스의 현재 가격을 나열합니다. 따라서, 종래의 뮤린 형질전환 접근법보다 더 경제적이고 효율적인 방법이 더 유리하다.

정기적으로 간격을 두는 짧은 palindromic 반복 /CRISPR 관련 단백질 9 (CRISPR / Cas9) 기술은 신속하고 효율적인 RNA 기반, 서열 특정 게놈 편집을위한 새로운 도구의 개발을 주도하고있다. 원래 침입 병원체 DNA를 파괴하는 세균 적응 면역 메커니즘으로 발견, CRISPR / Cas9 시스템은 진핵 세포와 동물 모델에서 게놈 편집의 효과를 높이기 위해 도구로 사용되어왔다. 다양 한 접근 조혈 줄기 세포에 CRISPR/Cas9 기계를 전송 하는 데 사용 되었습니다 (즉, 전기 천 공, 핵, lipofection, 바이러스 전달, 그리고 다른 사람).

여기서, 렌티바이러스 시스템은 Cas9 발현 뮤린 조혈 줄기 세포를 효과적으로 감염시키고 가이드 RNA 발현 구조, 프로모터, 조절 서열 및 인코딩하는 유전자를 함께 포장하는 능력으로 인해 세포를 트랜스듀싱하는 데 사용된다. 형광 리포터 단백질 (즉, GFP, RFP). 이 방법을 사용하여, 마우스 조혈 줄기 세포의 생체 내 유전자 편집이 달성되었으며, 그 다음으로 조사된 마우스^10에서골수의 성공적인 재구성이 이루어졌다. 본 연구에 채택된 렌티바이러스 벡터는 리포터 유전자로부터 상류에 내부 리보좀 진입 부위를 가진 공통 코어 EF1a 프로모터로부터 Cas9 및 GFP 리포터 유전자를 발현한다. 가이드 RNA 서열은 별도의 U6 프로모터로부터 발현된다. 이 시스템은 후보 클론 조혈 드라이버 유전자 Tet2 및 Dnmt3a^10에서삽입 및 결실 돌연변이를 생성하는 데 사용된다. 그러나,이 방법에 의한 환전 효율은 상대적으로 낮다 (~5%-10%) 벡터 인서트(13Kbp)의 크기가 커서 변환 효율을 제한하고 생산 중 바이러스 역가를 줄입니다.

다른 연구에서는, 더 큰 바이러스 RNA 크기가 바이러스 생산 및 전염 효율 모두에 부정적인 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 예를 들어, 삽입 크기의 1kb 증가는 바이러스 생산을 ~50% 감소시키는 것으로 보고되고, 형질전환 효율은 마우스 조혈 줄기^{세포(11)에서}50% 이상으로 감소할 것이다. 따라서, 시스템의 효율을 향상시키기 위해 바이러스 삽입물의 크기를 가능한 한 많이 줄이는 것이 유리하다.

이러한 단점은 Cas9 단백질이 구성적 또는 유도성 방식으로 발현되는 Cas9 형질전환 마우스를 채택함으로써 극복될 수 있다^12. 구성CRISPR/Cas9 노크인 마우스는 유비쿼터스 방식으로 Rosa26 궤양에서 CAG 프로모터로부터 Cas9 엔도뉴클레아제 및 EGFP를 표현한다. 따라서, 코어 EF1a 프로모터의 제어 하에 U6 프로모터 및 RFP 리포터 유전자의 제어 하에 sgRNA를 이용한 컨스트럭트는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 게놈 편집을 달성할 수 있다. 이 시스템으로, 조혈 줄기 세포의 유전자는 성공적으로 편집되었습니다, ~ 90% 형질 전환 효율을 보여주는. 따라서, 이 프로토콜은 표적 유전자 돌연변이가 조혈 계통내로 도입되는 마우스를 만드는 신속하고 효과적인 방법을 제공한다. 우리의 실험실은 주로 심혈 관 질환 과정에서 클론 조혈의 역할을 연구하기 위해 기술의이 유형을 사용하는 동안^13,14,15,그것은 또한 혈액학의 연구에 적용 악성¹⁶. 더욱이, 이 프로토콜은 HSPC에 있는 DNA 돌연변이가 조혈 계통에 있는 그밖 질병 또는 발달 프로세스에 어떻게 영향을 미치는지의 분석으로 확장될 수 있습니다.

