Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Dairesel RNA'lar (circRNA'lar), transkripsiyonel düzenlemede ve proteinler arasındaki iletişimlerde rol alabilecek kodlamayan RNA'lardır. CircRNA sıralama kütüphanelerinin inşası için farklı parametrelerin değerlendirilmesinin ardından, RNase R ön arıtma ile mahsur kalan toplam RNA kitaplığı hazırlığı kullanılarak bir protokol derlenmiş ve burada sunulmuştur.

Özet

Dairesel RNA'lar (circRNA'lar), mikro-RNA (miRNA) düzenlemesi, protein-protein etkileşimlerinin arabuluculuğu ve ebeveyn gen transkripsiyonunun düzenlenmesi gibi işlevlerde yer alan kodlamayan RNA'lar sınıfıdır. Klasik yeni nesil RNA sıralamasında (RNA-seq), circRNA'lar genellikle mRNA kitaplıklarının inşası sırasında poli-A seçiminin bir sonucu olarak gözden kaçırılır veya çok düşük bollukta bulunur ve bu nedenle izole etmek ve tespit etmek zordur. Burada, bir circRNA kütüphane inşaat protokolü kütüphane hazırlama kitleri, ön işlem seçenekleri ve çeşitli toplam RNA giriş miktarları karşılaştırılarak optimize edildi. RNase R ön işlem li ve olmayan ve değişken miktarda toplam RNA girişi (1 ila 4 g) kullanılarak, ticari olarak kullanılabilen iki tam transkripsiyon kitaplığı hazırlama kitleri test edildi. Son olarak, birden fazla doku tipleri; karaciğer, akciğer, lenf düğümü ve pankreas dahil; yanı sıra birden fazla beyin bölgeleri; beyincik dahil, inferior parietal lob, orta temporal girus, oksipital korteks, ve üstün frontal girus; doku tipleri arasında circRNA bolluğunu değerlendirmek için karşılaştırıldı. Altı farklı circRNA algılama aracı (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC ve CIRCexplorer) kullanılarak oluşturulan RNA-seq verilerinin analizi, RNase R ön işlem ve 4 μg RNA girişi ile mahsur toplam RNA kitaplık hazırlama kitinin en uygun olduğunu ortaya koymuştur. circRNA'ların en yüksek göreli sayısını belirleme yöntemi. Önceki bulgularla tutarlı olarak, beyin dokularında diğer doku tiplerine göre en yüksek circRNA zenginleştirme gözlendi.

Giriş

Dairesel RNA'lar (CircRNA'lar) ökaryotik transkripsiyon1,2,3'teyaygın olarak ifade edilen endojen, kodlamayan RNA'lardır. Onlar exons birbirlerine geri-splice oluşur ve bu nedenle başlangıçta eserler4,5birleştirme olarak kabul edildi . Ancak, son çalışmalar, circRNA'ların hücre tipini, dokuyu ve gelişim evresine özgü ekspresyonu3,6 ve evrimsel olarak korunmuş2,3olduğunu göstermiştir. Ayrıca, protein-protein etkileşimleri arabuluculuk yer almaktadır7, mikro-RNA (miRNA) bağlayıcı3,8,9,10, ve ebeveyn gen transkripsiyon11düzenlenmesi .

Klasik RNA diziliminde (RNA-seq), circRNA'lar mRNA'lar için poli-A seçimi sonucunda kütüphane inşaatı sırasında tamamen kaybolabilir veya düşük bollukları göz önüne alındığında izole edilmesi zor olabilir. Ancak, son circRNA karakterizasyon çalışmaları amacıyla circRNA2,12,13için zenginleştirmek için RNase R kullanarak bir ön tedavi adımı dahil var. RNase R, dairesel RNA yapılarını geride bırakarak lineer RNA'ları sindiren bir exoribonuclease'dir. CircRNA zenginleştirme protokolleri, rnase R ön işlem adımı olan ve olmayan iki ticari olarak kullanılabilen tüm transkripsiyon kitaplığı yapı kitlerinden elde edilen verilerin üretilmesi ve karşılaştırılması ve değişen miktarlarda toplam RNA girişi kullanılarak optimize edilmiştir (1 ila 4 g). Optimize edilmiş protokol daha sonra beş farklı beyin bölgesinde (beyincik [BC], inferior parietal lob [IP], orta temporal girus [MG], oksipital korteks [OC] ve üstün frontal girus [SF]) ve diğer dört doku tipi (karaciğer [LV], akciğer [LU], lenf nodu [LN] ve pankreas [PA]) arasında circRNA bolluğunu değerlendirmek için kullanıldı. RNA-seq kütüphaneleri sıralı olarak eşleştirilmiş ve veriler altı farklı circRNA tahmin algoritmaları kullanılarak analiz edildi: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17, ve CIRCexplorer18. Analizlerimize göre, RNase R ön işlem ve 4 μg toplam giriş RNA ile mahsur toplam RNA kütüphane hazırlama kiti kullanılarak en yüksek sayıda benzersiz circNA tespit edilmiştir. Optimize edilmiş protokol burada açıklanmıştır. Daha önce bildirildiği gibi19,20, circRNA en yüksek zenginleştirme diğer doku tipleri ile karşılaştırıldığında beyinde gözlendi.

