نهج تغذية الأجسام المضادة لدراسة الاتجار بمستقبلات الغلوتامات في ثقافات فرس النهر الأولية المنفصلة

Summary

تقدم هذه المقالة طريقة لدراسة مستقبلات الغلوتامات (GluR) الاتجار في الثقافات فرس النهر الأولية المنفصلة. باستخدام نهج تغذية الأجسام المضادة لتسمية مستقبلات ذاتية أو مبالغ فيها في تركيبة مع النهج الدوائية، وهذا الأسلوب يسمح لتحديد الآليات الجزيئية التي تنظم التعبير سطح غلور عن طريق تحوير عمليات الاستيعاب الداخلي أو إعادة التدوير.

Abstract

الاستجابات الخلوية للمحفزات الخارجية تعتمد بشكل كبير على مجموعة من المستقبلات التي يتم التعبير عنها على سطح الخلية في لحظة معينة. وبناء على ذلك، فإن عدد المستقبلات التي يعبر عنها السطح يتكيف باستمرار ويخضع لآليات صارمة للتنظيم. المثال النموذجي واحد من أحداث الاتجار الأكثر دراسة في علم الأحياء هو السيطرة المنظمة للتعبير متشابك من مستقبلات الغلوتامات (غلورس). تتوسط GluRs الغالبية العظمى من انتقال الأعصاب المحفزة في الجهاز العصبي المركزي والسيطرة على التغيرات الوظيفية والهيكلية التي تعتمد على النشاط الفسيولوجي على مستويات متشابك والخلايا العصبية (على سبيل المثال، اللدونة متشابك). التعديلات في عدد, موقع, وتكوين الوحدة الفرعية من السطح أعرب GluRs تؤثر بعمق على وظيفة الخلايا العصبية، وفي الواقع, ترتبط التعديلات في هذه العوامل مع اعتلال اتّصالات عصبيّة مختلفة. المعروضة هنا هي طريقة لدراسة الاتجار GluR في الخلايا العصبية الأولية فرس النهر المنفصلة. يتم استخدام نهج "تغذية الأجسام المضادة" لتصور بشكل تفاضلي مجموعات غلور المعبر عنها في السطح والأغشية الداخلية. من خلال وضع علامات على مستقبلات السطح على الخلايا الحية وإصلاحها في أوقات مختلفة للسماح لمستقبلات بطانة الرحم و / أو إعادة التدوير، يمكن تقييم عمليات الاتجار هذه ودراستها بشكل انتقائي. هذا هو بروتوكول تنوعا التي يمكن استخدامها في تركيبة مع النهج الدوائية أو الإفراط في التعبير عن المستقبلات المعدلة للحصول على معلومات قيمة حول المحفزات والآليات الجزيئية التي تؤثر على الاتجار GluR. وبالمثل, ويمكن تكييفها بسهولة لدراسة مستقبلات أخرى أو البروتينات السطحية أعرب.

Introduction

الخلايا الاستفادة من العملية النشطة للاتجار لتعبئة البروتينات لتوطين تحت الخلية محددة وممارسة صارمة spatiotemporal التنظيم على وظيفتها¹. هذه العملية مهمة بشكل خاص لمستقبلات عبر الغشاء، كما الاستجابات الخلوية لمختلف المحفزات البيئية تعتمد على السلاسل التعاقبية داخل الخلايا الناجمة عن تنشيط مستقبلات. الخلايا قادرة على تعديل هذه الاستجابات عن طريق تغيير الكثافة، والتوطين، وتكوين الوحدة الفرعية من المستقبلات المعبر عنها على سطح الخلية عن طريق مستقبلات تحت الخلية تنظيم الاتجار². إدراج مستقبلات مُدمجة حديثاً في غشاء البلازما، جنباً إلى جنب مع بطانة الرحم وإعادة تدوير المستقبلات الموجودة هي أمثلة على عمليات الاتجار التي تحدد المجموعة الصافية من المستقبلات التي يعبر عنها السطح². العديد من الآليات الجزيئية تتعاون لتنظيم الاتجار بالبروتين، بما في ذلك تفاعلات البروتين البروتين والتعديلات ما بعد الترجمة مثل الفسفورية، أو التعليب، أو palmitoylation².

إن تنظيم الاتجار بالمستقبلات مطلوب بشكل خاص في الخلايا المستقطبة بشدة ذات الهياكل المتخصصة للغاية. المثال النموذجي هو السيطرة على وظيفة الخلايا العصبية عن طريق تنظيم الاتجار بمستقبلات الغلوتامات (GluRs)^3،4. الجلوتامات، الناقل العصبي المحفز الرئيسي، يربط وينشط الغلورس التي يعبر عنها السطح للسيطرة على الوظائف العصبية الفسيولوجية الأساسية مثل انتقال الأعصاب متشابك واللدونة متشابك. حقيقة أن تغيير الاتجار GluR لوحظ في مجموعة واسعة من الاعتلالات العصبية، بدءا من اضطرابات النمو العصبي إلى الأمراض العصبية التنكسية، يسلط الضوء على أهمية هذه العملية⁵. وبالتالي، فإن فهم الأحداث الجزيئية التي تتحكم في الاتجار بجلوآر هو أمر ذو أهمية في العديد من مجالات البحث.

في هذا البروتوكول، يتم استخدام طريقة تعتمد على تغذية الأجسام المضادة لتحديد مستوى الغلورس التي يتم التعبير عنها على السطح في الخلايا العصبية الرئيسية لفرس النهر، فضلاً عن تقييم كيفية تؤدي التغيرات في الاستيعاب وإعادة التدوير إلى التعبير الصافي للسطح الملاحظ. استخدام الصيدلة و / أو التعبير المفرط من المستقبلات الخارجية التي تأوي طفرات محددة يجعل هذا البروتوكول نهجا قويا بشكل خاص لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء التكيف الخلايا العصبية لمختلف المحفزات البيئية. ومن الأمثلة النهائية على فائدة هذا البروتوكول دراسة كيفية تأثير التغيرات المتعددة العوامل في البيئة (كما هو الحال في نماذج المرض) على الاتجار بجلوآر من خلال فحص التعبير السطحي في هذه النماذج.

باستخدام أمثلة محددة، يتم إثبات في البداية كيف أن التلاعب الدوائي الذي يحاكي التحفيز الفسيولوجي متشابك [LTP الكيميائية (cLTP)] يزيد من التعبير السطحي للوحدة الفرعية GluA1 الذاتية من نوع AMPA من GluRs (AMPARs) ⁶- ويجري أيضا تحليل الاتجار بشكل فوسفي - mimetic مبالغ فيه من الوحدة الفرعية GluN2B من نوع الغلورس NMDA (NMDARs) لتجسيد كيفية استخدام هذا البروتوكول لدراسة تنظيم الاتجار بجلوران اتّصالا ً بمرحلة ما بعد الترجمة التعديلات. على الرغم من أن هذه الأمثلة المحددة تستخدم، يمكن بسهولة تطبيق هذا البروتوكول على GluRs الأخرى وغيرها من المستقبلات والبروتينات التي تمتلك مجالات خارج الخلية المضادة للجينات. في حالة عدم وجود أجسام مضادة متاحة للمجالات خارج الخلية، يمكن أن تساعد البروتينات في وضع العلامات على البروتين في وضع العلامات على الأيض خارج الخلية (على سبيل المثال، العلم، Myc-، GFP-agged، إلخ).

ويوفر البروتوكول الحالي تعليمات لتحديد الكثافة الفرعية المحددة للغلور والاتجار بها باستخدام أجسام مضادة محددة. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة 1) مجموع التعبير السطحي GluR، 2) استيعاب GluR، و 3) إعادة تدوير GluR. ولدراسة كل عملية على حدة، يُنصح بالبدء بالقسمين 1 و2 ومواصلة العمل إما في القسم 3 أو 4 أو 5. في جميع الحالات، الانتهاء معالقسمين 6 و 8 (الشكل 1).

Protocol

وقامت لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة نورث وسترن (البروتوكول #IS00001151) باستعراض الأعمال المتعلقة بإعداد ثقافة فرس النهر الأولية والموافقة عليها.