견고한 렌티바이러스 벡터 시스템을 확립하기 위해서는 조혈 세포의 전염 및 이식에 대한 높은 역가 바이러스 성 주식 및 최적화된 조건이 필요합니다. 프로토콜에서, 지침은 섹션 1에서 높은 역가 바이러스 주식의 제조에 제공되며, 섹션 2에서 뮤린 조혈 줄기 세포의 배양 조건을 최적화하고, 섹션 3에서 골수 이식 방법을 평가하고, 평가합니다. 섹션 4의 접착.

프로토콜

동물 과목과 관련된 모든 절차는 버지니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 렌티바이러스 입자의 생성 및 정제

참고 : 최적화 된 가이드 RNA를 포함하는 렌티 바이러스 입자는 Addgene에서 제공하는 자세한 프로토콜에 의해 생성 될 수있다: 고티터 렌티바이러스 준비 및 저장을 위한 최적화된 방법은^{다른 곳에서 17,18에}대해 논의된다. 간단히 말해서, 렌티바이러스는 HEK 293T 세포내로 렌티바이러스 벡터 플라스미드, psPAX2 및 pMD2.G의 공동 형질감염에 의해 생성된다. 배양 상급제는 48 시간 후 형질 감염에서 수집되고 초원심분리에 의해 농축된다. 렌티바이러스 적전기는 시판되는 qPCR 기반 분석법에 의해 결정된다. 이 절차는 생체 안전 등급 II 캐비닛에서 수행해야합니다.

1. 콜라겐 1:200 용액 준비 (0.0005%) 1x PBS에서.
2. 6개의 웰 플레이트를 콜라겐 용액으로 코팅하고 37°C에서 배양하고, 5%_CO2를 ~30분 동안 배양한다.
3. 종자 293T 세포는 웰당 1 x 10⁶ 세포의 밀도로 37°C에서 배양하고, 5%_CO2를 ~2시간 동안 배양한다.
4. 1개의 우물을 위한 3개의 형질감염 플라스미드의 혼합물을 준비하기 위하여는, 렌티바이러스 벡터의 0.9 μg, psPAX2의 0.6 μg 및 pMD2.G의 0.3 μg를 결합하고, 그 다음 탈이온수를 추가하여 10 μL의 총 부피를 달성한다. 웰 수에 따라 양을 조정합니다. 각 플라스미드의 양과 비율은 연구자의 요구에 맞게 더욱 최적화되어야 할 수도 있습니다.
5. 1x PBS 50 μL과 희석된 PEI MAX(1.0 mg/mL)를 플라스미드 혼합물에 조심스럽게 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다(표1).
6. 혼합물에 DMEM 1 mL을 추가합니다.
7. 6웰 플레이트로부터 의 매질, 플라스미드 혼합물 1 mL을 첨가하고, 37°C에서 배양하고, 5%_CO2를 ~3시간 동안 배양한다.
8. 미디어를 신선한 DMEM 2 mL로 교체하고 37°C에서 배양하고 24시간 동안 5%_CO2를 배양합니다.
9. 신선한 DMEM 1 mL을 추가하고 37 °C에서 배양하고 추가 24 시간 동안 5 % CO_2를 배양하십시오 (총 배양 시간은 48 시간).
10. 배양 상급체를 3,000 x g에서 3,000 x g에서 15분 동안 원심분리기로 옮기고 자유 부동 세포를 제거한다.
11. 0.45 μm 필터를 통해 상급체를 걸.입니다.
12. 여과액을 폴리프로필렌 원심분리기로 옮김을 옮김.
13. 4 °C에서 72,100 x g의 초원심 분리기는 3 시간 동안 r_{최대값으로.}
14. 조심스럽게 상류를 흡인, 흰색 펠릿 뒤에 떠나.
15. 폭기 없이 혈청이 없는 조혈 세포 팽창 배지의 100 μL로 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
16. 10 μL aliquot를 유지하여 바이러스 성기를 측정하고 필요한 때까지 나머지 모든 알리쿼트(aliquots)를 -80°C에서 저장합니다.
17. 10 μL 바이러스 성 aliquot를 사용하여 제조자의 지시에 따라 qPCR 기반 분석법으로 바이러스를 적정화.

