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Resumo

RNAs circulares (circRNAs) são RNAs não codificadores que podem ter papéis na regulação transcricional e mediar interações entre proteínas. Após a avaliação de diferentes parâmetros para a construção de bibliotecas de sequenciamento circRNA, um protocolo foi compilado utilizando a preparação total da biblioteca de RNA com o pré-tratamento RNase R e é apresentado aqui.

Resumo

RnAs circulares (circRNAs) são uma classe de RNAs não codificadores envolvidos em funções como regulação de microRNA (miRNA), mediação de interações proteína-proteína e regulação da transcrição do gene parental. Na próxima geração clássica de sequenciamento de RNA (RNA-seq), os circRNAs são tipicamente negligenciados como resultado da seleção poli-A durante a construção de bibliotecas de mRNA, ou são encontrados em abundância muito baixa e, portanto, são difíceis de isolar e detectar. Aqui, um protocolo de construção da biblioteca circRNA foi otimizado comparando kits de preparação de bibliotecas, opções de pré-tratamento e vários valores totais de insumos de RNA. Dois kits de preparação de bibliotecas de transcriptoma inteira comercialmente disponíveis, com e sem pré-tratamento RNase R, e usando quantidades variáveis de entrada total de RNA (1 a 4 μg), foram testados. Por último, vários tipos de tecido; incluindo fígado, pulmão, nólina linfática e pâncreas; bem como várias regiões cerebrais; incluindo o cerebelo, o lóbulo parietal inferior, o giro temporal médio, o córtex occipital e o giro frontal superior; foram comparados para avaliar a abundância circRNA em todos os tipos de tecido. A análise dos dados gerados de RNA-seq usando seis ferramentas diferentes de detecção de circRNA (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC e CIRCexplorer) revelou que um kit de preparação total de biblioteca de RNA encalhado com pré-tratamento RNase R e 4 μg de entrada de RNA é o ideal método para identificar o maior número relativo de circRNAs. Consistente com os resultados anteriores, o maior enriquecimento de circRNAs foi observado em tecidos cerebrais em comparação com outros tipos de tecido.

Introdução

RNAs circulares (CircRNAs) são RNAs endógenos e não codificadores que ganharam atenção dada a sua expressão generalizada no transcriptoma eucariótico1,2,3. Eles são formados quando exons back-splice uns aos outros e, portanto, foram inicialmente considerados como estandecendo artefatos4,5. No entanto, estudos recentes demonstraram que circRNAs exibem espécies, tecidos e expressão específica em estágio de desenvolvimento3,6 e são conservadas evolutivamente2,3. Além disso, eles estão envolvidos na mediação de interações proteína-proteína7, micro-RNA (miRNA) ligação3,8,9,10, e regulação da transcrição do gene parental11.

No sequenciamento clássico de RNA (RNA-seq), os circRNAs podem estar completamente perdidos durante a construção da biblioteca como resultado da seleção poli-A para mRNAs ou podem ser difíceis de isolar, dada a sua baixa abundância. No entanto, estudos recentes de caracterização circRNA incorporaram uma etapa pré-tratamento usando RNase R, a fim de enriquecer para circRNAs2,12,13. RNase R é um exoribonuclease que digere RNAs lineares, deixando para trás estruturas circulares de RNA. Os protocolos de enriquecimento da CircRNA foram otimizados gerando e comparando dados de dois kits de construção de bibliotecas de transcriptoma inteiras comercialmente disponíveis, com e sem uma etapa pré-tratamento RNase R, e usando quantidades variáveis de entrada total de RNA (1 a 4 μg). O protocolo otimizado foi usado em seguida para avaliar a abundância de circRNAs em cinco regiões cerebrais diferentes (cerebelo [BC], lobo parietal inferior [IP], giro temporal médio [MG], córtex occipital [OC] e giro frontal superior [SF]) e quatro outros tipos de tecido (fígado [LV], pulmão [LU], nólina [LN] e pancreas [PA]). As bibliotecas de RNA-seq foram emparelhadas sequenciadas e os dados foram analisados usando seis algoritmos diferentes de previsão circRNA: find_circ3,CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17,e CIRCexplorer18. Com base em nossa análise, o maior número de circRNAs únicas foi detectado ao usar um kit de preparação total da biblioteca de RNA com pré-tratamento RNase R e RNA de entrada total de 4 μg. O protocolo otimizado é descrito aqui. Como relatado anteriormente19,20, o maior enriquecimento de circRNAs foi observado no cérebro em comparação com outros tipos de tecido.

