JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

التعميم RNAs (circRNAs) هي غير الترميز RNAs التي قد يكون لها ادوار في التنظيم عبر المعاقين والتوسط التفاعلات بين البروتينات. بعد تقييم المعلمات المختلفة لبناء مكتبات التسلسل circRNA ، تم تجميع بروتوكول باستخدام مجموع تقطعت بهم السبل الجيش النيبالي اعداد المكتبة مع RNase R ما قبل العلاج ويرد هنا.

Abstract

التعميم RNAs (circRNAs) هي فئة من غير الترميز RNAs المشاركة في وظائف بما في ذلك مايكرو الحمض الريبي النيبالي (ميرنا) التنظيم ، والوساطة من التفاعلات بروتين البروتين ، وتنظيم النسخ الجيني الابويه. في الجيل التالي الكلاسيكية RNA تسلسل (RNA-seq) ، يتم تجاهل circRNAs عاده نتيجة لاختيار بولي-A اثناء بناء المكتبات mRNA ، أو وجدت في وفره منخفضه جدا ، التالي من الصعب عزل وكشف. هنا ، تم تحسين بروتوكول إنشاء مكتبه circRNA عن طريق مقارنه مجموعات اعداد المكتبة ، وخيارات ما قبل العلاج ومختلف الكميات الاجماليه لإدخال الحمض الريبي النيبالي. وقد تم اختبار مجموعتين من مجموعات اعداد المكتبة المتاحة تجاريا ، مع وبدون RNase R قبل المعالجة ، وباستخدام كميات متغيرة من إجمالي دخل الحمض الريبي النيبالي (1 إلى 4 ميكروغرام). وأخيرا ، أنواع متعددة من الانسجه ؛ بما في ذلك الكبد, الرئة, العقدة الليمفاوية, والبنكرياس; فضلا عن مناطق الدماغ متعددة; بما في ذلك المخيخ ، والفص الجداري السفلي ، والجيروسكوبات الصدغية الوسطي ، والقشرة القذالي ، والجيروسكوبات الاماميه المتفوقة. تمت مقارنتها لتقييم وفره circRNA عبر أنواع الانسجه. تحليل البيانات التي تم إنشاؤها الحمض الريبي-seq باستخدام سته مختلفه circRNA أدوات الكشف (find_circ ، CIRI ، Mapsplice ، سكين ، DCC ، و سيرسيكسبلورير) كشفت ان مجموعه من الجيش النيبالي السماوي اعداد مكتبه مجموعه عده مع RNase R قبل العلاج و 4 ميكروغرام الحمض الريبي المدخلات هو الأمثل طريقه لتحديد العدد النسبي الأعلى من circRNAs. وتماشيا مع النتائج السابقة ، لوحظت اعلي نسبه إثراء في انسجه المخ بالمقارنة مع أنواع الانسجه الأخرى.

Introduction

التعميم rnas (circrnas) هي الذاتية ، وغير الترميز rnas التي اكتسبت الاهتمام نظرا لتعبيرها المتفشي في الناسخة النواة1،2،3. يتم تشكيلها عندما الاكسون العودة لصق لبعضها البعض ، التالي اعتبرت في البداية ان تكون التحف الربط4،5. ومع ذلك ، أظهرت الدراسات الاخيره ان circrnas المعرض نوع الخلية ، والانسجه ، والتنمية المرحلة المحددة التعبير3،6 ويتم الحفاظ علي التطور2،3. وعلاوة علي ذلك ، فهي تشارك في الوساطة من البروتين والبروتين التفاعلات7، الصغرى الحمض الريبي النيبالي (ميرنا) ملزمه3،8،9،10، وتنظيم النسخ الجيني الابويه11.

في تسلسل RNA الكلاسيكية (الحمض الريبي النيبالي-seq) ، circRNAs قد تكون فقدت تماما اثناء بناء المكتبة نتيجة لاختيار بولي-A ل mRNAs أو قد يكون من الصعب عزل نظرا لوفره منخفضه. ومع ذلك ، فقد أدرجت الدراسات الحديثة لتوصيف الخصائص خطوه ما قبل المعالجة باستخدام rnase R من أجل إثراء circrna2،12،13. RNase R هو اكسوريبونوكليسي التي يهضم RNAs الخطية ، تاركا وراءها هياكل الحمض الريبي النيبالي الدائري. تم تحسين بروتوكولات التخصيب CircRNA عن طريق توليد ومقارنه البيانات من اثنين المتاحة تجاريا مجموعات البناء مكتبه النسخ ، مع وبدون خطوه RNase R قبل العلاج ، واستخدام كميات متفاوتة من الدخل الكلي RNA (1 إلى 4 ميكروغرام). وكان البروتوكول الأمثل تستخدم المقبل لتقييم وفره من circRNAs عبر خمس مناطق الدماغ المختلفة (المخيخ [BC] ، الفص الجداري السفلي [الملكية الفكرية] ، الجيروسكوب الصدغي الأوسط [MG] ، القشرة القذالي [OC] والجيروسكوب الامامي المتفوق [SF]) وأربعه أنواع أخرى من الانسجه (الكبد [LV] ، الرئة [LU] ، العقدة الليمفاوية [LN] والبنكرياس [PA]). وكانت المكتبات التي تليها الحمض الريبي النيبالي-المتسلسلة المتعاقبة وتحليل البيانات باستخدام سته مختلفه خوارزميات التنبؤ circRNA: find_circ3، ciri14، mapsplice15، سكين16، dcc17، و سيرسيكسبلورير18. واستنادا إلى تحليلنا ، تم الكشف عن أكبر عدد من circRNAs فريدة من نوعها عند استخدام مجموعه من الذين تقطعت بهم السبل اعداد مكتبه الحمض الريبي النيبالي مع RNase R قبل العلاج و 4 ميكروغرام إجمالي المدخلات RNA. يتم وصف البروتوكول الأمثل هنا. كما ذكر سابقا19,20, لوحظ اعلي إثراء من circrnas في الدماغ بالمقارنة مع أنواع الانسجه الأخرى.

Protocol

وقد اجري هذا البحث امتثالا لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاه الإنسان. وقد تم الحصول علي انسجه المخ من برنامج التبرع بالمخ والجسم لمعهد البحوث الصحية في صن سيتي ، AZ. وتتم الموافقة علي عمليات برنامج التبرع بالمخ والجسم من قبل مجلس المراجعة المؤسسية الغربية (بروتوكول WIRB #20120821). وقد وقعت جميع الموضوعات أو ممثلوها القانونيون علي الموافقة المستنيرة. تم شراء التجارية (غير الدماغ) بيوبيبيكس من بروتيجينيكس.

1. RNase R العلاج

ملاحظه: في الخطوات التالية ، يتم ضبط وحده التخزين رد الفعل إلى حجم إجمالي 50 μL. هذا هو الحد الأدنى لحجم العينة لاستخدامها في تنظيف RNA & مجموعه المكثف (انظر جدول المواد). بالاضافه إلى ذلك ، فان البروتوكول الأمثل الموصوف هنا هو لكميه الإدخال من 4 ميكروغرام من الحمض الريبي النيبالي الإجمالي. ويوصي بوقت حضانة أطول لعلاج RNase R لكميه المدخلات > 4 ميكروغرام.

  1. تمييع إجمالي RNA إلى 4 ميكروغرام في 39 μL RNase خاليه من المياه في أنبوب الطرد المركزي وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب.
  2. في أنبوب منفصل ، تمييع R RNase إلى تركيز العمل من 2 U/μL مع 1x RNase R رد فعل العازلة. جعل فقط ما يكفي للاستخدام الفوري.
  3. ماصه 39 μL من إجمالي RNA و 5 μL من 10x RNase R رد فعل العازلة في أنبوب رد فعل مل 1.5 وتخلط جيدا عن طريق التنضيد (50 μL سيكون حجم التفاعل الكلي). المقبل ، أضافه 6 μL من RNase R (2 U/μL).
  4. اضبط الماصة علي حجم التفاعل الكامل (50 μL) واخلط جيدا بواسطة التنضيد لاعلي ولأسفل 10 مرات.
  5. ضع الأنبوب في حمام مياه 37 درجه مئوية لمده 10 دقائق. تاكد من ان حجم التفاعل الكامل مغمورة في حمام المياه.
  6. وضع أنبوب علي الجليد والمضي قدما علي الفور مع الحمض الريبي النيبالي تنظيف & تركيز (القسم 2).

2. تنقيه RNA باستخدام الحمض الريبي النيبالي تنظيف والمكثف كيت

ملاحظه: عند استخدام عاليه الجودة RNA (رين > 8 ، DV200 > 80 ٪) ، RNase R العلاج قد يؤدي إلى فقدان ما يقرب من 60 ٪ من الحمض الريبي النيبالي. باستخدام إدخال 4 ميكروغرام, ويقدر ان 2 – 2.5 ميكروغرام من الحمض الريبي النيبالي المعالج تركت بعد القسم 1.

  1. قبل البدء ، واعداد المخزن المؤقت للغسيل الحمض الريبي النيبالي باضافه 48 mL من 100 ٪ الايثانول إلى المركز العازل وتخلط جيدا عن طريق التنضيد. وضع أعمده تنقيه في أنابيب جمع (انظر جدول المواد) ومكان في رف أنبوب.
    ملاحظه: استخدم الإعدادات الطردة التالية لكافة الخطوات التالية: 10000 – 16000 x g. إذا تم تنفيذ العلاج DNase انا بالفعل ، تخطي DNase انا العلاج في هذه المرحلة.
  2. أضافه 2 مجلدات من الحمض الريبي النيبالي ربط العازلة إلى RNase R العينة المعالجة ، وتخلط جيدا عن طريق التنضيد (الحجم الكلي: 150 μL).
  3. أضافه 1 حجم 100 ٪ الايثانول إلى المخزن المؤقت لتجليد الحمض الريبي النيبالي والمعالجة RNase R خليط عينه ، وتخلط جيدا عن طريق التنضيد (الحجم الكلي: 300 μL).
  4. نقل وحده التخزين بالبالكامل إلى العمود والطرد المركزي العمود لمده 30 ثانيه. تجاهل التدفق من خلال.
  5. أضافه 400 μL من الجيش النيبالي المؤقت الاعداديه العازلة مباشره إلى العمود ، الطرد المركزي العمود لمده 30 ثانيه ، وتجاهل التدفق من خلال.
  6. أضافه 700 μL من الحمض الريبي النيبالي غسل المخزن المؤقت مباشره إلى العمود ، الطرد المركزي العمود لمده 30 ثانيه ، وتجاهل التدفق من خلال.
  7. أضافه 400 μL من الحمض الريبي النيبالي غسل العازلة مباشره إلى العمود ، الطرد المركزي العمود لمده 2 دقيقه ، ونقل العمود إلى جديد RNase خاليه من أنبوب 1.5 mL.
  8. أضافه 11 μL من المياه RNase خاليه مباشره إلى العمود عن طريق عقد غيض الماصة فوق فلتر العمود وضمان ان المياه الأراضي فقط علي فلتر العمود.
  9. احتضان العمود لمده دقيقه واحده في درجه حرارة الغرفة والطرد المركزي لمده دقيقه واحده.
  10. قبل التخلص من العمود ، تحقق من التدفق من خلال الأنبوب الخالي من RNase. إذا كان التملص ناجحه ، تخزين العينة في-80 درجه مئوية أو المضي قدما فورا مع اعداد المكتبة. ويستخدم الحجم النهائي الإجمالي لما يقرب من 10 μL لبناء المكتبة.
    ملاحظه: نقطه التوقف: اترك RNA في-80 درجه مئوية لمده تصل إلى 7 أيام قبل المتابعة مع اعداد المكتبة.

3. الاعداديه مكتبه circRNA

ملاحظه: انظر جدول المواد لعده ، والذي يحتوي علي معظم الكواشف المستخدمة في هذا القسم.

  1. استنفاد الجيش الريبي النيبالي وتفتيته
    1. نقل 10 μL من الحمض الريبي النيبالي المنقي من الخطوة 2.10 إلى بئر نظيفه في لوحه جديده 96-بئر 0.3 mL PCR. إلى البئر ، أضافه 5 μL من المخزن المؤقت ربط rRNA متبوعا 5 μL rRNA أزاله ميكس. ماصه بلطف صعودا وهبوطا 10 مرات لخلط.
    2. ختم لوحه واحتضان لمده 5 دقائق في 68 درجه مئوية علي المبرمجة مسبقا ، قبل تسخينها كتله ثيرموسيكلير. بعد الانتهاء من الحضانة 5 دقائق ، مكان لوحه علي مقاعد البدلاء واحتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 1 دقيقه.
    3. أزاله الختم من لوحه. أضافه 35 μl من فورتيكسد درجه حرارة الغرفة rrna أزاله الخرز للعينه. اضبط الماصة علي 45 μL والماصة لاعلي ولأسفل 10 – 20x للمزج جيدا. لوحه احتضان لمده دقيقه واحده في درجه حرارة الغرفة.
    4. نقل لوحه إلى موقف المغناطيسي واحتضان علي الوقوف لمده دقيقه واحده أو حتى يتم مسح الحل. نقل كل من ماده طافي (~ 45 μl) إلى بئر جديده علي نفس لوحه ، أو لوحه جديده (اعتمادا علي عدد العينات التي تعمل مع).
    5. دوامه الخرز تنظيف الحمض الريبي النيبالي (انظر جدول المواد) حتى تفرق جيدا ، وأضافه 99 μl من الخرز لكل عينه. ماصه لاعلي ولأسفل 10x لخلط. احتضان لوحه في درجه حرارة الغرفة لمده 10 دقيقه.
    6. نقل لوحه إلى موقف المغناطيسي واحتضان اضافيه 5 دقيقه أو حتى يتم مسح الحل. أزاله وتجاهل كل من ماده طافي من البئر.
    7. مع لوحه لا تزال علي الحامل المغناطيسي ، أضافه 200 μL من الطازجة المعدة 80 ٪ EtOH إلى البئر دون تعطيل الخرز. احتضان لمده 30 ثانيه ، ثم أزاله وتجاهل الايثانول. كرر لما مجموعه 2 يغسل.
    8. أضافه 11 μL من العازلة لكل بئر وماصه اعلي وأسفل 10 مرات لخلط. احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 2 دقيقه ، ومن ثم نقل إلى الموقف المغناطيسي حتى مسح الحل (1-5 دقيقه).
    9. نقل 8.5 μl من ماده طافي من البئر إلى بئر جديده علي نفس لوحه أو لوحه جديده. أضافه 8.5 μL من Elute ، التمهيدي ، قطعه مزيج عاليه لكل عينه تحتوي علي جيدا. ماصه لاعلي ولأسفل 10 مرات لخلط جيدا.
    10. ختم لوحه واحتضان لمده 8 دقائق في 94 درجه مئوية علي المبرمجة مسبقا ، قبل تسخينها كتله ثيرموسيكلير. أزاله من ثيرموسيكلير عندما يصل إلى 4 درجه مئوية والطرد المركزي لفتره وجيزة.
      ملاحظه: المضي قدما علي الفور إلى توليف الأول حبلا cDNA بروتوكول.
  2. توليف cDNA
    1. لكل عينه يجري اعدادها ، مزيج 9 μL الأول ستراند مزيج التوليف مع 1 μL من النسخ العكسي (انظر جدول المواد). أضف 8 ميكرولتر من الخليط إلى العينة. ماصه لاعلي ولأسفل 6 مرات لخلط.
      1. ختم لوحه واحتضان علي المبرمجة مسبقا ، ثيرموسيكلير كتله قبل تسخينها باستخدام المعلمات التالية: 25 درجه مئوية لمده 10 دقيقه ، 42 درجه مئوية لمده 15 دقيقه ، 70 درجه مئوية لمده 15 دقيقه ، 4 درجه مئوية عقد. المضي قدما علي الفور إلى التوليف حبلا الثاني.
    2. أضافه 5 μL من المخزن المؤقت أعاده التعليق إلى كل عينه متبوعا 20 μL من الثانية ستراند بمناسبه مزيج رئيسي. ماصه الصوت بأكمله صعودا وهبوطا 6 مرات.
    3. ختم لوحه واحتضانها علي المبرمجة مسبقا ، قبل تسخينها كتله ثيرموسيكلير مجموعه إلى 16 درجه مئوية لمده 1 ساعة. بعد الحضانة ، وأزاله لوحه من ثيرموسيكلير والسماح لها تتوازن درجه حرارة الغرفة.
    4. دوامه الخرز تنقيه PCR (انظر جدول المواد) وأضافه 90 μl الخرز لكل بئر من عينه. ماصه لاعلي ولأسفل 10 مرات لخلط جيدا. احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 10 دقيقه.
    5. انقل مزيج الخرزة/العينة إلى الحامل المغناطيسي وحضنه لمده 5 دقائق أو حتى يزول السائل. أزاله وتجاهل supernatant.
    6. أضافه 200 μL من 80% EtOH إلى كل عينه. احتضان العينات علي الحامل المغناطيسي في درجه حرارة الغرفة لمده 30 ثانيه. تجاهل الفائقة. كرر 1x.
    7. السماح الخرز لتجف في درجه حرارة الغرفة لمده 6 دقائق ، ومن ثم أزاله من موقف المغناطيسي.
    8. أعاده تعليق الخرز في 19.5 μL من المخزن المؤقت أعاده التعليق. ماصه لاعلي ولأسفل 10 مرات لخلط جيدا. احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 2 دقيقه ، ثم نقل إلى موقف المغناطيسي واحتضان لمده اضافيه 1 دقيقه أو حتى مسح السائل.
    9. نقل 17.5 μl من ماده طافي إلى جديده جيدا/لوحه جديده.
      ملاحظه: إذا لم يتم القيام بذلك علي الفور ، يمكن تخزين العينات عند-20 درجه مئوية لمده تصل إلى 7 أيام.
  3. اعداد المكتبة
    1. أضافه 12.5 μL من A-المخلفات ميكس لكل المحتوية علي البئر supernatant. ماصه الحجم بأكمله صعودا وهبوطا 10 مرات لخلط.
    2. احتضان رد فعل علي المبرمجة مسبقا ، ثيرموسيكلير كتله قبل تسخينها تعيين إلى 37 درجه مئوية باستخدام المعلمات التالية: 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه ، 70 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، 4 درجه مئوية عقد. عندما تصل العينات إلى 4 درجات مئوية ، انتقل فورا إلى ربط المحول.
    3. لكل عينه أضافه 2.5 μL من المخزن المؤقت أعاده التعليق ، 2.5 μL من محول RNA فريدة ، و 2.5 μL من مزيج الربط. ماصه لاعلي ولأسفل 10x لخلط.
    4. احتضان عينات علي المبرمجة مسبقا ، قبل تسخينها كتله ثيرموسيكلير في 30 درجه مئوية لمده 10 دقيقه.
    5. أضافه 5 μL من إيقاف الربط العازلة لكل عينه وماصه لاعلي وأسفل لخلط.
    6. أضافه 42 μL من الخرز تنقيه PCR مختلطة لكل عينه وتخلط جيدا. اتبع الخطوات ال3.2.6ه من خلال 3.2.10 ، ولكن تغيير وحده التخزين أعاده التعليق إلى 52 μL ووحده التخزين النهائية التملص إلى 50 μL.
    7. كرر بروتوكول الخرزة تنقيه PCR مره أخرى مع 50 μL التملص من 3.3.6 الخطوة ، ولكن تغيير حجم أعاده التعليق إلى 22 μL وحجم الشطف النهائي إلى 20 μL.
      ملاحظه: إذا لم يتم القيام بذلك علي الفور ، يمكن تخزين العينات عند-20 درجه مئوية لمده تصل إلى 7 أيام.
    8. أضافه 5 μL من PCR التمهيدي كوكتيل و 25 μL من PCR ماستر ميكس لكل عينه. امزجها بالأنابيب لاعلي ولأسفل 10 مرات. احتضان رد فعل علي المبرمجة مسبقا ، ثيرموسيكلير كتله قبل تسخينها باستخدام المعلمات التالية: 98 درجه مئوية لمده 30 ثانيه ؛ ثم 8 دورات من 98 درجه مئوية ل 10 ق ، 60 درجه مئوية ل 30 ثانيه ، و 72 درجه مئوية ل 30 ثانيه ؛ ثم 72 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، ثم 4 درجه مئوية عقد.
      ملاحظه: قد تكون هناك حاجه إلى الاستفادة المثلي من العدد الإجمالي لدورات PCR لتوليد كميات كافيه من المكتبة للتسلسل.
    9. اتبع البروتوكول لتنقيه الخرزة PCR (الخطوات من خلال 3.2.9) ، باستثناء أضافه 50 μL من الخرز تنقيه PCR مختلطة جيدا وتغيير حجم أعاده التعليق إلى 32.5 μL مع حجم التملص النهائي من 30 μL.
      ملاحظه: يجب تخزين العينات عند-20 درجه مئوية.
  4. القياس الكمي ومراقبه الجودة باستخدام محلل الأحماض النووية
    1. السماح الاشرطه والكواشف لتتوازن في درجه حرارة الغرفة لمده 30 دقيقه.
    2. مزيج 2 μL من المكتبة مع 2 μL من HS D1000 العازلة ، وأضافه إلى لوحه متوافقة جيدا.
    3. ختم باحكام مع ختم إحباط متوافق ، ودوامه لمده 1 دقيقه في 2,000 لفه في الدقيقة.
    4. تدور أسفل وتحميل لوحه علي محلل البرامج التالية المطالبات.
      ملاحظه: يجب ان تكون المكتبات تقريبا 260 bp في الحجم.

4. سير عمل تحليل البيانات

  1. تسلسل الشركات التابعة للجيش النيبالي المتسلسل (انظر جدول المواد) لإنشاء 82 bp المقترنة-نهاية القراءة. تحويل بيانات التسلسل الاوليه في شكل ملفات basecall (.bcl) إلى FASTQs باستخدام الاداه bcl2fastq (v 0.2.19).
  2. الكشف عن circRNAs.
    ملاحظه: استنادا إلى الادله التي سبق الإبلاغ عنها ان أسلوب الكشف circrna الفرقة أداء أفضل مقارنه باستخدام أداه الكشف واحد21،22، نقترح استخدام أدوات متعددة للكشف circrna. هنا ، تم تحديد circRNAs باستخدام ست خوارزميات التنبؤ Circrnas القائمة: find_circ ، CIRI ، سيرسيكسبلورير ، Mapsplice ، سكين ، و DCC ، تطبيق إعدادات المعلمة الموصي بها لكل خوارزميه.
    1. تحميل وتثبيت كل خوارزميه الكشف circRNA علي كتله الحوسبة عاليه الأداء لينكس باستخدام الإرشادات المقدمة من قبل المطورين.
    2. محاذاة العلامات السريعة المتسلسلة RNA ضد الجينوم المرجعي (GRCh37) ، باستخدام التقويم الموصي به لكل أداه.
    3. بعد المحاذاة ، تنفيذ خوارزميات الكشف circRNA عن طريق تطبيق إعدادات المعلمة الموصي بها الخاصة بهم.
    4. ستقوم كل أداه بإخراج ملف نتائج متعدد الاعمده مع قائمه circRNAs المكتشفة ، واستخراج إحداثيات Circrnas وعدد القراءات الداعمة من هذا من أجل تحديد عدد المرشحين المكتشفين في كل عينه/حاله اختبار.
  3. تحويل الإخراج الإحداثيات circRNA بواسطة CIRI و Mapsplice و DCC إلى الإحداثيات المستندة إلى 0 ان تكون متناسقة مع خوارزميات الثلاثة الأخرى.
  4. حدد circRNAs مع اثنين أو أكثر من القراءات الداعمة أو التحليلات والمقارنات النهائية. يلخص الجدول 1 جميع المعلمات التي تم تقييمها في دراستنا إلى جانب العدد الإجمالي للقراءة المتسلسلة التي تم إنشاؤها لكل عينه.
  5. لكل نموذج/اختبار الشرط ، عد عدد المكتشفة circRNAs تطبيع إلى عدد القراءات المعينة التي تم إنشاؤها لتلك المكتبة ، لكل مليون. تلخيص النتائج عبر مختلف الاداات/العينات في المؤامرات مربع ، كما هو مفصل في نتائج الممثل.

النتائج

تم تقييم البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام السيطرة العالمية المتاحة تجاريا RNA (UC) واستخدام مجموعتين من مجموعات اعداد المكتبة ، وكلاهما يتضمن خطوه لاستنفاد الأوزون في بروتوكولاتهما. باستخدام سير عمل تحليلي (سير عمل تحليل البيانات ، القسم 4) ، بشكل عام ، تم الكشف عن عدد أكبر من circRNAs في مجموعا?...

Discussion

وفي هذه الدراسة ، تم اختبار مجموعتين من مجموعات اعداد المكتبات المتاحة تجاريا ، وخيارات ما قبل المعالجة ، وكميات الحمض الريبي للإدخال من أجل تحسين بروتوكول إثراء circRNA لبناء مكتبات تسلسل circRNA. واستنادا إلى تقييمات هذه الدراسة ، فان عددا من الجوانب الرئيسية والخطوات الحاسمة في إنشاء مكتبات ...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

ونحن ممتنون لمعهد البحوث الصحية الشمس راية الدماغ والجسم برنامج التبرع (BBDP) من صن سيتي, ولاية اريزونا لتوفير انسجه المخ البشرية. وقد تم دعم BBDP من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (U24 NS072026 الوطنية الدماغ والانسجه الموارد لمرض باركنسون والاضطرابات ذات الصلة) ، المعهد الوطني للشيخوخة (P30AG19610 اريزونا مرض الزهايمر مركز الاساسيه), ولاية اريزونا قسم الخدمات الصحية (عقد 211002, اريزونا مركز البحوث الزهايمر), ولاية اريزونا لجنه البحوث الطبية الحيوية (عقود 4001, 0011, 05-901 و 1001 إلى اتحاد مرض باركنسون في ولاية اريزونا) ومايكل J. مؤسسه فوكس للبحوث باركنسون27. وقد دعمت هذه الدراسة أيضا من قبل وزاره التعليم الوطني وولاية اريزونا (ADHS منحه # ADHS14-052688). كما نشكر أندريا شميت (بحث بانر) وسينثيا ليهوغا (TGen) للدعم الإداري.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,000 µL pipette tipsRaininGP-L1000F
20 µL pipette tipsRaininSR L 10F
200 µL pipette tipsRaininSR L 200F
2200 TapeStation Accessories (foil covers)Agilent Technologies5067-5154
2200 TapeStation Accessories (tips)Agilent Technologies5067-5153
Adhesive Film for MicroplatesVWR60941-064
AMPure XP Beads 450 mLBeckman CoulterA63882PCR purification
Eppendorf twin.tec 96-Well PCR PlatesVWR951020401
High Sensitivity D1000 reagentsAgilent Technologies5067-5585
High Sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584
HiSeq 2500 Sequencing SystemIlluminaSY-401-2501
HiSeq 3000/4000 PE Cluster KitIlluminaPE-410-1001
HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)IlluminaFC-410-1002
HiSeq 4000 Sequencing SystemIlluminaSY-401-4001
HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2IlluminaPE-402-4002
HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)IlluminaFC-402-4022
Kapa Total RNA KitRocheKK8400
Molecular biology grade ethanolFisher ScientificBP28184
Qubit Assay TubesSupply Center by Thermo FischerQ32856
Qubit dsDNA High Sense Assay KitSupply Center by Thermo FischerQ32854
RNA cleanup and concentrator - 5ZymoRCC-100Contains purification columns, collection tubes
RNAClean XP beadsBeckman Coulter GenomicsRNA Cleanup beads
Rnase RLucigenRNR07250
SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 unitsThermoFisher (LifeTech)18064014
TapeStation 2200Agilent TechnologiesNucleic Acid analyzer
TElowEVWR10128-588
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep KitIllumina20020596Kit used in section 3
Two-Compartment Divided TrayVWR3054-1004
UltraPure WaterSupply Center by Thermo Fischer10977-015
Universal control RNAAgilent740000

References

  1. Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
  2. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  3. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  4. Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
  5. Nigro, J. M., et al. Scrambled exons. Cell. 64 (3), 607-613 (1991).
  6. Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
  7. Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
  8. Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
  9. Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
  10. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
  11. Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
  12. Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
  13. Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
  14. Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
  15. Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
  16. Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
  17. Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
  18. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  19. Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
  20. Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
  21. Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
  22. Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
  23. Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
  24. Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
  25. Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
  26. Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
  27. Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

153

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved