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  • 摘要
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摘要

循环RNA（循环RNA）是非编码RNA，在转录调节和蛋白质之间的中介相互作用中可能发挥作用。在对构建环RNA测序库的不同参数进行评估后，利用RNase R预处理的搁浅总RNA库制备编制了一个协议，并在此提出。

摘要

循环RNA（循环RNA）是一类非编码RNA，涉及微RNA（miRNA）调节、蛋白质-蛋白质相互作用的中介和父母基因转录的调节等功能。在传统的下一代RNA测序（RNA-seq）中，在mRNA库的构建过程中，由于多A选择，循环RNA通常被忽视，或者发现丰度非常低，因此难以分离和检测。在这里，通过比较库制备试剂盒、预处理选项和各种RNA输入总量，优化了circRNA库构建协议。测试了两个市售全转录组库制备试剂盒，带和无RNase R预处理，并使用可变量的总RNA输入（1至4μg）。测试。最后，多种组织类型;包括肝、肺、淋巴结和胰腺;以及多个大脑区域;包括小脑、下垂叶、中时陀螺、腹皮层和上额前陀螺;比较以评估组织类型的环RNA丰度。使用六种不同的环RNA检测工具（find_circ、CIRI、Mapsplice、KNIFE、DCC和CIRCexplorer）对生成的RNA-seq数据进行分析后发现，具有RNase R预处理和4μgRNA输入的搁浅总RNA库制备试剂盒是最佳选择用于识别最高相对数量的环RNA 的方法。与以前的发现一致，与其他组织类型相比，在脑组织中观察到的环RNA的富集性最高。

引言

循环RNA（CircRNA）是内源性的、非编码的RNA，由于它们在真核转录组1、2、3中的普遍表达而备受关注。它们形成于外向的回拼接时，因此最初被认为是拼接伪像4，5。然而，最近的研究表明，circRNA表现出细胞类型，组织和发育阶段的具体表达3，6和进化保存2，3。此外，它们还参与调节蛋白质-蛋白质相互作用7、微RNA（miRNA）结合3、8、9、10和调节亲基因转录11。

在经典RNA测序（RNA-seq）中，由于多A选择mRNA，在库构建过程中，循环RNA可能完全丢失，或者由于丰度低，可能难以分离。然而，最近的circRNA表征研究已经纳入了使用RNase R的预处理步骤，以丰富circRNA2，12，13。RNase R 是一种驱外酶，可消化线性RNA，留下圆形RNA结构。CircRNA扩充方案通过生成和比较来自两个市售的全转录组构建试剂盒的数据进行优化，无论是否采用RNase R预处理步骤，并使用不同量的总RNA输入（1至4μg）。接下来，优化的协议用于评估五个不同大脑区域（小脑 [BC]、下垂叶 [IP]、中端脑环叶 [MG]、下垂皮层 [OC] 和上等前额陀螺 [SF]） 和四个其他组织类型（肝脏 [LV]、肺 [LU]、淋巴结 [LN] 和胰腺] 的环状RNA的丰度。RNA-seq库对端测序，并使用六种不同的circRNA预测算法对数据进行分析:find_circ3，CIRI14，Mapsplice15，KNIFE16，DCC17和CIRCexplorer18。根据我们的分析，当使用带有RNase R预处理和4μg总输入RNA的搁浅总RNA库制备试剂盒时，检测到的唯一循环RNA数量最多。此处介绍了优化的协议。正如先前报道的19，20，与其他组织类型相比，大脑中观察到的环RNA的富集性最高。

研究方案

这项研究是按照所有机构、国家和国际人类福利准则进行的。脑组织从位于亚利桑那州太阳城的横幅太阳健康研究所脑和身体捐献项目获得。大脑和身体捐赠计划的运作由西方机构审查委员会（WIRB协议#20120821批准）。所有主体或其法律代表在知情同意书上签了字。商业（非脑）生物标本是从蛋白酶中购买的。

1. RNase R 治疗

注:在以下步骤中，反应体积调整为总体积为 50 μL。这是用于RNA清理和浓缩器试剂盒的最小样本量（见材料表）。此外，此处描述的优化协议适用于总RNA的4μg输入量。对于输入量 >4 μg，建议延长 RNase R 处理的孵育时间。

  1. 在微离心管中将总RNA稀释至4μg，在39μL无RR酶水中，通过移液混合均匀。
  2. 在单独的管中，用1xR酶R反应缓冲液将RNase R稀释至2U/μL的工作浓度。只制作足够的，以便立即使用。
  3. 移液器 39 μL 的总 RNA 和 5 μL 的 10x RNase R 反应缓冲液放入 1.5 mL 反应管中，并通过移液混合良好（50 μL 是总反应体积）。接下来，添加 6 μL 的 RNase R （2 U/μL）。
  4. 将移液器调节到完全反应体积 （50 μL），通过上下移液 10 次，将液混合良好。
  5. 将管子放入37°C的水浴中10分钟，确保完全反应体积浸入水浴中。
  6. 将管子放在冰上，然后立即进行RNA清理和浓缩（第2节）。