Protocolo

Esta pesquisa tem sido realizada em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. Os tecidos cerebrais foram obtidos a partir do Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program em Sun City, AZ. As operações do Programa de Doação de Cérebros e Corpos são aprovadas pelo Western Institutional Review Board (protocolo WIRB #20120821). Todos os sujeitos ou seus representantes legais assinaram o consentimento informado. Bioespécimes comerciais (não cerebrais) foram comprados da Proteogenex.

1. RNase R Tratamento

Nota: Nas etapas a seguir, o volume de reação é ajustado a um volume total de 50 μL. Este é o volume mínimo de amostras a ser utilizado no kit de limpeza e concentrador de RNA (ver Tabela de Materiais). Além disso, o protocolo otimizado descrito aqui é para uma quantidade de entrada de 4 μg de RNA total. Recomenda-se um tempo de incubação mais longo para o tratamento RNase R para uma quantidade de entrada >4 μg.

  1. Diluir o RNA total para 4 μg em 39 μL RNase-free água em um tubo de microcentrífuga e misture bem por pipetting.
  2. Em um tubo separado, diluir o RNase R a uma concentração de trabalho de 2 U/μL com 1x RNase R Reaction Buffer. Faça apenas o suficiente para uso imediato.
  3. Pipette 39 μL de RNA total e 5 μL de 10x RNase R Reaction Buffer em um tubo de reação de 1,5 mL e misture bem por pipetting (50 μL será o volume de reação total). Em seguida, adicione 6 μL de RNase R (2 U/μL).
  4. Ajuste a pipeta para o volume de reação total (50 μL) e misture bem por pipetting cima e para baixo 10 vezes.
  5. Coloque o tubo em um banho de água de 37 °C por 10 min. Certifique-se de que o volume de reação total está imerso no banho de água.
  6. Coloque o tubo no gelo e siga imediatamente com a limpeza e concentração de RNA (seção 2).

2. Purificando RNA usando uma limpeza de RNA e kit de concentrador

Nota: Ao usar RNA de alta qualidade (RIN>8, DV200>80%), o tratamento RNase R pode resultar em perda de aproximadamente 60% de RNA. Usando uma entrada de 4 μg, estima-se que 2-2,5 μg de RNA tratado é deixado após a seção 1.

  1. Antes de começar, prepare o RNA Wash Buffer adicionando 48 mL de 100% de etanol ao concentrado tampão e misture bem por pipetting. Coloque colunas de purificação em tubos de coleta (ver Tabela de Materiais)e coloque em um rack de tubo.
    Nota: Use as seguintes configurações de centrífuga para todas as etapas seguintes: 10.000-16.000 x g. Se o tratamento de DNase I já foi realizado, pule o tratamento de DNase I nesta fase.
  2. Adicione 2 volumes de RNA Binding Buffer à amostra tratada rnase R e misture bem por pipetting (volume total: 150 μL).
  3. Adicione 1 volume de 100% de etanol à mistura de amostras tratadas rna binding buffer e RNase R, e misture bem por pipetting (volume total: 300 μL).
  4. Transfira todo o volume para a coluna e centrífuga a coluna para 30 s. Descarte o fluxo através.
  5. Adicione 400 μL de RNA Prep Buffer diretamente à coluna, centrífuga a coluna para 30 s, e descartar o fluxo através.
  6. Adicione 700 μL de RNA Wash Buffer diretamente à coluna, centrífuga a coluna para 30 s, e descartar o fluxo através.
  7. Adicione 400 μL de RNA Wash Buffer diretamente para a coluna, centrífuga a coluna por 2 min, e transferir a coluna para um novo tubo RNase-livre de 1,5 mL.
  8. Adicione 11 μL de água livre de RNase diretamente à coluna, segurando a ponta da pipeta logo acima do filtro da coluna e garantindo que a água aterrisse apenas no filtro da coluna.
  9. Incubar a coluna por 1 min à temperatura ambiente e centrífuga por 1 min.
  10. Antes de descartar a coluna, verifique se há fluxo no tubo livre de RNase. Se a elução foi bem-sucedida, armazenar amostra em -80 °C ou prosseguir imediatamente com a preparação da biblioteca. O volume total final da lusão de aproximadamente 10 μL é usado para a construção da biblioteca.
    Nota: Ponto de parada: Deixe o RNA a -80 °C por até 7 dias antes de continuar com a preparação da biblioteca.

3. preparação da biblioteca do circRNA

Nota: Veja a tabela dos materiais para o jogo, que contem a maioria de reagents usados nesta seção.

  1. esgotamento e fragmentação do rRNA
    1. Transfira 10 μL de RNA purificado do passo 2.10 para um poço limpo em uma nova placa PCR de 96 poços de 0,3 mL. Para o bem, adicione 5 μL de rRNA Buffer obrigatório seguido por 5 μL rRNA Remoção Mix. Delicadamente pipeto para cima e para baixo 10 vezes para misturar.
    2. Placa de selo e incubação por 5 min a 68 °C em um bloco termociclor pré-programado e pré-aquecido. Após a conclusão da incubação de 5 min, coloque a placa no banco e incubar à temperatura ambiente por 1 min.
    3. Retire o selo da placa. Adicione 35 μL de contas de remoção de rRNA de temperatura ambiente vórtice para provar. Ajuste a pipeta para 45 μL e pipeta para cima e para baixo 10-20x para misturar completamente. Placa incubada para 1 min à temperatura ambiente.
    4. Transfira a placa para um suporte magnético e incubano no suporte por 1 min ou até que a solução se limpe. Transfira todos os supernatant (~45 μL) para novo poço na mesma placa, ou placa nova (dependendo de quantas amostras você está trabalhando com).
    5. Vortex as contas de limpeza rna (ver Tabela de Materiais)até ficar bem dispersa, e adicionar 99 μL de contas para cada amostra. Pipette para cima e para baixo 10x para misturar. Incubar a placa à temperatura ambiente por 10 min.
    6. Transfira a placa para o suporte magnético e incubar um adicional de 5 min ou até que a solução se limpe. Retire e descarte todo o supernatant do poço.
    7. Com a placa ainda no suporte magnético, adicione 200 μL de 20% recém-preparado EtOH ao poço sem interromper as contas. Incubar por 30 s, em seguida, remover e descartar etanol. Repita para um total de 2 laves.
    8. Adicione 11 μL de Elution Buffer para cada poço e pipeta para cima e para baixo 10 vezes para misturar. Incubar à temperatura ambiente por 2 min, e depois transferir para o suporte magnético até que a solução limpa (1-5 min).
    9. Transfira 8,5 μL do supernatant do poço para um novo poço na mesma placa ou para uma nova placa. Adicione 8,5 μL do Elute, Primer, Fragment High mix para cada amostra bem contendo. Pipeta para cima e para baixo 10 vezes para misturar completamente.
    10. Placa de selo e incubação por 8 min a 94 °C em um bloco termociclor pré-programado, pré-aquecido. Retire do termociclo quando atingir brevemente 4 °C e centrífuga.
      Nota: Prossiga imediatamente para o protocolo sintetizar do CDNA da Primeira Costa.
  2. Sintetizar cDNA
    1. Para cada amostra que está sendo preparada, misture 9 μL First Strand Synthesis Mix com 1 μL de transcriptase reversa (ver Tabela de Materiais). Adicione 8 μL da mistura à amostra. Pipette para cima e para baixo 6 vezes para misturar.
      1. Placa de selo e incubação em um bloco de termociclo pré-aquecido pré-programado usando os seguintes parâmetros: 25 °C por 10 min, 42 °C por 15 min, 70 °C por 15 min, 4 °C. Prossiga imediatamente para a síntese da segunda vertente.
    2. Adicione 5 μL de buffer de suspensão a cada amostra seguida de 20 μL da mistura mestre de marcação da Segunda Costa. Pipette todo o volume para cima e para baixo 6 vezes.
    3. Placa de selo e incubação em um bloco termociclor pré-programado, pré-aquecido, fixado em 16 °C para 1 h. Após a incubação, retire a placa do termociclo e deixe equilibrar-se à temperatura ambiente.
    4. Vortex PCR purificação contas (ver Tabela de Materiais)e adicionar 90 μL contas para cada poço de amostra. Pipeta para cima e para baixo 10 vezes para misturar completamente. Incubar à temperatura ambiente por 10 min.
    5. Transfira a mistura do grânulo/amostra ao carrinho magnético e incuba-se para 5 min ou até que o líquido cancele. Retire e descarte o supernatant.
    6. Adicione 200 μL de 80% EtOH a cada amostra. Incubar amostras no suporte magnético à temperatura ambiente para 30 s. Descarte supernatant. Repita 1x.
    7. Permita que os grânulos sequem na temperatura ambiente por 6 min, e remova então do carrinho magnético.
    8. Resuspender contas em 19,5 μL de buffer de resuspensão. Pipeta para cima e para baixo 10 vezes para misturar completamente. Incubar à temperatura ambiente por 2 min, em seguida, transferir para o suporte magnético e incubar por um adicional de 1 min ou até que o líquido limpa.
    9. Transfira 17,5 μL de supernatant para novo poço/nova placa.
      Nota: Se não for em curso imediatamente, as amostras podem ser armazenadas a -20 °C por até 7 dias.
  3. Preparação da biblioteca
    1. Adicione 12,5 μL de A-Tailing Mix para cada poço contendo supernatant. Pipette todo o volume para cima e para baixo 10 vezes para misturar.
    2. Incubar a reação em um bloco termociclota pré-programado e pré-aquecido definido para 37 °C usando os seguintes parâmetros: 37 °C para 30 min, 70 °C para 5 min, 4 °C. Quando as amostras atingem 4 °C, prossiga imediatamente para a ligadura de adaptação.
    3. Para cada amostra adicionar 2,5 μL de buffer de resuspensão, 2,5 μL de um adaptador de RNA único, e 2,5 μL de Mistura de Ligação. Pipette para cima e para baixo 10x para misturar.
    4. Incubar amostras em um bloco pré-programado, pré-aquecido do termociclo a 30 °C por 10 min.
    5. Adicione 5 μL de buffer Stop Ligation para cada amostra e pipeta para cima e para baixo para misturar.
    6. Adicione 42 μL de contas de purificação de PCR mistas para cada amostra e misture bem. Siga os passos 3.2.6 a 3.2.10, mas mude o volume de resuspensão para 52 μL e o volume de elução final para 50 μL.
    7. Repita o protocolo de contas de purificação pcr novamente com a elução de 50 μL do passo 3.3.6, mas mude o volume de resuspensão para 22 μL e o volume de elução final para 20 μL.
      Nota: Se não for em curso imediatamente, as amostras podem ser armazenadas a -20 °C por até 7 dias.
    8. Adicione 5 μL de PCR Primer Cocktail e 25 μL de PCR Master Mix para cada amostra. Misture por pipetting cima e para baixo 10 vezes. Incubar a reação em um bloco de termociclopré-aquecido pré-programado usando os seguintes parâmetros: 98 °C para 30 s; em seguida, 8 ciclos de 98 °C para 10 s, 60 °C para 30 s e 72 °C para 30 s; em seguida, 72 °C para 5 min, em seguida, 4 ° C segurar.
      Nota: A otimização do número total de ciclos de PCR pode ser necessária para gerar quantidades suficientes de biblioteca para sequenciamento.
    9. Siga o protocolo para purificação de contas de PCR (etapas 3,2,4 a 3,2,9), exceto adicionar 50 μL de contas de purificação de PCR bem misturadas e alterar o volume de resuspensão para 32,5 μL com um volume final de elução de 30 μL.
      Nota: As amostras devem ser armazenadas a -20°C.
  4. Quantificação e Controle de Qualidade usando um analisador de ácido nucleico
    1. Permita que fitas e reagentes equilibrem à temperatura ambiente por 30 min.
    2. Misture 2 μL de biblioteca com 2 μL de tampão HS D1000, e adicione a uma placa de poço compatível.
    3. Selar firmemente com selo de folha compatível, e vórtice por 1 min a 2.000 rpm.
    4. Despine e carregue a placa no analisador após solicitações de software.
      Nota: As bibliotecas devem ter aproximadamente 260 bp de tamanho.