2. 마우스 골수에서 계보 음성 세포의 격리 및 변환(그림 1A)

참고 : 일반적으로 충분한 세포를 분리하기 위해 각 마우스에서 경골, 대퇴골 및 휴머니 쌍을 수확합니다. 골반과 척추 뼈는 또한 계보 음성 세포의 근원으로 수확될 수 있습니다.

1. 골수 세포의 격리
   1. 8-10주 된 수컷 CRISPR/Cas9 노크인 마우스를 5% 이소플루란에 의해 자궁 경부 탈구를 한 다음 70% 에탄올로 피부를 소독합니다.
   2. 해부 가위를 사용하여 흉곽 바로 아래의 피부에 가로 절개를하고 다리와 팔을 노출하기 위해 양방향으로 피부를 벗겨냅니다.
   3. 엉덩이 관절을 분리하여 엉덩이 뼈에서 하반신을 조심스럽게 분리하십시오. 대퇴골 머리를 따라 잘라 엉덩이에서 대퇴골을 완전히 제거합니다. 뼈 골피를 그대로 유지하면서, 대퇴골과 경골을 분리하기 위해 관절에서 무릎을 탈구하고 잘라. 발목 관절을 탈구하고 발과 여분의 근육을 벗겨냅니다.
   4. 해부 가위를 사용하여 어깨 위로 잘라 상지분리합니다. 어깨를 탈구한 다음 팔꿈치 관절을 잘라 상완골 뼈를 수확합니다.
   5. 셀룰로오스 섬유 물티슈를 사용하여 대퇴골, 경골 및 후머리에서 근육을 조심스럽게 제거하십시오. 이 과정에서 뼈가 부러지지 않도록 추가 예방 조치를 취하십시오.
   6. 분리된 뼈를 RPMI가 들어 있는 50mL 원추형 튜브에 넣고 얼음 위에 놓습니다.
      참고: 다음 단계는 생체 안전 등급 II 캐비닛에서 수행해야 합니다.
   7. 뼈를 멸균 된 100mm 배양 접시로 옮니다.
   8. 무딘 집게로 뼈를 잡고 해부 가위를 사용하여 조심스럽게 두 골피를 잘라냅니다.
      참고 : 부족한 절단은 골수의 불완전한 플러시로 이어질 것입니다, 지나치게 공격적인 절단은 세포 손실의 결과로.
   9. 얼음처럼 차가운 RPMI로 10 mL 주사기를 채우고 22G 바늘을 사용하여 샤프트의 골수를 새로운 100mm 배양 접시로 씻어 내보웁니다.
      참고: 뼈 샤프트가 잘 플러시된 경우 골격은 흰색과 반투명이 됩니다. 그렇지 않은 경우 뼈 끝을 다시 자르고 다시 플러시하십시오.
   10. 모든 골수가 수집된 후, 18G 바늘로 10 mL 주사기를 통해 골수를 여러 번 통과시킴으로써 단세포 현탁액을 만든다. 10x를 반복하여 단일 셀 현탁액을 확인합니다.
   11. 70 μm 세포 스트레이너를 통해 50 mL 원엽 튜브로 세포 현탁액을 필터링합니다.
   12. 310 x g에서 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리기.
   13. 상판액을 흡인하고 다음 세포 분리 공정을 위해 최적화된 분리 버퍼의 적절한 부피에서 세포 펠릿을 재중단한다.
2. 계보 음성 세포의 격리 및 렌티바이러스 전염
   참고: 마우스 계보 음성 세포는 Cas9 형질전환 마우스^3,또는 마우스의 다른 변종으로부터 분리되어, 제조사의 지침에 따라 계보 고갈 키트를 사용한다. 전형적으로, 계보 음성 세포는 전체 골수 핵세포의 2%-5%를 차지하고, 순도는 일반적으로 격리 다음 90% 이상입니다. 분리된 계보-음성 세포는 20 ng/mL 재조합 murine TPO 및 50 ng/mL 재조합 뮤린 SCF로 보충된 혈청 없는 조혈 세포 확장 배지에서 배양된 다음, 16시간 동안 렌티바이러스 벡터로 트랜스듀에 감염 (MOI) = 100.
   1. 계보 음성 세포를 분리하려면 제조업체의 지침에 따라 리니지 셀 고갈 키트를 사용하십시오.
   2. 격리 후 혈청없는 조혈 세포 확장 배지의 1 mL에서 계보 음성 세포를 다시 중단합니다.
   3. 1.5 x 10⁶ 셀 / mL (5 x 10⁵ 계보 음성 세포 / 마우스)의 밀도에서 6 개의 웰 플레이트로 세포를 시드하십시오.
   4. 재조합 뮤린 TPO와 SCF를 각각 20 ng/mL 및 50 ng/mL의 최종 농도로 우물에 추가합니다.
   5. 37°C에서 5%_CO2에서 ~2시간 동안 사전 배양된 세포.
   6. MOI = 100, 4 μg/mL 폴리브렌, 페니실린/스트렙토마이신을 웰에 넣고 37°C에서 배양하고, 16-20h에 대해 5%_CO2를 배양한다(그림1B).
   7. 다음 날, 렌티바이러스 를 15 mL 원추형 튜브로 수혈하고 10 분 동안 300g에서 원심 분리기를 수집합니다.
   8. 조심스럽게 상판을 흡인하고 마우스 당 RPMI의 200 μL에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 쥐로 이식 될 때까지 RT에서 세포를 유지 (섹션 3).