Protokol

Bu araştırma, insan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Beyin dokuları Sun City, AZ Banner Güneş Sağlık Araştırma Enstitüsü Beyin ve Vücut Bağışı Programı elde edildi. Beyin ve Vücut Bağışı Programı'nın faaliyetleri Western Kurumsal İnceleme Kurulu (WIRB protokolü #20120821) tarafından onaylanmıştır. Tüm konular veya yasal temsilcileri bilgilendirilmiş onayı imzaladı. Ticari (beyin dışı) biyonumuneler Proteogenex'ten satın alınmıştır.

1. RNase R Tedavisi

NOT: Aşağıdaki adımlarda reaksiyon hacmi toplam 50 μL hacmine ayarlanır. Bu, RNA temizleme ve konsantratörü kitinde kullanılacak minimum numune hacmidir (bkz. Malzeme Tablosu). Ayrıca, burada açıklanan en iyi duruma getirilmiş protokol toplam RNA 4 μg giriş miktarı içindir. RNase R tedavisi için daha uzun bir kuluçka süresi giriş miktarı >4 g için önerilir.

  1. Mikrosantrifüj tüpünde 39 μL RNase içermeyen suda toplam RNA'yı 4°g'ya seyreltin ve pipetleme ile iyice karıştırın.
  2. Ayrı bir tüpte, RNase R'yi 1x RNase R Reaksiyon Tamponu ile 2 U/μL çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Sadece hemen kullanmak için yeterli olun.
  3. Pipet 39 μL toplam RNA ve 5 μL 1.5 mL reaksiyon tüpü içine RNase R Reaksiyon Tampon ve pipetleme ile iyice karıştırın (50 μL toplam reaksiyon hacmi olacaktır). Daha sonra 6 μL R (2 U/μL) ekleyin.
  4. Pipeti tam reaksiyon hacmine (50°L) ayarlayın ve 10 kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın.
  5. Tüpü 10 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
  6. Tüpü buza yerleştirin ve hemen RNA temizleme ve konsantrasyonu (bölüm 2) ile devam edin.

2. RNA Temizleme ve Konsantratörü Kiti Kullanarak Arınma RNA

NOT: Yüksek kaliteli RNA (RIN>8, DV200>%80) kullanılırken RNa tedavisi RNA'nın yaklaşık %60'ında kayba neden olabilir. 4 μg'lik bir giriş kullanılarak, 2-2,5 μg tedavi edilen RNA'nın bölüm 1'den sonra bırakıldığı tahmin edilmektedir.

  1. Başlamadan önce, tampon konsantresine %100 etanol 48 mL ekleyerek RNA Yıkama Tamponu'nu hazırlayın ve pipetleme ile iyice karıştırın. Temizleme kolonlarını toplama tüplerine yerleştirin (bkz. Malzemeler Tablosu)ve bir tüp rafına yerleştirin.
    NOT: Aşağıdaki tüm adımlar için aşağıdaki santrifüj ayarlarını kullanın: 10.000-16.000 x g. DNase I tedavisi zaten yapıldıysa, bu aşamada DNase I tedavisini atlayın.
  2. RNase R işlem görmüş numuneye 2 cilt RNA Bağlama Tamponu ekleyin ve pipetleme (toplam hacim: 150°L) ile iyice karıştırın.
  3. RNA Bağlayıcı Tampon ve RNase R işlenmiş numune karışımına %100 etanol ekleyin ve pipetleme (toplam hacim: 300°L) ile iyice karıştırın.
  4. Tüm hacmi sütuna aktarın ve sütunu 30 s. Akış tanzim edin.
  5. Doğrudan sütuna 400 μL RNA Hazırlık Arabelleği ekleyin, sütunu 30 s'lik santrifüj edin ve akışı atın.
  6. Doğrudan sütuna 700 μL RNA Yıkama Tamponu ekleyin, sütunu 30 s'lik santrifüj edin ve akışı atın.
  7. Doğrudan sütuna 400 μL RNA Yıkama Tamponu ekleyin, sütunu 2 dakika santrifüj edin ve sütunu taze bir RNase içermeyen 1,5 mL tüpe aktarın.
  8. Pipet ucunu kolon filtresinin hemen üzerinde tutarak ve suyun yalnızca kolon filtresine inmesini sağlayarak doğrudan kolona 11 μL RNase içermeyen su ekleyin.
  9. Oda sıcaklığında 1 dakika ve santrifüj 1 dk için sütun kuluçka.
  10. Before discarding the column, check for flow through in the RNase-free tube. Elüsasyon başarılı olduysa, örneğini -80 °C'de saklayın veya hemen kütüphane hazırlığına devam edin. Yaklaşık 10 μL'lik son toplam elüsyon hacmi kütüphane inşaatı için kullanılır.
    NOT: Durma noktası: Kütüphane hazırlığına devam etmeden önce RNA'yı -80 °C'de 7 güne kadar bırakın.

3. circRNA Kütüphane Hazırlık

NOT: Bu bölümde kullanılan çoğu reaktifi içeren kit için Malzeme Tablosu'na bakın.

  1. rRNA tükenmesi ve parçalanma
    1. Yeni 96 kuyulu 0,3 mL PCR plakalı temiz bir kuyuya 2.10 adımdan 10 μL saf RNA aktarın. Kuyuya 5 μL rRNA Bağlama Tamponu ve ardından 5 μL rRNA Kaldırma Karışımı ekleyin. Yavaşça pipet yukarı ve aşağı 10 kez karıştırmak için.
    2. Önceden programlanmış, önceden ısıtılmış termocycler bloğunda 68 °C'de 5 dk'lık sızdırmazlık plakası ve kuluçka makinesi. 5 dk kuluçka tamamlandıktan sonra, tezgah üzerine plaka yerleştirin ve 1 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
    3. Plakadan mühür çıkarın. Örnek için 35 μL girdaplı oda sıcaklığında rRNA kaldırma boncukları ekleyin. Pipeti 45°L ve pipeti 10-20x yukarı ve aşağı doğru ayarlayarak iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 1 dk kuluçka plakası.
    4. Plakayı manyetik bir standa aktarın ve 1 dakika boyunca veya çözelti temize çıkana kadar standda kuluçkaya yatırın. Tüm supernatant 'ı (~45 μL) aynı plaka veya yeni plaka üzerindeki yeni kuyuya (kaç örnekle çalıştığınıza bağlı olarak) aktarın.
    5. Vortex RNA temizleme boncukları (Malzeme Tablosubakınız) kadar iyi dağılmış ve her örnek için boncuk 99 μL ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 10x karıştırmak için. 10 dakika oda sıcaklığında plaka kuluçka.
    6. Plakayı manyetik standa aktarın ve çözelti temize çıkana kadar 5 dakika daha kuluçkaya yatırın. Tüm supernatant'ı kuyudan çıkarın ve atın.
    7. Plaka hala manyetik standda yken, boncukları bozmadan kuyuya 200 μL taze hazırlanmış %80 EtOH ekleyin. 30 s için kuluçka, sonra çıkarın ve etanol atın. Toplam 2 yıkıntı için tekrarlayın.
    8. Her kuyuya 11 μL Elütion Tampon ve karıştırmak için 10 kat yukarı ve aşağı pipet ekleyin. 2 dakika oda sıcaklığında kuluçka, ve sonra çözelti (1-5 dk) temizler kadar manyetik standa aktarın.
    9. Süpernatantın 8,5 μL'sini kuyudan aynı plakalı yeni bir kuyuya veya yeni bir plakaya aktarın. İçerdeki her numuneye 8,5 l Elute, Primer, Fragment High karışımı ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 10 kez iyice karıştırmak için.
    10. Önceden programlanmış, önceden ısıtılmış termocycler bloğunda 94 °C'de 8 dk'lık sızdırmazlık plakası ve kuluçka makinesi. 4 °C'ye ulaştığında termocycler'dan ve kısa bir süre santrifüjden çıkarın.
      NOT: Hemen Synthesize First Strand cDNA protokolüne devam edin.
  2. Sentez cDNA
    1. Hazırlanan her numune için 9 μL First Strand Synthesis Mix ile 1 μL ters transkriptaz karıştırın (bkz. Malzeme Tablosu). Karışımdan 8 μL'lik karışımı numuneye ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 6 kez karıştırmak için.
      1. Mühür plakası ve önceden programlanmış, önceden ısıtılmış termocycler bloğu nda aşağıdaki parametreleri kullanarak inkübat: 10 dk için 25 °C, 15 dk için 42 °C, 15 dk için 70 °C, 4 °C tutun. Hemen ikinci iplikçik sentezine devam edin.
    2. Her numuneye 5 μL Resuspension arabelleği ve ardından 20 μL İkinci İplik İşaretleme ana karışımı ekleyin. Pipet tüm hacmi yukarı ve aşağı 6 kez.
    3. Mühür plakası ve önceden programlanmış, önceden ısıtılmış termocycler blok üzerinde 1 saat için 16 °C olarak ayarlanır. Kuluçkadan sonra, plakayı termocycler'dan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar dengelenin.
    4. Vortex PCR arınma boncukları (Bkz. Malzeme Tablosu)ve numunenin her kuyuya 90°L boncuk ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 10 kez iyice karıştırmak için. 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
    5. Boncuk/numune karışımını manyetik standa aktarın ve 5 dakika veya sıvı temizlene kadar kuluçkaya yatırın. Supernatant'ı çıkarın ve atın.
    6. Her numuneye 200 μL %80 EtOH ekleyin. 30 s. Supernatant atın oda sıcaklığında manyetik standı üzerinde kuluçka örnekleri. 1x'i tekrarlayın.
    7. Boncukların oda sıcaklığında 6 dk kurumasını bekleyin ve manyetik standdan çıkarın.
    8. Resuspension tampon 19.5 μL boncuklar resuspend. Pipet yukarı ve aşağı 10 kez iyice karıştırmak için. 2 dakika oda sıcaklığında kuluçka, sonra manyetik standa aktarın ve ek bir 1 dakika veya sıvı temizler kadar kuluçka.
    9. 17,5 μL supernatant'ı yeni iyi/yeni plakaya aktarın.
      NOT: Hemen devam edilmezse, numuneler -20 °C'de 7 güne kadar saklanabilir.
  3. Kütüphane hazırlama
    1. Supernatant içeren her kuyuya 12,5 l A-Tailing Mix ekleyin. Pipet tüm hacmi yukarı ve aşağı 10 kez karıştırmak için.
    2. Aşağıdaki parametreleri kullanarak 37 °C'ye ayarlanmış önceden programlanmış, önceden ısıtılmış bir termocycler bloğunda reaksiyonu kuluçkaya yatırın: 30 dk için 37 °C, 5 dk için 70 °C, 4 °C tutun. Numuneler 4 °C'ye ulaştığında hemen adaptör ligasyonuna geçin.
    3. Her numune için 2,5 l Resuspension arabellek, 2,5 μL benzersiz bir RNA adaptörü ve 2,5 μL Ligasyon Karışımı ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 10x karıştırmak için.
    4. Önceden programlanmış, önceden ısıtılmış termocycler bloğunda 30 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    5. Her numuneye 5 μL Stop Ligation tamponu ekleyin ve karıştırmak için pipet yukarı ve aşağı.
    6. Her numuneye 42 μL karışık PCR arınma boncukları ekleyin ve iyice karıştırın. 3.2.6 ile 3.2.10 adımlarını izleyin, ancak geri süspansiyon hacmini 52°L ve son elüsyon hacmini 50°L olarak değiştirin.
    7. PCR arınma boncuk protokolünü adım 3.3.6'dan 50 μL elüsiyon ile tekrarlayın, ancak geri süspansiyon hacmini 22 μL ve son elüsyon hacmini 20 μL olarak değiştirin.
      NOT: Hemen devam edilmezse, numuneler -20 °C'de 7 güne kadar saklanabilir.
    8. Her örneğe 5 000 ADET PCR Primer Kokteyl ve 25 000 ADET PCR Master Mix ekleyin. 10 kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak karıştırın. Reaksiyonu önceden programlanmış, önceden ısıtılmış bir termocycler bloğunda aşağıdaki parametreleri kullanarak kuluçkaya yatırın: 30 s için 98 °C; daha sonra 10 s için 98 °C'nin 8 döngüsü, 30 s için 60 °C ve 30 s için 72 °C; sonra 72 °C için 5 dk, sonra 4 °C tutun.
      NOT: Sıralama için yeterli miktarda kitaplık oluşturmak için toplam PCR döngüsü sayısının optimizasyonu gerekebilir.
    9. PCR boncuk arınma protokolünü (3.2.4'ten 3.2.9'a kadar) uygulayın, ancak 50 μL iyi karıştırılmış PCR saflaştırma boncukları ekleyin ve geri süspansiyon hacmini 30 μL'lik son bir elüsasyon hacmiyle 32,5 μL'ye değiştirin.
      NOT: Numuneler -20 °C'de saklanmalıdır.
  4. Nükleik asit analizörü kullanılarak Niceleme ve Kalite Kontrolü
    1. Bantların ve reaktiflerin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca dengede olmasını bekleyin.
    2. 2 μL'lik kitaplığı 2 μL HS D1000 arabelleğiyle karıştırın ve uyumlu bir kuyu plakasına ekleyin.
    3. Uyumlu folyo conta ile sıkıca kapatın ve 2000 rpm'de 1 dk girdap.
    4. Yazılım istemlerini izleyerek analizöre plakayı indirin ve yükleyin.
      NOT: Kütüphaneler yaklaşık 260 bp boyutunda olmalıdır.

