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Neste Artigo

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Resumo

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Resumo

Manipular genes em células-tronco hematopoiéticas usando abordagens convencionais de transgénese pode ser demorado, caro e desafiador. Beneficiando-se de avanços na tecnologia de edição de genoma e sistemas de entrega de transgenes mediados por Lentivirus, um método eficiente e econômico é descrito aqui que estabelece camundongos em que os genes são manipulados especificamente em células-tronco hematopoiéticas. Os Lentivirus são usados para transduce células de medula óssea de linhagem negativa de expressão de Cas9 com um RNA guia (gRNA) visando genes específicos e um gene de repórter de fluorescência vermelha (RFP), então essas células são transplantadas em camundongos C57BL/6 irradiados de forma letal. Camundongos transplantados com Lentivirus expressando gRNA sem direcionamento são usados como controles. O Engraftment de pilhas de haste hematopoietic transvadas é avaliado pela análise citométrica do fluxo de leucócito RFP-positivos do sangue periférico. Usando este método, a transdução de ~ 90% de pilhas Myeloid e de ~ 70% de pilhas lymphoid em 4 semanas após a transplantação pode ser conseguida. O ADN de Genomic é isolado dos glóbulos RFP-positivos, e as porções do ADN alvejado do local são amplificadas pelo PCR para validar a edição do genoma. Este protocolo fornece uma avaliação da elevado-produção de genes hematopoiesis-reguladores e pode ser estendido a uma variedade de modelos da doença do rato com participação da pilha hematopoietic.

Introdução

Muitos estudos em Hematologia e Imunologia dependem da disponibilidade de camundongos geneticamente modificados, incluindo camundongos convencionais e condicionais transgênicos/knock-out que utilizam condutores de CRE específicos do sistema hematopoiéticos, como Mx1-CRE, vav-CRE e outros 1,2,3,4,5. Essas estratégias exigem o estabelecimento de novas cepas de camundongo, que podem ser demoradas e onerosas financeiramente. Embora os avanços revolucionários na tecnologia de edição de genoma tenham possibilitado a geração de novas cepas de mouse em apenas 3-4 meses com a expertise técnica apropriada6,7,8,9 , muito mais tempo é exigido para amplificar a colônia do rato antes que os experimentos sejam perseguidos. Além disso, esses procedimentos são dispendiosos. Por exemplo, Jackson Laboratory lista o preço atual dos serviços de geração de ratos knock-out em $16845 por cepa (a partir de dezembro de 2018). Assim, métodos mais econômicos e eficientes do que as abordagens transgênicas murinas convencionais são mais vantajosos.

As repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas/tecnologia CRISPR associada à proteína 9 (CRISPR/Cas9) levaram ao desenvolvimento de novas ferramentas para a edição de genoma rápida e eficiente baseada em RNA, sequência específica. Originalmente descoberto como um mecanismo imunológico adaptativo bacteriano para destruir o DNA do patógeno invasor, o sistema CRISPR/Cas9 tem sido usado como uma ferramenta para aumentar a eficácia da edição do genoma em células eucarióticas e modelos animais. Várias abordagens foram empregadas para a transmissão de máquinas CRISPR/Cas9 em células-tronco hematopoiéticas (i.e., eletroporação, nucleofecção, lipofecção, parto viral e outros).

Aqui, um sistema de Lentivirus é empregado para transduce as células devido à sua capacidade de infectar eficazmente as células tronco hematopoiéticas murinas que expressam a Cas9 e empacotar juntas a construção de expressão de RNA guia, promotores, sequências regulatórias e genes que codificam proteínas de repórter fluorescente (i.e., GFP, RFP). Usando este método, a edição ex vivo do gene de pilhas de haste Hematopoietic do rato foi conseguida, seguida pela reconstituição bem sucedida da medula em ratos letalmente irradiados10. O vetor do Lentivirus empregado para este estudo expressa os genes do repórter de Cas9 e de GFP do promotor comum do núcleo EF1a com um local ribosomal interno da entrada a montante do gene do repórter. A sequência de RNA guia é expressa a partir de um promotor U6 separado. Este sistema é usado então para criar mutações da inserção e do apagamento nos genes clonal do excitador do hematopoiese do candidato Tet2 e Dnmt3a10. No entanto, a eficiência de transdução por esse método é relativamente baixa (~ 5%-10%) devido ao grande tamanho da pastilha vetorial (13 kbp) que limita a eficiência de transdução e reduz o titer de vírus durante a produção.

Em outros estudos, demonstrou-se que o maior tamanho do RNA viral afeta negativamente a produção de vírus e a eficiência de transdução. Por exemplo, um aumento de 1 KB no tamanho da pastilha é relatado para diminuir a produção de vírus em ~ 50%, e a eficiência de transdução diminuirá para mais de 50% nas células-tronco hematopoiéticas do mouse11. Assim, é vantajoso para reduzir o tamanho da inserção viral, tanto quanto possível para melhorar a eficiência do sistema.

Essa lacuna pode ser superada empregando-se camundongos transgênicos de CAS9, nos quais a proteína CAS9 é expressa de forma constitutiva ou induzível12. Os ratos de batida constitutivos de CRISPR/Cas9 expressam o endonuclease Cas9 e o EGFP do promotor de CAG no locus Rosa26 em uma maneira onipresente. Assim, uma construção com sgRNA o controle do promotor U6 e gene repórter RFP o controle do promotor EF1a núcleo pode ser entregue usando o vetor de Lentivirus para alcançar a edição do genoma. Com este sistema, os genes de células-tronco hematopoiéticas foram editados com sucesso, mostrando uma eficiência de transdução de ~ 90%. Assim, este protocolo fornece um método rápido e eficaz para criar os ratos em que as mutações genéticas alvejadas são introduzidas no sistema hematopoietic. Enquanto nosso laboratório está usando predominantemente este tipo de tecnologia para estudar o papel da hematopoiese clonal emprocessos de doença cardiovascular13,14,4,15, tambémé aplicável a estudos de hematológicos malignidade16. Além disso, este protocolo pode ser estendido à análise de como as mutações do ADN em HSPC impactam a outra doença ou processos desenvolventes no sistema hematopoietic.

Para estabelecer um sistema robusto do vetor do Lentivirus, os estoques virais do Titer elevado e as condições aperfeiçoadas para a transdução e a transplantação de pilhas hematopoietic são exigidos. No protocolo, são fornecidas instruções sobre a preparação de um estoque viral de alto título na seção 1, otimizando as condições de cultura de células-tronco hematopoiéticas murinas na seção 2, métodos para transplante de medula óssea na seção 3, e avaliando Engraftment na secção 4.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo sujeitos animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) da Universidade da Virgínia.

1. geração e purificação de partículas de Lentivirus

Nota: as partículas de Lentivirus contendo o RNA guia otimizado podem ser produzidas pelos protocolos detalhados fornecidos pela Addgene: < https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf) >. Os métodos aperfeiçoados para a preparação e o armazenamento do Lentivirus do elevado-Titer são discutidos em outra parte17,18. Em resumo, os Lentivirus são produzidos pelo co-transfection de um plasmídeo do vetor do lentivírus, psPAX2, e pMD2. G em pilhas de HEK 293T. O sobrenadante da cultura é coletado em 48 h borne-transfection e concentrado por ultracentlee. O titer de lentiviral é determinado por um ensaio qPCR-baseado comercialmente disponível. Este procedimento deve ser realizado em um gabinete de classe II de biossegurança.

  1. Prepare uma solução 1:200 de colágeno (0, 5%) em 1X PBS.
  2. Cubra uma placa de 6 poços com solução de colágeno e incubar a 37 ° c, 5% CO2 para ~ 30 min.
  3. Semente 293T células em uma densidade de 1 x 106 células por poço e incubar a 37 ° c, 5% co2 para ~ 2 h.
  4. Para preparar a mistura de três plasmídias de transfecção para um poço, combine 0,9 μg de vetor de Lentivirus, 0,6 μg de psPAX2, e 0,3 μg de pMD2. G, em seguida, atingir um volume total de 10 μL, adicionando água deionizada. Ajuste os montantes em conformidade, dependendo do número de poços. A quantidade e a relação de cada plasmídeo podem precisar de ser aperfeiçoadas mais para serir as necessidades dos investigadores.
  5. Adicione com cuidado 50 μL de 1X PBS e 5 μL do PEI MAX diluído (1,0 mg/mL) à mistura do plasmídeo e incubar por 15 minutos na temperatura ambiente (RT) (tabela 1).
  6. Adicione 1 mL de DMEM à mistura.
  7. Aspirar meios da placa do poço 6, adicionar 1 mL da mistura do plasmídeo, e incubar em 37 ° c, 5% CO2 para ~ 3 h.
  8. Substitua a mídia por 2 mL de DMEM fresco e incubar a 37 ° c, 5% CO2 por 24 h.
  9. Adicionar 1 mL de DMEM fresco e incubar a 37 ° c, 5% CO2 para um adicional de 24 h (tempo total de incubação é 48 h).
  10. Transfira o sobrenadante de cultura para um tubo de 50 mL e Centrifugue a 3.000 x g durante 15 min para remover quaisquer células flutuantes.
  11. Filtre o sobrenadante através de um filtro de 0,45 μm.
  12. Transfira o filtrado para tubos de centrífuga de polipropileno.
  13. Ultracentlee a 4 ° c e 72.100 x g a rmáx por 3 h.
  14. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando para trás a pelota branca.
  15. Ressuscitação da pelota com 100 μL de meio de expansão de células hematopoiéticas livres de soro sem aeração.
  16. Mantenha uma alíquota de 10 μL para medir o título viral e guarde todas as alíquotas restantes a-80 ° c até que seja necessário.
  17. Titrate o vírus com um ensaio baseado em qPCR de acordo com as instruções do fabricante utilizando a alíquota viral de 10 μL.

2. isolamento e transdução de células linhagem-negativas da medula óssea do camundongo (Figura 1a)

Observação: normalmente, para isolar células suficientes, pares de tíbias, fêmures e úmeros são colhidas de cada mouse. Ossos pélvicos e espinhais também podem ser colhidos como uma fonte de células de linhagem negativa.

  1. Isolamento de células da medula óssea
    1. Eutanizar 8-10 semanas de idade masculino CRISPR/Cas9 Knock-in camundongos por isoflurano 5% seguido de luxação cervical, em seguida, desinfectar sua pele com 70% etanol.
    2. Usando tesouras de dissecação, faça uma incisão transversal na pele logo abaixo do nervcage e descasque a pele distalmente em ambos os sentidos para expor as pernas e os braços.
    3. Separe cuidadosamente os membros inferiores do osso do quadril deslocalizando a articulação do quadril. Corte ao longo da cabeça do fêmur para remover o fêmur completamente do quadril. Deslocar o joelho e corte na articulação para separar o fêmur e tíbia, mantendo a epífise óssea intacta. Deslocar a articulação do tornozelo e descascar afastado o pé e músculo extra.
    4. Usando tesouras de dissecação, corte sobre o ombro para separar os membros superiores. Deslocar o ombro, em seguida, corte na articulação do cotovelo para colher o osso úmero.
    5. Use lenços de fibra de celulose para remover cuidadosamente os músculos dos fêmures, Tibias e humeri. Tome a precaução extra para assegurar-se de que os ossos não rompam durante este processo.
    6. Coloque os ossos isolados em um tubo cônico de 50 mL contendo RPMI e coloque no gelo.
      Nota: as seguintes etapas devem ser executadas em um gabinete de classe II de biossegurança.
    7. Transfira os ossos para um prato de cultura estéril de 100 mm.
    8. Segure o osso com fórceps sem corte, e usando tesouras de dissecação, corte cuidadosamente ambas as epífisas.
      Nota: um corte insuficiente levará a uma descarga incompleta da medula óssea, enquanto o corte excessivamente agressivo resultará em perda de células.
    9. Encha uma seringa de 10 mL com RPMI gelada e usando uma agulha de 22 G, lave a medula óssea do eixo em um novo prato de cultura de 100 mm.
      Nota: os ossos se tornarão brancos e translúcidos se o eixo ósseo tiver sido bem lavado. Se não, re-cortar as extremidades do osso e lave novamente.
    10. Depois de toda a medula óssea ter sido coletada, faça uma suspensão de uma única célula passando a medula óssea várias vezes através de uma seringa de 10 mL com uma agulha de 18 G. Repita 10x para assegurar uma suspensão da único-pilha.
    11. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm em um tubo cônico de 50 mL.
    12. Centrifugador a 310 x g durante 10 min a 4 ° c.
    13. Aspirar o sobrenadante e suspender as pelotas de células em um volume adequado de buffer de separação otimizado para o processo de separação de células a seguir.
  2. Isolamento e transdução de Lentivirus de células linhagem-negativas
    Nota: as células de linhagem negativa do rato são isoladas da medula óssea de ratos transgênicos de Cas93, ou outras estirpes de camundongos, utilizando um kit de depleção de linhagem de acordo com as instruções do fabricante. Tipicamente, as células linhagem-negativas respondem por 2%-5% das células nucleadas da medula óssea inteira, e a pureza é geralmente maior que 90% após o isolamento. As pilhas linhagem-negativas isoladas são cultivadas no meio hematopoietic soro-livre da expansão da pilha suplementado com 20 ng/ml TPO murino de recombinação e 50 ng/ml de Murina recombinante SCF, então transado com o vetor do Lentivirus por 16 h em um multiplicidade de infecção (MOI) = 100.
    1. Para isolar células de linhagem negativa, use o kit de depleção de células de linhagem de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Depois que o isolamento ressuscitava as células linhagem-negativas em 1 mL de meio de expansão de células hematopoiéticas sem soro.
    3. Semente as células em uma placa de 6 poços em uma densidade de 1,5 x 106 células/ml (5 x 105 linhagem-células negativas/mouse.)
    4. Adicionar TPO murino recombinante e SCF em poços em concentrações finais de 20 ng/mL e 50 ng/mL, respectivamente.
    5. Pré-incubar células a 37 ° c em 5% CO2 para ~ 2 h.
    6. Adicionar Lentivirus em MOI = 100, 4 μg/mL de polibreno, e penicilina/estreptomicina aos poços e incubar a 37 ° c, 5% CO2 para 16-20 h (Figura 1b).
    7. No dia seguinte, colete as células transviadas de Lentivirus em um tubo cônico de 15 mL e centrifugue a 300 g por 10 min.
    8. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e suspender a pelota em 200 μL de RPMI por rato. Mantenha as células em RT até o transplante em camundongos (seção 3).

3. transplante de células transtróficadas em camundongos irradiados letalmente

  1. No dia do transplante de medula óssea, coloque camundongos destinatários em uma gaiola de torta de oito fatias e expô-los a duas doses de irradiação do corpo inteiro (550 RAD/dose, dose total = 1100 RAD), com aproximadamente 4 h entre cada sessão de irradiação.
  2. Após a segunda sessão de irradiação, injetar células de linhagem-negativas transdoadas a cada rato receptor anestesiado através do plexo da veia retroorbital (200 μL no total) utilizando uma seringa de insulina (Figura 1C).
  3. Após a irradiação, os camundongos devem ser alojados em gaiolas esterilizadas e fornecidos com uma dieta macia e água potável suplementada com antibióticos para 14 d.
  4. Em 3-4 semanas após a transplantação da medula, analise o sangue periférico para verific para ver se há o Engraftment de pilhas doadoras transadas (seção 4).

4. avaliando o quimerismo do sangue periférico

  1. Anestesiar camundongos com isoflurano a 5% e obter uma amostra de sangue de uma veia retro-orbital usando tubos capilares, e coletá-lo em K2tubos de EDTA (o volume em um tubo capilar é suficiente para o seguinte ensaio).
  2. Transfira 20 μL de sangue dos tubos K2EDTA para os tubos de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL e Coloque gelo.
  3. Adicionar 1,5 mL de tampão de lise de RBC para lyse glóbulos vermelhos. Incubar por 5 min no gelo.
  4. Para neutralizar o tampão de Lise, lave amostras com tampão FACS (1,5 mL/Sample).
  5. Centrifugar a 609 x g a rmáx durante 5 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante.
  6. Incubar as células com um coquetel de anticorpos monoclonais (diluído em 100 μL de tampão FACS/amostra) em RT por 20 min no escuro. Uma lista completa de anticorpos é fornecida na seção de materiais acima.
  7. Lave as células uma vez com o tampão FACS (2 mL/amostra). Centrifugador em 609 x g em rmáximo (1.800 rpm) para 5 minutos em 4 ° c. Descarte o sobrenadante completamente.
  8. Fixar as células com paraformaldeído contendo tampão de fixação (100 μL/tubo) por 10 min a 4 ° c.
  9. Lave as células uma vez com o tampão FACS (3 mL/amostra). Centrifugador em 609 x g em rmáximo (1.800 rpm) para 5 minutos em 4 ° c. Descarte o sobrenadante completamente.
  10. Suspenda o pellet em 400 μL de tampão FACS.
  11. Mantenha as amostras a 4 ° c até a análise por citometria de fluxo.

Resultados

Usando o protocolo acima descrito, foram obtidas aproximadamente 0,8-1,0 x 108 células de medula óssea por rato. O número de células de linhagem negativa que obtemos é de aproximadamente 3 x 106 células por mouse. Tipicamente, o rendimento de células de linhagem negativa da medula óssea é de 4%-5% do total de células nucleares da medula óssea.

O chimerismo das células transvadas (RFP-positivas) ...

Discussão

A vantagem deste protocolo é a criação de modelos animais que abriam mutações específicas em células hematopoiéticas de forma rápida e altamente rentável em comparação com as abordagens transgênicas convencionais do camundongo. Verificou-se que esta metodologia possibilita a geração de camundongos com manipulações de células hematopoiéticas dentro de 1 mês. Há diversas etapas críticas neste protocolo que exigem uma consideração mais adicional.

Triagem da sequên...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

S. S. foi apoiado por uma associação americana do coração pós-doutorado Fellowship 17POST33670076. K. W. foi apoiado por concessões de NIH R01 HL138014, R01 HL141256, e R01 HL139819.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim injectionTEVA0703-9526-01
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGEEXELINT26028general supply
293T cellsATCCCRL-3216--Cell line
APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21)BD Biosciences560599Antibodies
APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)BD Biosciences552094Antibodies
BD Luer-Lok disposable syringes, 10 mlBD309604general supply
BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA addedBD Bioscience365974general supply
BD Precisionglide needle, 18 GBD305195general supply
BD Precisionglide needle, 22 G BD305155general supply
BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7)Biolegend100752Antibodies
BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11)Biolegend100349Antibodies
Collagen from calf skinSigma-Aldrich9007-34-5general supply
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well Millipore SigmaCLS3471general supply
CRISPR/Cas9 knock-in miceThe Jackson Laboratory028555mouse
DietGel 76AClear H2O70-01-5022general supply
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucoseSigma AldrichD6429Medium
eBioscience 1X RBC Lysis BufferThermo fisher Scientific00-4333-57Solution
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture DishLife Sciences353003general supply
Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tubeLife Sciences352054general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific352098general supply
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate Life Science353046general supply
Fisherbrand microhematocrit capillary tubesThermo Fisher Scientific22-362566general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μmFisher Scientific22363548general supply
FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5)Invitrogen11-0042-85Antibodies
Fixation BufferBD Bioscience554655Solution
Guide-it Compete sgRNA Screening SystemsClontech632636Kit
Isothesia (Isoflurane) solutionHenry Schein29404Solution
Lenti-X qRT-PCR Titration Kit Takara631235Kit
Lineage Cell Depletion Kit, mouseMiltenyi Biotec130-090-858Kit
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mmMillipore SigmaSLHV004SLgeneral supply
PBS pH7.4 (1X)Gibco10010023Solution
PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)eBioscience25-1152-82Antibodies
PEI MAXPolysciences24765-1Solution
Penicillin-Streptomycin MixtureLonza17-602FSolution
PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)BD Biosciences560602Antibodies
pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP Addgene57823Plasmid
pMG2DAddgene12259Plasmid
Polybrene Infection/Transfection ReagentSigma AldrichTR-1003-GSolution
Polypropylene Centrifuge TubesBECKMAN COULTER326823general supply
psPAX2 Addgene12260Plasmid
RadDisk – Rodent Irradiator DiskBraintree ScientificIRD-P Mgeneral supply
Recombinant Murine SCFPeprotech250-03Solution
Recombinant Murine TPO Peprotech 315-14Solution
StemSpan SFEMSTEMCELL Technologies09600Solution
TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coliThermo fisher ScientificK457501Kit
Zombie Aqua Fixable Viability KitBioLegend423102Solution 

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