4. Fluxo de trabalho de análise de dados

  1. Bibliotecas sequenciais de RNA-seq (ver Tabela de Materiais) para gerar leituras de 20 bp de 82 bp. Converta dados de sequenciamento bruto na forma de arquivos de chamada base (.bcl) para FASTQs usando a ferramenta bcl2fastq (v0.2.19).
  2. Detectar circRNAs.
    Nota: Com base em evidências relatadas anteriormente de que uma abordagem de detecção de circRNA ensemble tem um melhor desempenho em comparação com o uso de uma única ferramentadedetecção21,22,sugerimos o uso de várias ferramentas para detecção de circRNA. Aqui, circRNAs foram identificados usando seis algoritmos de previsão circRNA existentes: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE e DCC, aplicando as configurações de parâmetro recomendadas para cada algoritmo.
    1. Baixe e instale cada algoritmo de detecção de circRNA em um cluster de computação de alto desempenho Linux usando as instruções fornecidas pelos desenvolvedores.
    2. Alinhar fastqs rna-seq contra o genoma de referência (GRCh37), utilizando o alinhador recomendado para cada ferramenta.
    3. Após o alinhamento, execute algoritmos de detecção de circRNA aplicando suas respectivas configurações de parâmetros recomendadas.
    4. Cada ferramenta produzirá um arquivo de resultados de várias colunas com a lista de circRNAs detectados, extrairá as coordenadas circRNA e o número de leituras de suporte com isso para quantificar o número de candidatos detectados em cada condição de amostra/teste.
  3. Converta a circRNA coordena a saída por CIRI, Mapsplice e DCC para coordenadas baseadas em 0 para ser consistente com os outros três algoritmos.
  4. Selecione circRNAs com duas ou mais leituras de suporte ou análises a jusante e comparações. A Tabela 1 resume todos os parâmetros avaliados em nosso estudo, juntamente com o número total de leituras de sequenciamento geradas para cada amostra.
  5. Para cada amostra/condição de teste, conte o número de circRNAs detectados normalizados para o número de leituras mapeadas geradas para essa biblioteca, por milhão. Resumir os resultados entre as várias ferramentas/amostras em parcelas de caixa, conforme detalhado nos Resultados Representativos.

Resultados

Os dados gerados usando um RNA universal comercialmente disponível do controle (UC) e usando dois jogos da preparação da biblioteca, ambos que incluem uma etapa do ribo-esgotamento em seus protocolos, foram avaliados primeiramente. Usando um fluxo de trabalho analítico (fluxo de trabalho de análise de dados, seção 4), em geral, um maior número de circRNAs foi detectado nos conjuntos de dados truseq em comparação com os Kapa(Figura 1). Embora os percentuais de RNA ribossômico (rRNA...

Discussão

Neste estudo, dois kits de preparação de bibliotecas comercialmente disponíveis, opções de pré-tratamento e quantidades de RNA de entrada foram testados para otimizar um protocolo de enriquecimento circRNA para a construção de bibliotecas de sequenciamento circRNA. Com base nas avaliações deste estudo, uma série de aspectos-chave e medidas críticas na criação de bibliotecas de sequenciamento circRNA são aparentes. Nossa avaliação confirma a utilidade do pré-tratamento RNase R, como refletido pelo aument...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Estamos gratos ao Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) de Sun City, Arizona para o fornecimento de tecidos cerebrais humanos. O BBDP tem sido apoiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson's Disease and Related Disorders), o National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimer's Disease Core Center), o Arizona Department of Health Services (contrato 211002, Arizona Alzheimer's Research Center), o Arizona Biomedical Research Commission (contratos 4001, 0011, 05-901 e 1001 para o Arizona Parkinson's Disease Consortium) e michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research27. Este estudo também foi apoiado pelo DHS e pelo Estado do Arizona (concessão adhs # ADHS14-052688). Agradecemos também a Andrea Schmitt (Banner Research) e Cynthia Lechuga (TGen) pelo apoio administrativo.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1000 µL pipette tipsRaininGP-L1000F
20 µL pipette tipsRaininSR L 10F
200 µL pipette tipsRaininSR L 200F
2200 TapeStation Accessories (foil covers)Agilent Technologies5067-5154
2200 TapeStation Accessories (tips)Agilent Technologies5067-5153
Adhesive Film for MicroplatesVWR60941-064
AMPure XP Beads 450 mLBeckman CoulterA63882PCR purification
Eppendorf twin.tec 96-Well PCR PlatesVWR951020401
High Sensitivity D1000 reagentsAgilent Technologies5067-5585
High Sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584
HiSeq 2500 Sequencing SystemIlluminaSY-401-2501
HiSeq 3000/4000 PE Cluster KitIlluminaPE-410-1001
HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)IlluminaFC-410-1002
HiSeq 4000 Sequencing SystemIlluminaSY-401-4001
HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2IlluminaPE-402-4002
HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)IlluminaFC-402-4022
Kapa Total RNA KitRocheKK8400
Molecular biology grade ethanolFisher ScientificBP28184
Qubit Assay TubesSupply Center by Thermo FischerQ32856
Qubit dsDNA High Sense Assay KitSupply Center by Thermo FischerQ32854
RNA cleanup and concentrator - 5ZymoRCC-100Contains purification columns, collection tubes
RNAClean XP beadsBeckman Coulter GenomicsRNA Cleanup beads
Rnase RLucigenRNR07250
SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 unitsThermoFisher (LifeTech)18064014
TapeStation 2200Agilent TechnologiesNucleic Acid analyzer
TElowEVWR10128-588
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep KitIllumina20020596Kit used in section 3
Two-Compartment Divided TrayVWR3054-1004
UltraPure WaterSupply Center by Thermo Fischer10977-015
Universal control RNAAgilent740000

Referências

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