2. 使用RNA清理和浓缩器试剂盒净化RNA

注:当使用高质量的RNA（RIN>8，DV200>80%）时，RNase R处理可能导致大约60%的RNA损失。使用4μg输入，估计在1节之后留下2~2.5μg的已处理RNA。

  1. 开始之前，通过在缓冲液浓缩物中加入 48 mL 的 100% 乙醇来制备 RNA 洗涤缓冲液，并通过移液进行混合。将净化柱放入收集管（见材料表）中，并放置在管架中。
    注:对于以下所有步骤，请使用以下离心设置:10，000~16，000 x g。如果已执行 DNase I 治疗，则在此阶段跳过 DNase I 治疗。
  2. 将2卷RNA结合缓冲液加入RNase R处理样品，并通过移液（总体积:150 μL）进行良好混合。
  3. 在RNA结合缓冲液和RNase R处理样品混合物中加入1卷100%乙醇，并通过移液（总体积:300 μL）混合均匀。
  4. 将整个体积转移到柱子上，使柱子离心30s。丢弃流过。
  5. 将 400 μL 的 RNA 制备缓冲液直接添加到柱中，将柱离心 30 s，然后丢弃流过。
  6. 将 700 μL 的 RNA 洗涤缓冲液直接添加到柱中，将柱离心 30 s，然后丢弃流过。
  7. 将 400 μL 的 RNA 洗涤缓冲液直接添加到柱中，将柱离心 2 分钟，并将柱转移到新的无 RNase 1.5 mL 管中。
  8. 将 11 μL 的无 RNase 水直接添加到柱中，将移液器尖端直接放在柱过滤器上方，并确保水仅落在柱过滤器上。
  9. 在室温下孵育柱子1分钟，离心机孵育1分钟。
  10. 在丢弃列之前，检查无 RNase 管中的流量。如果洗脱成功，将样品储存在-80°C或立即进行库准备。最后总洗脱量约为 10 μL，用于库结构。
    注:停止点:在-80°C处将RNA保持长达7天，然后再继续进行库准备。

3. circRNA库准备

注:有关试剂盒，请参阅材料表，其中包含本节中使用的大多数试剂。

  1. rRNA损耗和破碎
    1. 将10μL的纯化RNA从步骤2.10转移到新的96孔0.3 mL PCR板中的清洁孔。在井中，加入5μL的rRNA结合缓冲液，然后加入5μL rRNA去除混合物。轻轻上下移液10次混合。
    2. 密封板，在 68°C 下在预编程的预加热热循环器块上孵育 5 分钟。完成5分钟孵育后，将板放在长凳上，在室温下孵育1分钟。
    3. 从板中取出密封件。加入35μL的涡旋室温rRNA去除珠到样品。将移液器调节到 45 μL，上下移液器调节 10~20 倍，以彻底混合。在室温下孵育板1分钟。
    4. 将板转移到磁性支架上，在支架上孵育 1 分钟或直到溶液清除。将所有上清液 （+45 μL） 转移到同一板上的新孔或新板（取决于您正在使用多少个样品）。
    5. 涡旋RNA清除珠子（见材料表），直到充分分散，并添加99μL的珠子到每个样品。上下移液 10 倍混合。在室温下孵育板10分钟。
    6. 将板转移到磁性支架，再孵育 5 分钟或直到溶液清除。从井中取出并丢弃所有上清液。
    7. 在磁架上仍静止的板中，在井中加入 200 μL 新鲜制备的 80% EtOH，而不会干扰磁珠。孵育30s，然后取出并丢弃乙醇。重复两次，共进行2次。
    8. 在每个井中加入 11 μL 洗脱缓冲液，上下移液 10 次混合。在室温下孵育2分钟，然后转移到磁性支架，直到溶液清除（1~5分钟）。
    9. 将 8.5 μL 的上清液从井转移到同一板上的新井或新板。将 8.5 μL 的 Elute、底漆、片段高混合添加到每个含有样品的井中。上下移液10次，彻底混合。
    10. 密封板，在 94°C 下在预编程的预加热热循环器块上孵育 8 分钟。当温度循环器达到 4 °C 并短暂离心时，将其拆下。
      注:立即转到合成第一股 cDNA 协议。
  2. 合成 cDNA
    1. 对于正在制备的每个样品，将 9 μL 第一链合成混合物与 1 μL 的逆转录酶混合（参见材料表）。将8μL的混合物加入样品中。上下移液6次混合。
      1. 密封板，并使用以下参数在预编程的预热热循环器块上孵育:25°C 10 分钟，42°C 15 分钟，70°C 15 分钟，4°C 保持。立即进行第二股合成。
    2. 在每个样品中加入5μL的悬浮缓冲液，然后加入20μL的二绞线标记主混合物。移液整个音量上升和下降6次。
    3. 密封板，并在设定为 16°C 的预编程预热热循环器块上孵育 1 小时。孵育后，从热循环器中取出板，使其与室温平衡。
    4. 涡旋PCR纯化珠子（见材料表），并在每个样品口中加入90μL珠子。上下移液10次，彻底混合。在室温下孵育10分钟。
    5. 将珠子/样品混合物转移到磁性支架，孵育5分钟或直到液体清除。清除并丢弃上清液。
    6. 在每个样品中加入 200 μL 的 80% EtOH。在室温下在磁性支架上孵育样品30s.丢弃上清液。重复 1x。
    7. 让珠子在室温下干燥 6 分钟，然后从磁性支架中取出。
    8. 在19.5 μL的悬浮缓冲液中重新悬浮珠子。上下移液10次，彻底混合。在室温下孵育2分钟，然后转移到磁性支架，再孵育1分钟或直到液体清除。
    9. 将 17.5 μL 的上清液转移到新孔/新板。
      注:如果不立即操作，样品可在-20°C下储存长达7天。
  3. 图书馆准备
    1. 在每个含有上清液的井中加入 12.5 μL 的 A-T-Ting 混合。移液整个音量向上和向下10次混合。
    2. 使用以下参数在设定为 37°C 的预编程预热热循环器块上孵育反应:37°C 30 分钟，70°C 5 分钟，4°C 保持。当样品达到 4°C 时，立即进行适配器连接。
    3. 在每个样品中加入2.5 μL的再悬浮缓冲液，2.5 μL的独特RNA适配器，和2.5μL的结扎混合。上下移液 10 倍混合。
    4. 在 30°C 的预编程预热热循环器块上孵育样品 10 分钟。
    5. 在每个样品中加入5μL的停止结扎缓冲液，上下移液混合。
    6. 在每个样品中加入42μL的混合PCR纯化珠子，并彻底混合。按照步骤 3.2.6 到 3.2.10，但将重新悬浮体积更改为 52 μL，将最终洗脱体积更改为 50 μL。
    7. 使用步骤 3.3.6 中的 50 μL 洗脱再次重复 PCR 纯化珠协议，但将重新悬浮体积更改为 22 μL，将最终洗脱体积更改为 20 μL。
      注:如果不立即操作，样品可在-20°C下储存长达7天。
    8. 在每个样品中加入5μL的PCR底酒和25μL的PCR主混合物。通过上下移液混合 10 次。使用以下参数在预编程的预加热热循环器块上孵育反应:98 °C 30 s;然后8个周期，98°C，10s，60°C30s，72°C30s;然后72°C5分钟，然后保持4°C。
      注:可能需要优化 PCR 周期的总数，才能生成足够数量的库进行测序。
    9. 遵循 PCR 珠子纯化方案（步骤 3.2.4 至 3.2.9），但添加 50 μL 的混混 PCR 纯化珠并改变再悬浮体积至 32.5 μL，最终洗脱体积为 30 μL。
      注:样品应储存在-20°C。
  4. 使用核酸分析仪进行定量和质量控制
    1. 允许胶带和试剂在室温下平衡30分钟。
    2. 将 2 μL 的库与 2 μL 的 HS D1000 缓冲液混合，并添加到兼容的孔板中。
    3. 用兼容的箔密封紧密密封，在 2，000 rpm 转速下涡旋 1 分钟。
    4. 根据软件提示，在分析仪上向下旋转并加载板。
      注:库的大小应约为 260 bp。