4. Veri Analizi İş Akışı

  1. Sıra RNA-seq kitaplıkları (Bkz. Malzeme Tablosu) oluşturmak için 82 bp eşleştirilmiş uçlu okumalar. Bcl2fastq aracını (v0.2.19) kullanarak ham sıralama verilerini basecall dosyaları (.bcl) şeklindefastq'lara dönüştürün.
  2. CircRNA'ları algıla.
    NOT: Daha önce bildirilen kanıtlara dayanarak bir topluluk circRNA algılama yaklaşımı tek bir algılama aracı21,22kullanarak karşılaştırıldığında daha iyi performans , biz circRNA algılama için birden fazla araç kullanarak öneririz. Burada, circRNA'lar mevcut altı circRNA tahmin algoritması kullanılarak tanımlanmıştır: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE ve DCC, her algoritma için önerilen parametre ayarlarını uygulayarak.
    1. Geliştiriciler tarafından sağlanan yönergeleri kullanarak her circRNA algılama algoritmasını linux yüksek performanslı bilgi işlem kümesine indirin ve kurun.
    2. RNA-seq FASTQ'ları referans genomuna (GRCh37) göre hizalayın ve her bir araç için önerilen hizalayıcıyı kullanın.
    3. Hizalamayı takiben, ilgili önerilen parametre ayarlarını uygulayarak circRNA algılama algoritmalarını çalıştırın.
    4. Her araç, algılanan circRNA'ların listesini içeren çok sütunlu bir sonuç dosyası çıkar, her örnek/test koşulunda tespit edilen aday sayısını ölçmek için circRNA koordinatlarını ve destekleyici okuma sayısını ayıklayacaktır.
  3. CIRCRNA koordinatçıktısını CIRI, Mapsplice ve DCC'nin diğer üç algoritmayla tutarlı olması için 0 tabanlı koordinatlara dönüştürün.
  4. İki veya daha fazla destekleyici okuma veya aşağı akış analizleri ve karşılaştırmaları ile circRNA'ları seçin. Tablo 1, çalışmamızda değerlendirilen tüm parametreleri ve her örnek için oluşturulan sıralama okumalarının toplam sayısını özetlemektedir.
  5. Her örnek/test koşulu için, bu kitaplık için oluşturulan haritalı okuma sayısına normalleştirilen algılanan circRNA sayısını milyonda sayın. Sonuçları, Temsilci Sonuçlarında ayrıntılı olarak belirtildiği gibi, kutu çizimlerinde bulunan çeşitli araçlar/örnekler arasında özetleyin.

Sonuçlar

Ticari olarak kullanılabilen evrensel kontrol RNA (UC) kullanılarak ve her ikisi de protokollerinde ribo-tükenme adımı içeren iki kitaplık hazırlama kitleri kullanılarak oluşturulan veriler ilk olarak değerlendirildi. Truseq veri kümelerinde Kapa veri kümelerine göre daha yüksek sayıda circRNA saptandı (Veri analizi iş akışı, bölüm 4), genel olarak (Şekil 1). Ribozomal RNA (rRNA) yüzdeleri daha düşük giriş miktarları için her iki kitten (1, 2 ug) veri kümeleri...

