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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Beschrieben werden Protokolle für die hocheffiziente Genombearbeitung von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) durch das CRISPR/Cas9-System zur schnellen Entwicklung von Mausmodellsystemen mit hämatopoetischen systemspezifischen Genmodifikationen.

Zusammenfassung

Die Manipulation von Genen in hämatopoetischen Stammzellen mit konventionellen Transgeneseansätzen kann zeitaufwändig, teuer und herausfordernd sein. Durch fortschritte In der Genom-Editing-Technologie und lentivirusvermittelten Transgen-Bereitstellungssystemen wird hier eine effiziente und wirtschaftliche Methode beschrieben, die Mäuse etabliert, bei denen Gene speziell in hämatopoetischen Stammzellen manipuliert werden. Lentiviren werden verwendet, um Cas9-extierende Linien-negative Knochenmarkzellen mit einer Guide-RNA (gRNA) zu transduzieren, die auf bestimmte Gene und ein rotes Fluoreszenz-Reporter-Gen (RFP) abzielt, dann werden diese Zellen in tödlich bestrahlte C57BL/6-Mäuse transplantiert. Mäuse, die mit Lentivirus transplantiert werden, die nicht zielgerichtete gRNA exdrücken, werden als Kontrollen verwendet. Die Transplantation von transduzierten hämatopoetischen Stammzellen wird durch zytometrische Durchflussanalyse von RFP-positiven Leukozyten peripheren Blutes bewertet. Mit dieser Methode können 90 % Transduktion von myeloischen Zellen und 70 % der Lymphzellen nach 4 Wochen nach der Transplantation erreicht werden. Genomische DNA wird aus RFP-positiven Blutzellen isoliert, und Teile der Ziel-Site-DNA werden durch PCR verstärkt, um die Genombearbeitung zu validieren. Dieses Protokoll bietet eine hochdurchsatzhohe Auswertung von hämatopoese-regulatorischen Genen und kann auf eine Vielzahl von Mauskrankheitsmodellen mit hämatopoetischer Zellbeteiligung erweitert werden.

Einleitung

Viele Studien in Hämatologie und Immunologie basieren auf der Verfügbarkeit von genetisch veränderten Mäusen, einschließlich konventioneller und bedingter transgener/knock-out-Mäuse, die hämatopoetische systemspezifische Cre-Treiber wie Mx1-Cre, Vav-Cre und andere verwenden. 1,2,3,4,5. Diese Strategien erfordern die Etablierung neuer Mausstämme, die zeitaufwändig und finanziell belastend sein können. Während revolutionäre Fortschritte in der Genom-Editing-Technologie die Erzeugung neuer Mausstämme in nur 3-4 Monaten mit dem entsprechenden technischen Know-how ermöglicht haben6,7,8,9 , viel mehr Zeit ist erforderlich, um die Mauskolonie zu verstärken, bevor Experimente durchgeführt werden. Darüber hinaus sind diese Verfahren kostspielig. Beispielsweise listet Jackson Laboratory den aktuellen Preis für Dieerzeugungsdienste für Knock-out-Mäuse auf 16.845 US-Dollar pro Stamm (Stand Dezember 2018) auf. Daher sind Methoden, die wirtschaftlicher und effizienter sind als herkömmliche murintransgene Ansätze, vorteilhafter.

Die clusterierte, regelmäßig interspacete kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR-assoziierte Protein-9-Technologie (CRISPR/Cas9) hat zur Entwicklung neuer Werkzeuge für eine schnelle und effiziente RNA-basierte, sequenzspezifische Genombearbeitung geführt. Ursprünglich als bakterieller adaptiver Immunmechanismus zur Zerstörung der eindringenden Pathogen-DNA entdeckt, wurde das CRISPR/Cas9-System als Werkzeug zur Steigerung der Wirksamkeit der Genombearbeitung in eukaryotischen Zellen und Tiermodellen eingesetzt. Eine Reihe von Ansätzen wurden verwendet, um CRISPR/Cas9-Maschinen in hämatopoetische Stammzellen zu übertragen (d. h. Elektroporation, Nukleofektion, Lipofektion, virale Abgabe und andere).

Hier wird ein Lentivirus-System eingesetzt, um Zellen zu transduzieren, da es in der Lage ist, Cas9-exezierende murine hämatopoetische Stammzellen effektiv zu infizieren und das Führungs-RNA-Expressionskonstrukt, Promotoren, regulatorische Sequenzen und Gene, die kodieren, zusammenzupacken. fluoreszierende Reporterproteine (z. B. GFP, RFP). Mit dieser Methode wurde eine Ex-vivo-Genbearbeitung von hämatopoetischen Stammzellen der Maus erreicht, gefolgt von einer erfolgreichen Rekonstitution des Knochenmarks bei tödlich bestrahlten Mäusen10. Der für diese Studie verwendete Lentivirus-Vektor drückt die Cas9- und GFP-Reportergene aus dem gemeinsamen Kern-EF1a-Promotor mit einer internen ribosomalen Einstiegsstelle vor dem Reportergen aus. Die Rna-Führungssequenz wird von einem separaten U6-Promotor exprimiert. Dieses System wird dann verwendet, um Insertions- und Deletionsmutationen in den Kandidaten-Klonhämatopoese-Treibergen Tet2 und Dnmt3a10zu erzeugen. Die Transduktionseffizienz bei dieser Methode ist jedoch relativ gering (ca. 5%-10%) aufgrund der großen Größe des Vektoreinsatzes (13 Kbp), die die Transduktionseffizienz und die Virentiter während der Produktion reduziert.

In anderen Studien wurde gezeigt, dass eine größere virale RNA-Größe sowohl die Virusproduktion als auch die Transduktionseffizienz negativ beeinflusst. Beispielsweise wird eine Erhöhung der Insert-Größe um 1 kb gemeldet, um die Virusproduktion um 50 % zu verringern, und die Transduktionseffizienz wird bei hämatopoetischen Stammzellen der Maus auf mehr als 50 % sinken11. Daher ist es vorteilhaft, die Größe des viralen Einsatzes so weit wie möglich zu reduzieren, um die Effizienz des Systems zu verbessern.

Dieses Manko kann durch den Einsatz von Transgenmäusen von Cas9 überwunden werden, bei denen das Cas9-Protein entweder konstitutiv oder induzierbar exprimiert wird12. Die konstitutiven CRISPR/Cas9-Knock-in-Mäuse drücken Cas9 Endonuklease und EGFP aus dem CAG-Promotor am Rosa26-Ort auf allgegenwärtige Weise aus. So kann ein Konstrukt mit sgRNA unter der Kontrolle des U6-Promoters und des RFP-Reportergens unter der Kontrolle des EF1a-Kernpromotors mit dem Lentivirus-Vektor geliefert werden, um eine Genombearbeitung zu erreichen. Mit diesem System wurden die Gene hämatopoetischer Stammzellen erfolgreich bearbeitet, was eine Transduktionseffizienz von 90 % zeigt. Somit bietet dieses Protokoll eine schnelle und effektive Methode, um Mäuse zu erstellen, bei denen gezielte Genmutationen in das hämatopoetische System eingeführt werden. Während unser Labor diese Art von Technologie hauptsächlich verwendet, um die Rolle der klonalen Hämatopoese in Herz-Kreislauf-Erkrankungen13,14,15zu untersuchen, ist es auch auf Studien hämatologischer bösartig16. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf die Analyse erweitert werden, wie DNA-Mutationen in HSPC andere Krankheits- oder Entwicklungsprozesse im hämatopoetischen System beeinflussen.

Um ein robustes Lentivirus-Vektorsystem zu etablieren, sind hohe Tikern-Virenbestände und optimierte Bedingungen für die Transduktion und Transplantation hämatopoetischer Zellen erforderlich. Im Protokoll werden Anweisungen zur Herstellung eines Hochtiter-Virusbestands in Abschnitt 1, zur Optimierung der Kulturbedingungen von murinen hämatopoetischen Stammzellen in Abschnitt 2, Methoden zur Knochenmarktransplantation in Abschnitt 3 und zur Bewertung der Engraftment in Abschnitt 4.

Protokoll

Alle Verfahren, die tierische Themen betreffen, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Virginia genehmigt.