4. 数据分析工作流程

  1. 序列RNA-seq库（见材料表）生成82 bp成端读取。使用 bcl2fastq 工具 （v0.2.19） 将基点文件 （.bcl） 形式的原始排序数据转换为 FASTQ。
  2. 检测环RNA。
    注:根据先前报道的证据，一个合奏环RNA检测方法比使用单个检测工具21，22表现更好，我们建议使用多种工具进行circRNA检测。在这里，使用六种现有的 circRNA 预测算法进行识别:find_circ、CIRI、CIRCExplorer、Mapsplice、KNIFE 和 DCC，为每个算法应用推荐的参数设置。
    1. 使用开发人员提供的说明，在 Linux 高性能计算群集上下载并安装每个 circRNA 检测算法。
    2. 利用每个工具推荐的校准器，将RNA-seq FASTQ与参考基因组（GRCh37）对齐。
    3. 对齐后，通过应用各自的推荐参数设置来执行 circRNA 检测算法。
    4. 每个工具将输出一个多列结果文件与检测到的环RNA列表，提取环RNA坐标和支持读取的数量，以便量化在每个样本/测试条件中检测到的候选者数。
  3. 将 CIRI、Mapsplice 和 DCC 的 circRNA 坐标输出转换为基于 0 的坐标，以便与其他三种算法保持一致。
  4. 选择具有两个或多个支持读取或下游分析和比较的 circRNA。表 1总结了我们研究中评估的所有参数以及为每个样本生成的排序读取总数。
  5. 对于每个样本/测试条件，计算已归化为该库生成的映射读取数的检测到的 circRNA 数（每百万）。在框图中汇总各种工具/示例的结果，如代表性结果中详细介绍。

结果

使用市售的通用控制RNA（UC）和使用两个库制备试剂盒生成的数据，这两个试剂盒在其协议中都包括核糖核酸消耗步骤。使用分析工作流（数据分析工作流，第 4 节），总体而言，TruSeq 数据集中检测到的环RNA 数量高于 Kapa 数据集（图 1）。尽管两个试剂盒的数据集中的核糖体RNA （rRNA） 百分比低于 5%，输入量较低（1，2 微克），但 Kapa 数据集的 rRNA 含量较高，为 4、5 和 10 ug...

讨论

在这项研究中，测试了两个市售的库制备试剂盒、预处理选项和输入RNA量，以优化circRNA扩充协议，用于构建circRNA测序库。根据本研究的评估，在创建 circRNA 测序库方面，一些关键方面和关键步骤是显而易见的。我们的评估证实了RNase R预处理的效用，这反映在检测到的环RNA数量的增加上。总体而言，在使用具有RNase R预处理和4μg输入RNA的Illumina TruSeq库试剂盒时，环RNA的倍增性更高。这些结果与先?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们感谢亚利桑那州太阳城的旗帜太阳健康研究所脑和身体捐赠计划（BBDP）提供人脑组织。BBDP得到了国家神经疾病和中风研究所（U24 NS072026帕金森病及相关疾病国家脑和组织资源）、国家老龄问题研究所（P30AG19610亚利桑那州阿尔茨海默病核心中心）、亚利桑那州卫生服务部（合同211002， 亚利桑那阿尔茨海默氏症研究中心），亚利桑那生物医学研究委员会（合同4001，0011，05-901和1001到亚利桑那州帕金森病联合会）和迈克尔J。福克斯帕金森研究基金会27日。这项研究也得到了国土安全部和亚利桑那州（ADHS补助金+ADHS14-052688）的支持。我们还感谢安德里亚·施密特（班纳研究）和辛西娅·莱丘加（TGen）提供的行政支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1000 µL pipette tipsRaininGP-L1000F
20 µL pipette tipsRaininSR L 10F
200 µL pipette tipsRaininSR L 200F
2200 TapeStation Accessories (foil covers)Agilent Technologies5067-5154
2200 TapeStation Accessories (tips)Agilent Technologies5067-5153
Adhesive Film for MicroplatesVWR60941-064
AMPure XP Beads 450 mLBeckman CoulterA63882PCR purification
Eppendorf twin.tec 96-Well PCR PlatesVWR951020401
High Sensitivity D1000 reagentsAgilent Technologies5067-5585
High Sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584
HiSeq 2500 Sequencing SystemIlluminaSY-401-2501
HiSeq 3000/4000 PE Cluster KitIlluminaPE-410-1001
HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)IlluminaFC-410-1002
HiSeq 4000 Sequencing SystemIlluminaSY-401-4001
HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2IlluminaPE-402-4002
HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)IlluminaFC-402-4022
Kapa Total RNA KitRocheKK8400
Molecular biology grade ethanolFisher ScientificBP28184
Qubit Assay TubesSupply Center by Thermo FischerQ32856
Qubit dsDNA High Sense Assay KitSupply Center by Thermo FischerQ32854
RNA cleanup and concentrator - 5ZymoRCC-100Contains purification columns, collection tubes
RNAClean XP beadsBeckman Coulter GenomicsRNA Cleanup beads
Rnase RLucigenRNR07250
SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 unitsThermoFisher (LifeTech)18064014
TapeStation 2200Agilent TechnologiesNucleic Acid analyzer
TElowEVWR10128-588
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep KitIllumina20020596Kit used in section 3
Two-Compartment Divided TrayVWR3054-1004
UltraPure WaterSupply Center by Thermo Fischer10977-015
Universal control RNAAgilent740000

参考文献

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