3. 의도적으로 조사 된 마우스로 변환 된 세포의 이식

1. 골수 이식의 날에, 8 슬라이스 파이 케이지에 받는 마우스를 놓고 전신 조사의 두 복용량에 노출 (550 Rad/dose, 총 복용량 = 1100 Rad), 각 조사 세션 사이 약 4 시간.
2. 두 번째 조사 세션 후, 인슐린 주사기를 사용하여 레트로 궤도 정맥 신경총 (총 200 μL)을 통해 각 마취 된 수용자 마우스에 형질 전환 계보 음성 세포를 주입합니다(그림 1C).
3. 조사 후, 마우스는 살균 케이지에 보관하고 14 d에 대한 항생제로 보충 부드러운 식단과 식수를 제공해야합니다.
4. 골수 이식 후 3-4 주에서 말초 혈액을 분석하여 형질 전환 된 기증자 세포의 생착을 확인하십시오 (섹션 4).

4. 말초 혈액의 키메라증 평가

1. 5% 이소플루란으로 마우스를 마취시키고 모세관을 사용하여 레트로 궤도 정맥에서 혈액 샘플을 얻고_K2EDTA 튜브로 수집합니다(모세관 의 부피는 다음 분석에 충분합니다).
2. K2EDTA 튜브에서 20 μL의 혈액을 5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관으로 옮기고 얼음위에 올려 놓습니다.
3. 적혈구를 lyseRBC 라시스 버퍼의 1.5 mL를 추가합니다. 얼음에 5 분 동안 배양.
4. 라시스 버퍼를 중화하려면 FACS 버퍼(1.5 mL/샘플)로 샘플을 세척합니다.
5. 4 °C에서 5 분 동안 r_최대에서 609 x g의 원심 분리기. 상급제는 버리십시오.
6. 어둠 속에서 20 분 동안 RT에서 단일 클론 항체 (100 μL FACS 버퍼 / 샘플에서 희석)의 칵테일로 세포를 배양하십시오. 항체의 전체 목록은 위의 재료 섹션에 제공됩니다.
7. FACS 버퍼 (2 mL / 샘플)로 세포를 한 번 씻으하십시오. 4 °C에서 5 분 동안 r_최대 (1,800 rpm)에서 609 x g의 원심 분리기. 상급체를 완전히 버리십시오.
8. 4 °C에서 10 분 동안 고정 버퍼 (100 μL / 튜브)를 포함하는 파라 포름 알데히드로 세포를 고정하십시오.
9. FACS 버퍼 (3 mL / 샘플)로 세포를 한 번 씻으하십시오. 4 °C에서 5 분 동안 r_최대 (1,800 rpm)에서 609 x g의 원심 분리기. 상급체를 완전히 버리십시오.
10. FACS 버퍼의 400 μL에서 펠릿을 일시 중단합니다.
11. 유세포 분석에 의한 분석까지 시료를 4°C로 유지합니다.

결과

전술한 프로토콜을 사용하여, 마우스당 약 0.8-1.0 x 10^8개의 골수 세포를 수득하였다. 우리가 얻는 계보 음성 세포의 수는 마우스 당 대략 3 x 10⁶ 세포입니다. 전형적으로, 골수 계보-음성 세포의 수율은 총 골수 핵 세포의 4%-5%입니다.

형질전환된 세포의 키메리즘(RFP-양성)은 말초 혈액의 유세포측정에 의해 평가된...

토론

이 프로토콜의 장점은 기존의 마우스 형질전환 접근법에 비해 신속하고 매우 비용 효율적인 방식으로 조혈 세포에서 특정 돌연변이를 수용하는 동물 모델을 생성한다는 것입니다. 이 방법론은 조혈 세포 유전자 조작을 가진 마우스의 생성을 1 달 안에 가능하게 한다는 것을 것을을 발견되었습니다. 이 프로토콜에는 추가 고려가 필요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875-093	Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim injection	TEVA	0703-9526-01
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE	EXELINT	26028	general supply
293T cells	ATCC	CRL-3216--	Cell line
APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21)	BD Biosciences	560599	Antibodies
APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)	BD Biosciences	552094	Antibodies
BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml	BD	309604	general supply
BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added	BD Bioscience	365974	general supply
BD Precisionglide needle, 18 G	BD	305195	general supply
BD Precisionglide needle, 22 G	BD	305155	general supply
BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7)	Biolegend	100752	Antibodies
BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11)	Biolegend	100349	Antibodies
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	9007-34-5	general supply
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well	Millipore Sigma	CLS3471	general supply
CRISPR/Cas9 knock-in mice	The Jackson Laboratory	028555	mouse
DietGel 76A	Clear H2O	70-01-5022	general supply
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose	Sigma Aldrich	D6429	Medium
eBioscience 1X RBC Lysis Buffer	Thermo fisher Scientific	00-4333-57	Solution
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish	Life Sciences	353003	general supply
Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube	Life Sciences	352054	general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	352098	general supply
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate	Life Science	353046	general supply
Fisherbrand microhematocrit capillary tubes	Thermo Fisher Scientific	22-362566	general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm	Fisher Scientific	22363548	general supply
FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5)	Invitrogen	11-0042-85	Antibodies
Fixation Buffer	BD Bioscience	554655	Solution
Guide-it Compete sgRNA Screening Systems	Clontech	632636	Kit
Isothesia (Isoflurane) solution	Henry Schein	29404	Solution
Lenti-X qRT-PCR Titration Kit	Takara	631235	Kit
Lineage Cell Depletion Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-090-858	Kit
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm	Millipore Sigma	SLHV004SL	general supply
PBS pH7.4 (1X)	Gibco	10010023	Solution
PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)	eBioscience	25-1152-82	Antibodies
PEI MAX	Polysciences	24765-1	Solution
Penicillin-Streptomycin Mixture	Lonza	17-602F	Solution
PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Biosciences	560602	Antibodies
pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP	Addgene	57823	Plasmid
pMG2D	Addgene	12259	Plasmid
Polybrene Infection/Transfection Reagent	Sigma Aldrich	TR-1003-G	Solution
Polypropylene Centrifuge Tubes	BECKMAN COULTER	326823	general supply
psPAX2	Addgene	12260	Plasmid
RadDisk – Rodent Irradiator Disk	Braintree Scientific	IRD-P M	general supply
Recombinant Murine SCF	Peprotech	250-03	Solution
Recombinant Murine TPO	Peprotech	315-14	Solution
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	09600	Solution
TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli	Thermo fisher Scientific	K457501	Kit
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend	423102	Solution