Tartışmalar

Bu çalışmada, circRNA sıralama kitaplıklarının inşası için circRNA zenginleştirme protokolünü optimize etmek amacıyla ticari olarak kullanılabilen iki kütüphane hazırlama kitleri, ön işlem seçenekleri ve giriş RNA miktarları test edilmiştir. Bu çalışmanın değerlendirmelerine dayanarak, circRNA sıralama kitaplıklarının oluşturulmasında önemli ve kritik adımlar ortaya çıkmıştır. Değerlendirmemiz, tespit edilen circRNA sayısının artmasıyla yansıtTığı üzere RNase R ön arı...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Biz Banner Güneş Sağlık Araştırma Enstitüsü Beyin ve Vücut Bağışı Programı (BBDP) Sun City, Arizona insan beyin dokularının sağlanması için müteşekkiriz. BBDP Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (U24 NS072026 Parkinson Hastalığı ve İlişkili Bozukluklar için Ulusal Beyin ve Doku Kaynağı), Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (P30AG19610 Arizona Alzheimer Hastalığı Çekirdek Merkezi), Arizona Sağlık Hizmetleri Bölümü (sözleşme 211002, Arizona Alzheimer Araştırma Merkezi), Arizona Biyomedikal Araştırma Komisyonu (sözleşmeler 4001, 0011, 05-901 ve 1001 Arizona Parkinson Hastalığı Konsorsiyumu için) ve Michael J. Parkinson Araştırma Fox Vakfı27. Bu çalışma aynı zamanda DHS ve Arizona Eyaleti (ADHS hibe # ADHS14-052688) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Andrea Schmitt (Banner Araştırma) ve Cynthia Lechuga (TGen) idari destek için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1000 µL pipette tipsRaininGP-L1000F
20 µL pipette tipsRaininSR L 10F
200 µL pipette tipsRaininSR L 200F
2200 TapeStation Accessories (foil covers)Agilent Technologies5067-5154
2200 TapeStation Accessories (tips)Agilent Technologies5067-5153
Adhesive Film for MicroplatesVWR60941-064
AMPure XP Beads 450 mLBeckman CoulterA63882PCR purification
Eppendorf twin.tec 96-Well PCR PlatesVWR951020401
High Sensitivity D1000 reagentsAgilent Technologies5067-5585
High Sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584
HiSeq 2500 Sequencing SystemIlluminaSY-401-2501
HiSeq 3000/4000 PE Cluster KitIlluminaPE-410-1001
HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)IlluminaFC-410-1002
HiSeq 4000 Sequencing SystemIlluminaSY-401-4001
HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2IlluminaPE-402-4002
HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)IlluminaFC-402-4022
Kapa Total RNA KitRocheKK8400
Molecular biology grade ethanolFisher ScientificBP28184
Qubit Assay TubesSupply Center by Thermo FischerQ32856
Qubit dsDNA High Sense Assay KitSupply Center by Thermo FischerQ32854
RNA cleanup and concentrator - 5ZymoRCC-100Contains purification columns, collection tubes
RNAClean XP beadsBeckman Coulter GenomicsRNA Cleanup beads
Rnase RLucigenRNR07250
SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 unitsThermoFisher (LifeTech)18064014
TapeStation 2200Agilent TechnologiesNucleic Acid analyzer
TElowEVWR10128-588
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep KitIllumina20020596Kit used in section 3
Two-Compartment Divided TrayVWR3054-1004
UltraPure WaterSupply Center by Thermo Fischer10977-015
Universal control RNAAgilent740000

Referanslar

  1. Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
  2. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  3. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  4. Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
  5. Nigro, J. M., et al. Scrambled exons. Cell. 64 (3), 607-613 (1991).
  6. Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
  7. Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
  8. Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
  9. Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
  10. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
  11. Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
  12. Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
  13. Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
  14. Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
  15. Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
  16. Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
  17. Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
  18. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  19. Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
  20. Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
  21. Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
  22. Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
  23. Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
  24. Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
  25. Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
  26. Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
  27. Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

GenetikSay 153dairesel RNAdairesel RNA zenginle tirmeRNaSe RRNA k t phane haz rlamayeni nesil s ralamaRNA s ralama

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır