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  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Les protocoles décrits pour l'édition génomique très efficace des cellules hématopoïétiques et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) par le système CRISPR/Cas9 pour développer rapidement des systèmes de modèle de souris avec des modifications génétiques hématopoïétiques spécifiques au système.

Résumé

La manipulation des gènes dans les cellules souches hématopoïétiques à l'aide d'approches transgenèses conventionnelles peut prendre beaucoup de temps, être coûteuse et difficile. Bénéficiant des progrès de la technologie d'édition du génome et des systèmes d'administration de transgènes médiés par lentivirus, une méthode efficace et économique est décrite ici qui établit des souris dans lesquelles les gènes sont manipulés spécifiquement dans les cellules souches hématopoïétiques. Les lentivirus sont utilisés pour transduire les cellules de moelle osseuse cas9-exprimant esfilées par lignée avec un ARN guide (gRNA) ciblant des gènes spécifiques et un gène de reporter de fluorescence rouge (RP), puis ces cellules sont transplantées dans des souris C57BL/6 mortellement irradiées. Les souris transplantées avec le lentivirus exprimant le gRNA non-ciblage sont employées comme contrôles. L'engraftment des cellules souches hématopoïétiques transducées sont évalués par l'analyse cytométrique de flux des leucocytes RFP-positifs du sang périphérique. En utilisant cette méthode, la transduction de 90 % des cellules myéloïdes et 70 % des cellules lymphoïdes à 4 semaines après la transplantation peuvent être réalisées. L'ADN génomique est isolé des cellules sanguines RFP-positives, et des parties de l'ADN du site ciblé sont amplifiées par PCR pour valider l'édition du génome. Ce protocole fournit une évaluation à haut débit des gènes hématopoiesis-régulateurs et peut être étendu à une série de modèles de maladie de souris avec la participation hématopoietic de cellules.

Introduction

Beaucoup d'études en hématologie et immunologie s'appuient sur la disponibilité de souris génétiquement modifiées, y compris les souris transgéniques/knock-out conventionnelles et conditionnelles qui utilisent des pilotes de Cre hématopoïétiques spécifiques au système tels que Mx1-Cre, Vav-Cre, et d'autres 1,2,3,4,5. Ces stratégies exigent l'établissement de nouvelles souches de souris, qui peuvent prendre beaucoup de temps et être financièrement lourdes. Alors que les progrès révolutionnaires dans la technologie d'édition du génome ont permis la génération de nouvelles souches de souris en aussi peu que 3-4 mois avec l'expertise technique appropriée6,7,8,9 , beaucoup plus de temps est nécessaire pour amplifier la colonie de souris avant que les expériences soient poursuivies. De plus, ces procédures sont coûteuses. Par exemple, Jackson Laboratory énumère le prix actuel des services de génération de souris knock-out à 16 845 $ par souche (en décembre 2018). Ainsi, les méthodes qui sont plus économiques et efficaces que les approches transgéniques murine sinais classiques sont plus avantageuses.

La technologie des protéines 9 (CRISPR/Cas9) associées à des répétitions palindromic courtes et interspatiales a conduit au développement de nouveaux outils pour une édition rapide et efficace du génome à base d'ARN et spécifique à la séquence. Découvert à l'origine comme mécanisme immunitaire adaptatif bactérien pour détruire l'ADN pathogène envahissant, le système CRISPR/Cas9 a été utilisé comme un outil pour augmenter l'efficacité de l'édition du génome dans les cellules eucaryotes et les modèles animaux. Un certain nombre d'approches ont été utilisées pour transmettre des machines CRISPR/Cas9 dans les cellules souches hématopoïétiques (c.-à-d. électropoction, nucléofection, lipofection, livraison virale, et d'autres).

Ici, un système de lentivirus est employé pour transduire des cellules en raison de sa capacité à infecter effectivement Cas9-exprimant les cellules souches hématopoïétiques murines et emballent ensemble la construction d'expression d'ARN de guide, les promoteurs, les séquences réglementaires, et les gènes qui codent protéines fluorescentes de journaliste (c.-à-d., GFP, DP). En utilisant cette méthode, l'édition de gènes ex vivo des cellules souches hématopoïétiques de souris a été réalisée, suivie d'une reconstitution réussie de la moelle osseuse chez des souris mortellement irradiées10. Le vecteur de lentivirus utilisé pour cette étude exprime les gènes de journaliste Cas9 et GFP du promoteur commun de noyau EF1a avec un site d'entrée ribosomal interne en amont du gène de journaliste. La séquence d'ARN guide est exprimée à partir d'un promoteur U6 séparé. Ce système est ensuite utilisé pour créer des mutations d'insertion et de suppression dans les gènes de pilote d'hématopoiesis clonal candidat Tet2 et Dnmt3a10. Cependant, l'efficacité de la transduction par cette méthode est relativement faible (-5%-10%) en raison de la grande taille de l'insert vectoriel (13 Kbp) qui limite l'efficacité de la transduction et réduit le taquet de virus pendant la production.

Dans d'autres études, il a été démontré que la taille plus importante de l'ARN viral affecte négativement à la fois la production de virus et l'efficacité de la transduction. Par exemple, une augmentation de 1 kb de la taille de l'insert est signalée pour diminuer la production de virus de 50%, et l'efficacité de la transduction diminuera à plus de 50% dans les cellules souches hématopoïétiques de souris11. Ainsi, il est avantageux de réduire la taille de l'insert viral autant que possible pour améliorer l'efficacité du système.

Cette lacune peut être surmontée en employant des souris transgéniques Cas9, dans lesquelles la protéine Cas9 s'exprime d'une manière constitutive ou inductible12. Les souris constitutives CRISPR/Cas9 se heurtent à l'endodocléase Cas9 et à l'EGFP du promoteur du CAG au locus Rosa26 d'une manière omniprésente. Ainsi, une construction avec sgRNA sous le contrôle du promoteur U6 et du gène journaliste de La DP sous le contrôle du promoteur DE base EF1a peut être livrée à l'aide du vecteur de lentivirus pour réaliser l'édition du génome. Avec ce système, les gènes des cellules souches hématopoïétiques ont été modifiés avec succès, montrant une efficacité de transduction de 90%. Ainsi, ce protocole fournit une méthode rapide et efficace pour créer des souris dans lesquelles des mutations génétiques ciblées sont introduites dans le système hématopoïétique. Alors que notre laboratoire utilise principalement ce type de technologie pour étudier le rôle de l'hématopoiesis clonal dans les processus de maladies cardiovasculaires13,14,15, il est également applicable aux études de l'hématologie malignité16. En outre, ce protocole peut être étendu à l'analyse de la façon dont les mutations de l'ADN dans HSPC impact d'autres maladies ou des processus de développement dans le système hématopoïétique.

Pour établir un système vectoriel de lentivirus robuste, des stocks viraux élevés de titer et des conditions optimisées pour la transduction et la transplantation des cellules hématopoïétiques sont exigés. Dans le protocole, des instructions sont fournies sur la préparation d'un stock viral de haute titer dans la section 1, l'optimisation des conditions de culture des cellules souches hématopoïétiques murines dans la section 2, les méthodes de transplantation de moelle osseuse dans la section 3, et l'évaluation l'engraftment dans la section 4.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université de Virginie.

1. Génération et purification des particules de lentivirus

REMARQUE : Les particules de lentivirus contenant l'ARN guide optimisé peuvent être produites par les protocoles détaillés fournis par Addgene : 'lt;https://media.addgene.org/cms/files/Zhang'lab-LentiCRISPR'library.protocol.pdf) Des méthodes optimisées pour la préparation et le stockage de lentivirus à haut-titer sont discutées ailleurs17,18. En bref, les lentivirus sont produits par co-transfection d'un plasmide vectoriel lentivirus, psPAX2, et pMD2.G dans les cellules HEK 293T. Le supernatant culturel est collecté à 48 h après la transfection et concentré par ultracentrifugation. Le téter lentiviral est déterminé par un jeu d'enfant disponible dans le commerce à base de qPCR. Cette procédure doit être effectuée dans un coffret de classe II de biosécurité.

  1. Préparer une solution 1:200 de collagène (0,0005%) en 1x PBS.
  2. Enrober une assiette de 6 puits avec une solution de collagène et incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant 30 min.
  3. Seed 293T cellules à une densité de 1 x 106 cellules par puits et incuber à 37 oC, 5% CO2 pour 2 h.
  4. Pour préparer le mélange de trois plasmides de transfection pour un puits, combinez 0,9 g de vecteur de lentivirus, 0,6 g de psPAX2 et 0,3 g de pMD2.G, puis atteignez un volume total de 10 l en ajoutant de l'eau déionisée. Ajuster les montants en conséquence en fonction du nombre de puits. La quantité et le ratio de chaque plasmide peuvent devoir être optimisés pour répondre aux besoins des chercheurs.
  5. Ajouter délicatement 50 oL de 1 x PBS et 5 l du MAX dilué de l'Ile-du-Prince-Édouard (1,0 mg/mL) au mélange de plasmide et incuber pendant 15 min à température ambiante (RT) (tableau 1).
  6. Ajouter 1 ml de DMEM au mélange.
  7. Aspirer le support de la plaque de 6 puits, ajouter 1 ml de mélange de plasmide, et incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pour 3 h.
  8. Remplacer les supports par 2 ml de DMEM frais et couver à 37 oC, 5 % de CO2 pour 24 h.
  9. Ajouter 1 ml de DMEM frais et incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pour 24 h supplémentaires (temps d'incubation total de 48 h).
  10. Transférer le supernatant de culture dans un tube de 50 ml et une centrifugeuse à 3 000 x g pendant 15 min pour enlever les cellules flottantes.
  11. Filtrer le supernatant à l'intermédiaire d'un filtre de 0,45 m.
  12. Transférer le filtrate dans des tubes de centrifugeuse en polypropylène.
  13. Ultracentrifugeàeur à 4 oC et 72 100 x g à rmax pendant 3 h.
  14. Aspirez soigneusement le supernatant, en laissant derrière lui la pastille blanche.
  15. Resuspendre la pastille avec 100 l de milieu d'expansion hématopoïétique sans sérum sans aération.
  16. Conserver un aliquot de 10 l pour mesurer le titre viral et stocker tous les aliquots restants à -80 oC jusqu'à ce qu'il soit nécessaire.
  17. Titrate le virus avec un analyse qPCR-basé selon les instructions du fabricant en utilisant l'aliquot viral de 10 L.

2. Isolement et transduction des cellules négrées de lignée de la moelle osseuse de la souris (Figure 1A)

REMARQUE : Typiquement, pour isoler assez de cellules, des paires de tibias, de fémurs, et d'huméri sont moissonnés de chaque souris. Les os pelviens et spinaux peuvent également être récoltés comme source de cellules négrées de lignée.

  1. Isolement des cellules de moelle osseuse
    1. Euthanasier les souris mâles CRISPR/Cas9 de 8 à 10 semaines par 5 % d'isoflurane suivie d'une luxation cervicale, puis désinfecter leur peau avec 70 % d'éthanol.
    2. À l'aide de ciseaux disséquants, faire une incision transversale dans la peau juste en dessous de la cage thoracique et peler la peau distalement dans les deux sens pour exposer les jambes et les bras.
    3. Séparez soigneusement les membres inférieurs de l'os de la hanche en disloquant l'articulation de la hanche. Couper le long de la tête du fémur pour enlever le fémur complètement de la hanche. Déloger le genou et couper à l'articulation pour séparer le fémur et le tibia, tout en gardant l'épiphyse osseuse intacte. Déloger l'articulation de la cheville et éplucher le pied et le muscle supplémentaire.
    4. À l'aide de ciseaux disséquants, couper sur l'épaule pour détacher les membres supérieurs. Déloger l'épaule, puis couper à l'articulation du coude pour récolter l'os de l'humérus.
    5. Utilisez des lingettes en fibre de cellulose pour enlever soigneusement les muscles des fémurs, des tibias et des huméri. Prenez des précautions supplémentaires pour vous assurer que les os ne se cassent pas au cours de ce processus.
    6. Placez les os isolés dans un tube conique de 50 ml contenant le RPMI, et placez-les sur la glace.
      REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées dans un cabinet de classe II de biosécurité.
    7. Transférer les os dans un plat stérile de culture de 100 mm.
    8. Saisir l'os avec des forceps émoussés, et à l'aide de ciseaux disséquants, couper soigneusement les deux épiphyses.
      REMARQUE : Une coupe insuffisante entraînera une chasse d'eau incomplète de la moelle osseuse, tandis que la coupe trop agressive entraînera une perte cellulaire.
    9. Remplissez une seringue de 10 ml de RPMI glacée et utilisez une aiguille de 22 G, rincer la moelle osseuse de l'arbre dans un nouveau plat de culture de 100 mm.
      REMARQUE : Les os deviendront blancs et translucides si l'arbre osseux a été bien rincé. Si ce n'est pas le cas, couper à nouveau les extrémités osseuses et rincer à nouveau.
    10. Après que toute la moelle osseuse a été recueillie, faire une suspension à une cellule en passant la moelle osseuse à plusieurs reprises à travers une seringue de 10 ml avec une aiguille de 18 G. Répétez 10x pour assurer une suspension à une cellule.
    11. Filtrer la suspension des cellules à travers une passoire cellulaire de 70 m dans un tube conique de 50 ml.
    12. Centrifugeuse à 310 x g pendant 10 min à 4 oC.
    13. Aspirez le supernatant et suspendez les granulés de cellules dans un volume approprié de tampon de séparation optimisé pour le processus de séparation cellulaire suivant.
  2. Transduction d'isolement et de lentivirus des cellules négrées de lignée
    REMARQUE : Les cellules négatives de lignée de souris sont isolées de la moelle osseuse des souris transgéniques Cas93, ou d'autres souches de souris, en utilisant un kit d'épuisement de lignée selon les instructions du fabricant. Typiquement, les cellules lignée-négatives représentent 2%-5% des cellules nucléées entières de moelle, et la pureté est habituellement plus grande que 90% après isolement. Les cellules lignées-négatives isolées sont cultivées dans le milieu hématopoietic d'expansion hématopoietic sérique-libre complété avec le TPO murine recombinant de 20 ng/mL et le SCF murine recombinant de 50 ng/mL, puis transduiséavec le vecteur de lentivirus pendant 16 h à une multiplicité de (MOI) 100.
    1. Pour isoler les cellules négatives de la lignée, utilisez le kit d'épuisement des cellules de lignée selon les instructions du fabricant.
    2. Après isolement resuspend les cellules lignée-négatives dans 1 ml du milieu d'expansion hématopoïétique sérique-libre.
    3. Ensemencer les cellules dans une plaque de 6 puits à une densité de 1,5 x 106 cellules/mL (5 x 10 5 cellules/souris négâtde lignée.)
    4. Ajouter le TPO murine recombinant et le SCF dans les puits à des concentrations finales de 20 ng/mL et 50 ng/mL, respectivement.
    5. Pré-incubent les cellules à 37 oC dans 5 % de CO2 pour 2 h.
    6. Ajouter le lentivirus au MOI à 100, 4 g/mL de polybrene, et la pénicilline/streptomycine aux puits et incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pour 16-20 h (figure 1B).
    7. Le lendemain, recueillir les cellules transductrices de lentivirus dans un tube conique de 15 ml et une centrifugeuse à 300 g pendant 10 min.
    8. Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille dans 200 L de RPMI par souris. Maintenir les cellules à RT jusqu'à la transplantation chez les souris (section 3).

3. Transplantation de cellules transductées en souris mortellement irradiées

  1. Le jour de la transplantation de moelle osseuse, placez les souris réceptrices dans une cage à tarte à huit tranches et exposez-les à deux doses d'irradiation du corps entier (550 Rad/dose, dose totale de 1100 Rad), avec environ 4 h entre chaque séance d'irradiation.
  2. Après la deuxième séance d'irradiation, injectez des cellules négrées de lignée-négatives à chaque souris bénéficiaire anesthésiée par l'intermédiaire du plexus de veine rétro-orbital (200 l au total) à l'aide d'une seringue à insuline (Figure 1C).
  3. Après l'irradiation, les souris doivent être logées dans des cages stérilisées et équipées d'un régime alimentaire doux et d'eau potable complétée par des antibiotiques pendant 14 d.
  4. À 3-4 semaines après la transplantation de moelle, analysez le sang périphérique pour vérifier l'engraftment des cellules transductrices de distributeur (section 4).

4. Évaluer le chimérisme du sang périphérique

  1. Anesthésiez les souris avec 5% d'isoflurane et obtenez un échantillon de sang à partir d'une veine rétro-orbitale à l'aide de tubes capillaires, et collectez-les en tubes K2EDTA (le volume dans un tube capillaire est suffisant pour l'analyse suivante).
  2. Transférer 20 l l de sang des tubes K2EDTA dans les tubes à essai en polystyrène à fond rond de 5 ml, et mettre sur la glace.
  3. Ajouter 1,5 ml de tampon de lyse RBC pour lyser les globules rouges. Incuber 5 min sur glace.
  4. Pour neutraliser le tampon de lyse, laver les échantillons avec un tampon FACS (1,5 mL/échantillon).
  5. Centrifugeuse à 609 x g à rmax pendant 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
  6. Incuber les cellules avec un cocktail d'anticorps monoclonaux (dilués dans un tampon/échantillon FACS de 100 L) à RT pendant 20 minutes dans l'obscurité. Une liste complète des anticorps est fournie dans la section Matériaux ci-dessus.
  7. Laver les cellules une fois avec un tampon FACS (2 ml/échantillon). Centrifugeuse à 609 x g à rmax (1 800 tr/min) pendant 5 min à 4 oC. Jeter complètement le supernatant.
  8. Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde contenant un tampon de fixation (100 l/tube) pendant 10 min à 4 oC.
  9. Laver les cellules une fois avec le tampon FACS (3 mL/échantillon). Centrifugeuse à 609 x g à rmax (1 800 tr/min) pendant 5 min à 4 oC. Jeter complètement le supernatant.
  10. Suspendre la pastille dans 400 l de tampon FACS.
  11. Conserver les échantillons à 4 oC jusqu'à ce qu'ils soient analysés par cytométrie d'écoulement.

Résultats

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, environ 0.8-1.0 x 108 cellules de moelle par souris ont été obtenues. Le nombre de cellules négatives à la lignée que nous obtenons est d'environ 3 x 106 cellules par souris. Typiquement, le rendement des cellules de lignée de moelle est 4%-5% de celui des cellules nucléaires totales de moelle.

Le chimérime des cellules transductrices (RFP-positif) est é...

Discussion

L'avantage de ce protocole est la création de modèles animaux abritant des mutations spécifiques dans les cellules hématopoïétiques d'une manière rapide et très rentable par rapport aux approches transgéniques classiques de souris. Il a été constaté que cette méthodologie permet la génération de souris avec des cellules hématopoïétiques gènes-manipulations dans un délai de 1 mois. Il y a plusieurs étapes critiques dans ce protocole qui nécessitent un examen plus approfondi.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

S. S. a été soutenu par une bourse postdoctorale de l'American Heart Association 17POST33670076. K. W. a reçu l'appui des NIH pour les subventions R01 HL138014, R01 HL141256 et R01 HL139819.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim injectionTEVA0703-9526-01
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGEEXELINT26028general supply
293T cellsATCCCRL-3216--Cell line
APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21)BD Biosciences560599Antibodies
APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)BD Biosciences552094Antibodies
BD Luer-Lok disposable syringes, 10 mlBD309604general supply
BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA addedBD Bioscience365974general supply
BD Precisionglide needle, 18 GBD305195general supply
BD Precisionglide needle, 22 G BD305155general supply
BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7)Biolegend100752Antibodies
BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11)Biolegend100349Antibodies
Collagen from calf skinSigma-Aldrich9007-34-5general supply
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well Millipore SigmaCLS3471general supply
CRISPR/Cas9 knock-in miceThe Jackson Laboratory028555mouse
DietGel 76AClear H2O70-01-5022general supply
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucoseSigma AldrichD6429Medium
eBioscience 1X RBC Lysis BufferThermo fisher Scientific00-4333-57Solution
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture DishLife Sciences353003general supply
Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tubeLife Sciences352054general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific352098general supply
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate Life Science353046general supply
Fisherbrand microhematocrit capillary tubesThermo Fisher Scientific22-362566general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μmFisher Scientific22363548general supply
FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5)Invitrogen11-0042-85Antibodies
Fixation BufferBD Bioscience554655Solution
Guide-it Compete sgRNA Screening SystemsClontech632636Kit
Isothesia (Isoflurane) solutionHenry Schein29404Solution
Lenti-X qRT-PCR Titration Kit Takara631235Kit
Lineage Cell Depletion Kit, mouseMiltenyi Biotec130-090-858Kit
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mmMillipore SigmaSLHV004SLgeneral supply
PBS pH7.4 (1X)Gibco10010023Solution
PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)eBioscience25-1152-82Antibodies
PEI MAXPolysciences24765-1Solution
Penicillin-Streptomycin MixtureLonza17-602FSolution
PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)BD Biosciences560602Antibodies
pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP Addgene57823Plasmid
pMG2DAddgene12259Plasmid
Polybrene Infection/Transfection ReagentSigma AldrichTR-1003-GSolution
Polypropylene Centrifuge TubesBECKMAN COULTER326823general supply
psPAX2 Addgene12260Plasmid
RadDisk – Rodent Irradiator DiskBraintree ScientificIRD-P Mgeneral supply
Recombinant Murine SCFPeprotech250-03Solution
Recombinant Murine TPO Peprotech 315-14Solution
StemSpan SFEMSTEMCELL Technologies09600Solution
TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coliThermo fisher ScientificK457501Kit
Zombie Aqua Fixable Viability KitBioLegend423102Solution 

Références

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