1. Erzeugung und Reinigung von Lentiviruspartikeln

HINWEIS: Lentivirus-Partikel, die die optimierte Guide-RNA enthalten, können durch die detaillierten Protokolle von Addgene erzeugt werden: . Optimierte Methoden für High-Titer Lentivirus Vorbereitung und Lagerung werden an anderer Stelle diskutiert17,18. Kurz gesagt, Lentiviren werden durch Ko-Transfektion eines Lentivirus-Vektorplasmids, psPAX2 und pMD2.G in HEK 293T-Zellen produziert. Kulturüberstand wird bei 48 h nach der Transfektion gesammelt und durch Ultrazentrifugation konzentriert. Lentiviraltiter wird durch einen kommerziell erhältlichen qPCR-basierten Assay bestimmt. Dieses Verfahren sollte in einem Schrank der Biosicherheitsklasse II durchgeführt werden.

  1. Bereiten Sie eine 1:200 Lösung von Kollagen (0.0005%) in 1x PBS.
  2. Beschichten Sie eine 6-Well-Platte mit Kollagenlösung und brüten bei 37 °C, 5%CO2 für 30 min.
  3. Samen 293T-Zellen mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen pro Brunnen und inkubieren bei 37 °C, 5%CO2 für 2 h.
  4. Um die Mischung aus drei Transfektionsplasmiden für einen Brunnen vorzubereiten, kombinieren Sie 0,9 g Lentivirus-Vektor, 0,6 g psPAX2 und 0,3 g pMD2.G, und erreichen Dann ein Gesamtvolumen von 10 l durch Zugabe von deionisiertem Wasser. Passen Sie die Beträge entsprechend an die Anzahl der Brunnen an. Die Menge und das Verhältnis jedes Plasmids müssen möglicherweise weiter optimiert werden, um den Anforderungen der Forscher gerecht zu werden.
  5. 50 l 1x PBS und 5 l des verdünnten PEI MAX (1,0 mg/ml) vorsichtig in das Plasmidgemisch geben und 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren (Tabelle 1).
  6. 1 ml DMEM in die Mischung geben.
  7. Aspirieren Sie Medien aus der 6-Well-Platte, fügen Sie 1 ml Plasmid-Mischung hinzu und brüten bei 37 °C, 5%CO2 für 3 h.
  8. Ersetzen Sie die Medien durch 2 ml frisches DMEM und brüten Bei 37 °C, 5%CO2 für 24 h.
  9. 1 ml frisches DMEM hinzufügen und bei 37 °C, 5%CO2 für weitere 24 h inkubieren (Gesamtinkubationszeit 48 h).
  10. Übertragen Sie den Kulturüberstand in ein 50 ml Rohr und zentrifugieren bei 3.000 x g für 15 min, um frei schwebende Zellen zu entfernen.
  11. Filtern Sie den Überstand durch einen 0,45-m-Filter.
  12. Das Filtrat in Polypropylenzentrifugenrohre übertragen.
  13. Ultrazentrifuge bei 4 °C und 72.100 x g bei rmax für 3 h.
  14. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das weiße Pellet zurücklassen.
  15. Setzen Sie das Pellet mit 100 L serumfreiem hämatopoetischem Zellausdehnungsmedium ohne Belüftung aus.
  16. Bewahren Sie ein 10 L Aliquot auf, um den viralen Titer zu messen, und lagern Sie alle verbleibenden Aliquots bei -80 °C, bis dies erforderlich ist.
  17. Titrate das Virus mit einem qPCR-basierten Assay nach den Anweisungen des Herstellers mit dem 10 L viralen Aliquot.

2. Isolierung und Transduktion von Linien-negativen Zellen aus Demmausknochenmark (Abbildung 1A)

HINWEIS: In der Regel werden, um genügend Zellen zu isolieren, Paare von Tibias, Oberschenkelknochen und Humeri von jeder Maus geerntet werden. Becken- und Wirbelsäulenknochen können auch als Quelle von Linien-negativen Zellen geerntet werden.

  1. Isolierung von Knochenmarkzellen
    1. Euthanisieren Sie 8-10 Wochen alte männliche CRISPR/Cas9 Knock-in-Mäuse um 5% Isofluran, gefolgt von zervikalen Dislokation, dann desinfizieren sie ihre Haut mit 70% Ethanol.
    2. Mit sezierender Schere, machen Sie einen Querschnitt in der Haut direkt unter dem Brustkorb und schälen Sie die Haut in beide Richtungen, um die Beine und Arme auszusetzen.
    3. Trennen Sie vorsichtig die unteren Gliedmaßen vom Hüftknochen, indem Sie das Hüftgelenk verziehen. Schneiden Sie entlang des Oberschenkelknochenkopfes, um den Oberschenkelknochen vollständig aus der Hüfte zu entfernen. Dislozieren Sie das Knie und schneiden Sie am Gelenk, um den Oberschenkelknochen und die Tibia zu trennen, während die Knochenepiphyse intakt bleibt. Dislozieren Sie das Sprunggelenk und schälen Sie den Fuß und zusätzlichen Muskel.
    4. Mit einer Schere über die Schulter schneiden, um die oberen Gliedmaßen zu lösen. Dislozieren Sie die Schulter, dann am Ellenbogengelenk schneiden, um den Humerusknochen zu ernten.
    5. Verwenden Sie Zellulose-Faser-Tücher, um Muskeln vorsichtig von den Oberschenkelknochen, Tibias und Humeri zu entfernen. Ergreifen Sie zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen, um sicherzustellen, dass die Knochen während dieses Prozesses nicht brechen.
    6. Legen Sie die isolierten Knochen in ein 50 ml konisches Rohr mit RPMI und legen Sie sie auf Eis.
      HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten in einem Schrank der Biosicherheitsklasse II durchgeführt werden.
    7. Übertragen Sie die Knochen in eine sterile, 100 mm Kulturschale.
    8. Greifen Sie den Knochen mit stumpfer Zange, und mit sezierender Schere, sorgfältig schneiden beide Epiphysen.
      HINWEIS: Ein unzureichendes Schneiden führt zu einer unvollständigen Bündigung des Knochenmarks, während übermäßig aggressives Schneiden zu Zellverlust führt.
    9. Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit eiskaltem RPMI und spülen Sie mit einer 22 G Nadel das Knochenmark aus dem Schaft in eine neue 100-mm-Kulturschale.
      HINWEIS: Knochen werden weiß und durchscheinend, wenn die Knochenwelle gut gespült wurde. Wenn nicht, schneiden Sie die Knochenenden erneut und spülen Sie sie erneut.
    10. Nachdem das Knochenmark gesammelt wurde, machen Sie eine einzellige Suspension, indem Sie das Knochenmark mehrmals durch eine 10 ml Spritze mit einer 18 G Nadel passieren. Wiederholen Sie 10x, um eine einzellige Suspension zu gewährleisten.
    11. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-m-Zellsieb in ein 50 ml konisches Rohr.
    12. Zentrifuge bei 310 x g für 10 min bei 4 °C.
    13. Saugen Sie den Überstand an und setzen Sie die Zellpellets in einem geeigneten Volumen optimierten Trennpuffers für den folgenden Zelltrennungsprozess wieder aus.
  2. Isolierung und Lentivirus-Transduktion von Linien-negativen Zellen
    HINWEIS: Maus-Linie-negative Zellen werden aus dem Knochenmark von Cas9 transgene Mäuse3 oderanderen Stämmen von Mäusen isoliert, mit einem Lineage-Depletion-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Typischerweise machen Linien-negative Zellen 2%-5% der ganzen Knochenmarkzellen aus, und die Reinheit ist in der Regel größer als 90% nach der Isolierung. Die isolierten Linien-negativen Zellen werden in serumfreiem hämatopoetischem Zellexpansionsmedium kultiviert, ergänzt mit 20 ng/ml rekombinantem murineminem tPO und 50 ng/mL rekombinantem murinen SCF, dann mit dem Lentivirus-Vektor für 16 h bei einer Vielzahl von Infektion (MOI) = 100.
    1. Um Liniennegative Zellen zu isolieren, verwenden Sie das Futterzellen-Erschöpfungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    2. Nach der Isolierung setzen Sie die Linien-negativen Zellen in 1 ml serumfreiem hämatopoetischen Zellausdehnungsmedium wieder aus.
    3. Säen Sie die Zellen in eine 6-Well-Platte mit einer Dichte von 1,5 x 106 Zellen/ml (5 x 105 Lineage-negative Zellen/Maus).)
    4. Fügen Sie rekombinante murine TPO und SCF in Brunnen bei Endkonzentrationen von 20 ng/ml bzw. 50 ng/ml hinzu.
    5. Vorinkubationszellen bei 37 °C in 5%CO2 für 2 h.
    6. Lentivirus bei MOI = 100, 4 g/ml Polybren und Penicillin/Streptomycin in die Brunnen geben und bei 37 °C, 5%CO2 für 16-20 h(Abbildung 1B)brüten.
    7. Sammeln Sie am nächsten Tag die lentivirus-transduzierten Zellen in ein 15 ml kegelförmiges Rohr und Zentrifuge bei 300 g für 10 min.
    8. Sorgsam den Überstand ansaugen und das Pellet in 200 L RPMI pro Maus wieder aufsetzen. Bewahren Sie die Zellen bei RT bis zur Transplantation in Mäuse auf (Abschnitt 3).

3. Transplantation von transduzierten Zellen in tödlich bestrahlte Mäuse

  1. Legen Sie die Empfängermäuse am Tag der Knochenmarktransplantation in einen Acht-Scheiben-Kuchenkäfig und setzen Sie sie zwei Dosen Ganzkörperbestrahlung aus (550 Rad/Dosis, Gesamtdosis = 1100 Rad), wobei zwischen jeder Bestrahlungssitzung etwa 4 h liegen.
  2. Nach der zweiten Bestrahlungssitzung projizieren Sie transduzierte Liniennegative Zellen über den retroorbitalen Venenplexus (insgesamt 200 l) mit einer Insulinspritze in jede anästhesierte Empfängermaus (Abbildung 1C).
  3. Nach der Bestrahlung sollten Mäuse in sterilisierten Käfigen untergebracht und mit einer weichen Ernährung und Trinkwasser versorgt werden, das mit Antibiotika für 14 d ergänzt wird.
  4. Nach 3-4 Wochen nach der Knochenmarktransplantation analysieren Sie peripheres Blut, um die Transplantation von transducierten Spenderzellen zu überprüfen (Abschnitt 4).

4. Bewertung der Chimäre des peripheren Blutes

  1. Anästhesisieren Sie Mäuse mit 5% Isofluran und erhalten Sie eine Blutprobe aus einer retro-orbitalen Vene mit Kapillarröhren, und sammeln Sie sie in K2EDTA-Röhren (das Volumen in einem Kapillarrohr ist ausreichend für den folgenden Test).
  2. 20 L Blut aus den K2EDTA-Röhrchen in die 5 ml runden Polystyrol-Reagenzgläser übertragen und auf Eis legen.
  3. Fügen Sie 1,5 ml RBC-Lysepuffer hinzu, um rote Blutkörperchen zu lyse. 5 min auf Eis inkubieren.
  4. Um den Lysepuffer zu neutralisieren, waschen Sie Proben mit FACS-Puffer (1,5 ml/Probe).
  5. Zentrifuge bei 609 x g beir max für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
  6. Inkubieren Sie die Zellen mit einem Cocktail von monoklonalen Antikörpern (verdünnt in 100 L FACS Puffer/Probe) bei RT für 20 min im Dunkeln. Eine vollständige Liste der Antikörper finden Sie im Abschnitt Materialien oben.
  7. Waschen Sie die Zellen einmal mit FACS-Puffer (2 ml/Probe). Zentrifuge bei 609 x g beir max (1.800 U/min) für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand vollständig.
  8. Fixieren Sie die Zellen mit paraformaldehydhaltigem Fixationspuffer (100 l/Tube) für 10 min bei 4 °C.
  9. Einmal Zellen mit FACS-Puffer (3 ml/Probe) waschen. Zentrifuge bei 609 x g beir max (1.800 U/min) für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand vollständig.
  10. Setzen Sie das Pellet in 400 L FACS-Puffer aus.
  11. Halten Sie die Proben bei 4 °C bis zur Analyse durch Durchflusszytometrie.

Ergebnisse

Mit dem oben beschriebenen Protokoll wurden ca. 0,8-1,0 x 108 Knochenmarkzellen pro Maus erhalten. Die Anzahl der Linien-negativen Zellen, die wir erhalten, beträgt ungefähr 3 x 106 Zellen pro Maus. Typischerweise beträgt die Ausbeute von Knochenmark-Linien-negativen Zellen 4%-5% der Gesamtknochenmark-Kernzellen.

Der Chimäre der transduzierten Zellen (RFP-positiv) wird durch die Durchflusszytometrie des...

Diskussion

Der Vorteil dieses Protokolls ist die Schaffung von Tiermodellen, die spezifische Mutationen in hämatopoetischen Zellen in einer schnellen und äußerst kostengünstigen Weise im Vergleich zu herkömmlichen transgenen Ansätzen der Maus beherbergen. Es wurde festgestellt, dass diese Methode die Erzeugung von Mäusen mit hämatopoetischen Zellgenmanipulationen innerhalb eines Monats ermöglicht. Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll, die einer weiteren Prüfung bedürfen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

S. S. wurde von einem Postdoktorandenstipendium der American Heart Association 17POST33670076 unterstützt. K. W. wurde durch die NIH-Zuschüsse R01 HL138014, R01 HL141256 und R01 HL139819 unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim injectionTEVA0703-9526-01
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGEEXELINT26028general supply
293T cellsATCCCRL-3216--Cell line
APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21)BD Biosciences560599Antibodies
APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)BD Biosciences552094Antibodies
BD Luer-Lok disposable syringes, 10 mlBD309604general supply
BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA addedBD Bioscience365974general supply
BD Precisionglide needle, 18 GBD305195general supply
BD Precisionglide needle, 22 G BD305155general supply
BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7)Biolegend100752Antibodies
BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11)Biolegend100349Antibodies
Collagen from calf skinSigma-Aldrich9007-34-5general supply
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well Millipore SigmaCLS3471general supply
CRISPR/Cas9 knock-in miceThe Jackson Laboratory028555mouse
DietGel 76AClear H2O70-01-5022general supply
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucoseSigma AldrichD6429Medium
eBioscience 1X RBC Lysis BufferThermo fisher Scientific00-4333-57Solution
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture DishLife Sciences353003general supply
Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tubeLife Sciences352054general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific352098general supply
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate Life Science353046general supply
Fisherbrand microhematocrit capillary tubesThermo Fisher Scientific22-362566general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μmFisher Scientific22363548general supply
FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5)Invitrogen11-0042-85Antibodies
Fixation BufferBD Bioscience554655Solution
Guide-it Compete sgRNA Screening SystemsClontech632636Kit
Isothesia (Isoflurane) solutionHenry Schein29404Solution
Lenti-X qRT-PCR Titration Kit Takara631235Kit
Lineage Cell Depletion Kit, mouseMiltenyi Biotec130-090-858Kit
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mmMillipore SigmaSLHV004SLgeneral supply
PBS pH7.4 (1X)Gibco10010023Solution
PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)eBioscience25-1152-82Antibodies
PEI MAXPolysciences24765-1Solution
Penicillin-Streptomycin MixtureLonza17-602FSolution
PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)BD Biosciences560602Antibodies
pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP Addgene57823Plasmid
pMG2DAddgene12259Plasmid
Polybrene Infection/Transfection ReagentSigma AldrichTR-1003-GSolution
Polypropylene Centrifuge TubesBECKMAN COULTER326823general supply
psPAX2 Addgene12260Plasmid
RadDisk – Rodent Irradiator DiskBraintree ScientificIRD-P Mgeneral supply
Recombinant Murine SCFPeprotech250-03Solution
Recombinant Murine TPO Peprotech 315-14Solution
StemSpan SFEMSTEMCELL Technologies09600Solution
TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coliThermo fisher ScientificK457501Kit
Zombie Aqua Fixable Viability KitBioLegend423102Solution 

Referenzen

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