1. التحضير قبل وضع العلامات

1. إعداد وصيانة الثقافات الرئيسية لفرس النهر
   1. إعداد الثقافات فرس النهر الأولية في كثافة 150،000 خلية مطلية على بولي-د-يسين المغلفة (0.1 ملغ / مل) 18 مم غطاء النظارات. أدلة ممتازة لإعداد الثقافة العصبية منفصلة متوفرة^7،8.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن التعامل مع الثقافات مع السيتوزين أرابينوسيد (آرا-C، 10 mM من DIV1) لتجنب انتشار الدبقية في التحضير.
      ملاحظة: يمكن استخدام الكواشف الطلاء البديلة مثل الفيبرونكتين (1 ملغ / مل) أو لامينين (5 ملغ / مل) بدلا من بولي د-يسين.
   2. الحفاظ على الثقافات في حاضنة الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ في 2 مل / جيدا من وسائل الإعلام العصبية مع B27 و 2 مل L-الجلوتامين.
      ملاحظة: يمكن استخدام بدائل L-الجلوتامين (على سبيل المثال، الجلوتاماكس)، إذا رغبت في ذلك.
   3. على أساس أسبوعي، إزالة نصف حجم وسائل الإعلام واستبدالها بنفس الحجم من وسائل الإعلام العصبية التكميلية.
2. اختياري: التغوط من المستقبلات المتحولة و / أو ذات العلامات الظهارية
   ملاحظة: يجب أن يتم نقل الخلايا العصبية 3-4 أيام على الأقل قبل نقطة وقت التحليل للسماح للتعبير مستقبلات. استخدام الخلايا العصبية الشابة [أيام في المختبر 6-9 (DIV6-9)] يؤدي إلى كفاءة تحويل أفضل من الخلايا العصبية القديمة (DIV15-20)، ولكن يمكن تحقيق عدد كاف من الخلايا المتحولة (>20) بغض النظر عن DIV المستخدمة.
   1. لكل بئر من لوحة 12 جيدا، تمييع 1.5 ميكروغرام من بلازميد تحتوي على بناء الاهتمام في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام العصبية الطازجة دون B27 أو مكملات الجلوتامين في أنبوب الطرد المركزي الجزئي ومزيج عن طريق دوامة بسرعة.
      ملاحظة: للمثّلة الناجحة، من الأهمية بمكان أن تكون الوسائط العصبية المستخدمة طازجة قدر الإمكان، ومن الناحية المثالية أقل من أسبوع واحد بعد فتح الزجاجة.
   2. في أنبوب الطرد المركزي الصغير الثاني، مزيج 1 ميكرولتر من كاشف lipofection المناسبة في 100 درجة مئوية من وسائل الإعلام العصبية الطازجة ومزيج بلطف.
      ملاحظة: لا تُرْكُمخليط الكاشف الليبوفيك. استخدام الكواشف lipofection الطازجة يمكن أن يحسن كفاءة التغوط.
   3. احتضان الأنابيب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
   4. يُضاف خليط الكاشف الليبوفاتيكيعلى إلى خليط الحمض النووي، ويُمزج برفق، ويُحضن لمدة 20 دقيقة في RT.
   5. ضبط حجم الوسائط في كل بئر إلى 1 مل من الوسائط المكيفة.
   6. إضافة كاشف lipofection -DNA خليط قطرة إلى البئر.
   7. اعادة الخلايا الى الحاضنة واتيحت 3-4 ايام على الاقل للتعبير عن البروتين.
      ملاحظة: لأغراض بروتوكولات الاستيعاب وإعادة التدوير المبينة أدناه، تم نقل الخلايا العصبية في فرس النهر في DIV11-12 مع المنشآت التي تعبر عن GluN2B الموسومة GFP في المجال خارج الخلية (GFP-GluN2B) وصورتها في DIV15-16.
3. اختياري: حضانة الخلايا مع المخدرات (بشكل مزمن أو حاد) في وسائل الإعلام مكيفة حتى التثبيت.
   ملاحظة: للعلاج الحاد، بدء علاج الخلايا قبل وضع العلامات. واعتمادا على بروتوكول العلاج من المخدرات المستخدم، يمكن الاحتفاظ بالخلايا في وسائط تحتوي على المخدرات خلال القسم 2. في مثالنا، كانت خلايا DIV21 تخضع لبروتوكول cLTP لزيادة AMPAR 9 التي يعبر عنها السطح^.
   1. تبادل الوسائط مشروطة للحل خارج الخلية (ECS).
   2. علاج الخلايا مع 300 ميكرومتر غليسين في ECS لمدة 3 دقائق في RT. كتحكم، علاج غطاء شقيقة مع ECS (دون الجلايسين).
   3. غسل الخلايا 3X مع 37 درجة مئوية ECS وإعادة الخلايا في ECS (دون الجلايسين) إلى حاضنة الخلية لمدة 20 دقيقة قبل الاستمرار مع القسم 2.
      ملاحظة:ECS (في MM): 150 NaCl، 2 CaCl_2،5 KCl، 10 HEPES، 30 الجلوكوز، 0.001 TTX، 0.01 strychnine، و 0.03 picrotoxin في pH 7.4.

2. وضع العلامات الحية من المستقبلات التي يعبر عنها السطح

1. إعداد الأغطية لوضع العلامات
   1. لحفظ الكواشف وتسهيل التلاعب، نقل coverlips جانب الخلية تصل إلى علبة مغطاة بالبارافين.
      ملاحظة: من المهم عدم السماح للعينات بالجفاف.
   2. حفظ والحفاظ على وسائل الإعلام مكيفة في 37 درجة مئوية لخطوات الحضانة والغسيل.
      ملاحظة: بالنسبة للغطاء 18 مم، يوصى بالحضانة مع 75-100 ميكرولتر من الوسائط لوضع العلامات على الأجسام المضادة و120-150 ميكرولتر للتدخيل/إعادة التدوير.
2. وضع العلامات على مستقبلات السطح مع الأجسام المضادة الأولية
   1. حضانة الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في وسائل الإعلام مكيفة لمدة 15 دقيقة في RT.
      ملاحظة: لمستقبلات GFP الموسومة، تم استخدام الأجسام المضادة للأرنب المضادة لGFP في تخفيف 1:1000. بالنسبة لGluA1 الذاتية، تم استخدام الماوس المضادة GluA1 في تخفيف 1:200.
   2. يستنشق بعناية قبالة وسائل الإعلام التي تحتوي على الأجسام المضادة باستخدام ماصة فراغ وغسل الخلايا ثلاث مرات مع وسائل الإعلام مكيفة.
      ملاحظة: إذا كانت الوسائط المكيفة غير متوفرة، يمكن تنفيذ كافة خطوات الغسيل باستخدام PBS+ [الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 1 mM MgCl₂ و 0.1 mM CaCl₂]. يمكن إجراء الطموح اليدوي باستخدام micropipette إذا لم يكن هناك طموح فراغ لطيف.

3. التعبيرالسطحي (الشكل 2)

1. تسمية الأجسام المضادة الثانوية للمستقبلات التي يعبر عنها السطح
   1. غسل مرة واحدة مع PBS +.
   2. إصلاح الخلايا عن طريق احتضان مع 4٪ بارافورمالهايد (PFA) والسكروز 4٪ في PBS لمدة 7-8 دقائق.
      ملاحظة: على عكس أساليب التثبيت الأخرى مثل حضانة الميثانول، PFA لا permeabilize غشاء البلازما، وبالتالي هو مناسبة لتحليل التعبير السطحي. للحصول على أفضل النتائج، استخدم PFA المعدة حديثًا. التخزين القصير الأجل لPFA عند 4 درجة مئوية أو على المدى الطويل (حتى 30 يوما) التخزين في -20 درجة مئوية هو متساهل لتثبيت كافية.
      تحذير: PFA هو مسرطن معروف. استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة وغطاء محرك السيارة السلامة عند المناولة.
   3. غسل الخلايا ثلاث مرات مع PBS العادية.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام 0.1 M الجلايسين لغسل PFA بدلا من PBS، كما الجلايسين سوف تسقي أي المثبت المتبقية التي قد تزيد من الخلفية في التحضير.
   4. منع مواقع ملزمة غير محددة عن طريق الحضانة مع 10٪ مصل الماعز العادي (NGS) في PBS لمدة 30 دقيقة في RT.
      ملاحظة: يمكن تمديد وقت حظر دون آثار سلبية على وضع العلامات.
   5. حضانة مع الجسم المضاد الثانوي الفلورسنت الموسومة المخففة في 3٪ NGS في PBS لمدة 1 ساعة في RT لتسمية مستقبلات الأولية التي تحمل اسم الأجسام المضادة (أي، سطح أعرب).
      ملاحظة: في هذه الأمثلة، تم استخدام تخفيف 1:500 من الأجسام المضادة الثانوية اليكسا 555-المترافقة: الماعز المضادة للأرنب لمستقبلات GFP المسمى والماعز المضادة للماوس لGluA1.
   6. غسل الخلايا مع PBS 3X.
2. وضع العلامات على المستقبلات داخل الخلايا
   1. الخلايا التبرّهة مع 0.25% تريتون X-100 في PBS لمدة 5-10 دقائق في RT.
      ملاحظة: للتحقق من أن الجولة الأولى من وضع العلامات على الأجسام المضادة تحتل جميع الepitopes السطح، يمكن تخطي هذه الخطوة نفاذيبيليت في ثقافة شقيقة. في هذه الحالة ، لا ينبغي الحصول على أي إشارة لمستقبلات داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، للتحقق من أنه لم يتم تسمية أي مستقبلات داخلية في القسم السابق 2 (أي، مما يدل على سلامة أغشية البلازما في الثقافة)، يمكن تخطي خطوة نفاذية في ثقافة شقيقة، والأجسام المضادة الأولية ضد يمكن استخدام البروتين داخل الخلايا (على سبيل المثال، PSD-95 أو MAP2) في الخطوة 2.2.1. ولا ينبغي الحصول على أي إشارة من هذه المرحلة الابتدائية في ظل هذه الظروف. في هذه الحالة، تم استخدام جسم مضاد مضاد لـ PSD-95 (1:500).
   2. كتلة مع 10٪ NGS في PBS لمدة 30 دقيقة في RT.
   3. تسمية المستقبلات داخل الخلايا عن طريق احتضان الخلايا نفاذية مع نفس الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في القسم 2.2 المخففة في 3٪ NGS في PBS لمدة 1 ساعة في RT.
      ملاحظة: قد يكون تخفيف الأجسام المضادة لوضع العلامات على المستقبلات داخل الخلايا مختلفاً عن تلك المطلوبة لوضع العلامات على المستقبلات التي يعبر عنها السطح. في مثال GluA1، تم استخدام نفس تخفيف الأجسام المضادة (1:200).
   4. غسل الخلايا 3X مع PBS.
   5. تسمية مع ثاني الفلورسنت الموسومة الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 3٪ NGS في PBS لمدة 1 ساعة في RT.
      ملاحظة: في هذه الأمثلة، تم استخدام تخفيف 1:500 من الماعز المضادة للماوس اليكسا 647-المترافق الأجسام المضادة الثانوية (لGluA1).
   6. غسل الخلايا 3X مع PBS.

4. الاستيعاب الداخلي (الشكل 3)

1. استيعاب مستقبلات السطح التي تحمل اسم الأجسام المضادة
   1. بعد وضع العلامات على المستقبلات التي يعبر عنها السطح وغسل الأجسام المضادة (القسم 2.2)، والحفاظ على الخلايا في وسائل الإعلام مكيفة دون الأجسام المضادة وإعادتها إلى الحاضنة (37 درجة مئوية) للسماح للاستيعاب.
      ملاحظة: لمستقبلات NMDA، ينصح 30 دقيقة للتدخيل. كعنصر تحكم، يمكن الحفاظ على ثقافة شقيقة مع وسائل الإعلام مشروطة في 4 درجة مئوية أثناء عملية الاستيعاب الداخلي. وينبغي أن يحدث الحد الأدنى من استيعاب مستقبلات في ظل هذه الظروف.
2. وضع العلامات على المستقبلات السطحية
   1. غسل الخلايا مرة واحدة مع PBS +.
   2. إصلاح الخلايا مع 4٪ PFA والسكروز 4٪ في PBS لمدة 7-8 دقائق.
      تحذير: استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة وغطاء محرك السيارة السلامة عند التعامل مع PFA.
   3. غسل الخلايا 3X مع PBS العادية.
   4. كتلة مع NGS 10٪ في PBS لمدة 30 دقيقة في RT لمنع الربط غير محدد.
   5. احتضان عينات مع الجسم المضاد الثانوي الفلورسنت الموسومة المخففة في 3٪ NGS في PBS لمدة 1 ساعة في RT لتسمية مستقبلات الأولية التي تحمل اسم الأجسام المضادة (أي، مستقبلات أعرب عن سطح التي لم يتم استيعابها).
      ملاحظة: على سبيل المثال، تم استخدام أليكسا 555-المترافقالماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة للأرنب المضادة (1:500) لوضع العلامات.
   6. غسل الخلايا 3X مع PBS.
3. وضع العلامات على المستقبلات الداخلية
   1. الخلايا التبرّهة مع 0.25% تريتون X-100 في PBS لمدة 5-10 دقائق.
   2. منع ملزمة غير محددة عن طريق الحضانة مع 10٪ NGS في PBS لمدة 30 دقيقة في RT.
   3. عينات الحضانة مع الجسم المضاد الثانوي الموسومة الفلورسنت المخففة في 3٪ NGS في PBS لمدة 1 ساعة في RT لتسمية مستقبلات تحمل اسم الأجسام المضادة.
      ملاحظة: على سبيل المثال، يتم استخدام أليكسا 647-المترافقالماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة للأرنب الثانوية (1:500) لوضع العلامات.
   4. غسل الخلايا 3X مع PBS.

5. إعادة التدوير (الشكل 4)

1. استيعاب مستقبلات السطح التي تحمل اسم الأجسام المضادة
   1. بعد وضع العلامات على المستقبلات التي يعبر عنها السطح وغسل الأجسام المضادة (القسم 2.2)، والحفاظ على الخلايا في وسائل الإعلام مكيفة دون الأجسام المضادة وإعادتها إلى الحاضنة (37 درجة مئوية) للسماح للاستيعاب.
      ملاحظة: لمستقبلات NMDA، ينصح 30 دقيقة للتدخيل.
2. حجب مستقبلات سطح مستقر أعرب
   1. لمنع epitopes على الأجسام المضادة الأولية المرفقة بمستقبلات سطح أعرب التي لم يتم استيعابها، وحضانة الخلايا مع غير المنقطعة فاب المضادة للIgG (H + L) شظايا الأجسام المضادة (H + L) المخففة في وسائل الإعلام مكيفة ( 20 ميكروغرام/مل) لمدة 20 دقيقة في RT. يمنع هذا العلاج التفاعل في المستقبل مع الأجسام المضادة الثانوية.
      ملاحظة: على سبيل المثال، تم استخدام شظايا الماعز المضادة للأرانب فاب.
      ملاحظة: تجربة التحكم: لضمان حدوث حظر كامل للمستقبلات التي يتم التعبير عنها على السطح، يمكن احتضان الأغطية الشقيقة مع فاب وبدونها. يجب إصلاح الثقافات مباشرة بعد العلاج فاب، ويتم احتضان كلتا الثقافتين مع اليكسا 555-المترافق الأجسام المضادة الثانوية. لا إشارة اليكسا 555 في الخلايا الحاضنة فاب يشير إلى حجب الأجسام المضادة السليم.
   2. غسل الخلايا 3X مع وسائل الإعلام مكيفة.
   3. حضانة الخلايا مع وسائل الإعلام مكيفة تحتوي على 80 درجة مئوية dynasore لمنع المزيد من التدخيل وإعادة الخلايا إلى الحاضنة (37 درجة مئوية) للسماح لإعادة تدوير المستقبلات الداخلية. Dynasore هو مثبط GTPase الذي يمنع الدينامين وبالتالي يمنع التدخيل.
      ملاحظة: يوصى بـ 45 دقيقة لإعادة تدوير NMDAR. لاحظ أن Dynasore يمنع بشكل خاص عملية الاستيعاب المعتمد على dynamin (على سبيل المثال، الاستيعاب NMDARs). ومع ذلك، يمكن أن يحدث استيعاب البروتين متشابك أخرى (دينامين مستقلة) لا يزال في وجود ديناسور.
3. وضع العلامات على المستقبلات المعاد تدويرها
   1. غسل الخلايا مرة واحدة مع PBS +.
   2. إصلاح الخلايا مع 4٪ PFA والسكروز 4٪ في PBS لمدة 7-8 دقائق.
      تحذير: استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة وغطاء محرك السيارة السلامة عند التعامل مع PFA.
   3. غسل الخلايا 3X مع PBS.
   4. كتلة مع NGS 10٪ في PBS لمدة 30 دقيقة في RT لمنع الربط غير محدد.
   5. خلايا التسمية مع أول الجسم المضاد الثانوي الفلورسنت الموسومة المخففة في 3٪ NGS في PBS لمدة 1 ساعة في RT.
      ملاحظة: على سبيل المثال، تم استخدام أليكسا 555-المترافقالماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة للأرنب (1:500) لوضع العلامات.
   6. غسل الخلايا 3X مع PBS.
      ملاحظة: قد تساعد عمليات النُشَم الأطول مع PBS (5-10 دقائق) في تقليل الخلفية في الإعداد.
4. وضع العلامات على المستقبلات الداخلية
   1. الخلايا التبرّهة مع 0.25% تريتون X-100 في PBS لمدة 5-10 دقائق.
   2. كتلة مع 10٪ NGS في PBS لمدة 30 دقيقة في RT.
   3. تسمية مع ثاني الفلورسنت الموسومة الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 3٪ NGS في PBS لمدة 1 ساعة في RT.
      ملاحظة: على سبيل المثال، تم استخدام أليكسا 647-المترافقة الماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة للأرنب (1:500) لوضع العلامات.
   4. غسل الخلايا 3X مع PBS.

6. تركيب وتصوير العينات

1. قم بتركيب الخلايا عن طريق وضع جانب الخلية في الأغطية برفق على 12-15 مل من الوسائط التركيبية المناسبة.
   ملاحظة: وسيؤدي التطلع إلى زيادة الوسائط المتصاعدة إلى تحسين نوعية الصور.
2. خلايا الصورة على المجهر البؤري المناسب.
   ملاحظة: فمن المستحسن أن صورة z-كومة في التكبير 60X مع خطوات 0.35 درجة مئوية, تشمل سمك كامل من الخلايا العصبية.

7. اعتبارات الوقت

1. هذا بروتوكول طويل يمكن إيقافه في عدة نقاط. إذا رغبت في ذلك، قم بإجراء خطوات حظر وحضانة الأجسام المضادة الأساسية بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في غرفة رطبة.
2. بدلا من ذلك، إذا رغبت في ذلك، استخدم معالج الأنسجة الميكروويف لتسريع إلى حد كبير بعد التثبيت أوقات الحضانة. لجميع الخطوات، استخدم 150 وات عند 30 درجة مئوية لإعدادات "التشغيل".
   1. لمنع، تشغيل المعالج في 2 دقيقة "على"، 1 دقيقة "إيقاف"، و 2 دقيقة "على".
   2. بالنسبة لخطوات حضانة الأجسام المضادة الأساسية والثانوية، قم بتشغيل المعالج في 3 دقائق "تشغيل"، ودقيقتين "إيقاف التشغيل"، و3 دقائق "تشغيل".
      ملاحظة: ونحن لا نلاحظ أي فرق في الجودة عن طريق إجراء التعديلات المذكورة أعلاه على البروتوكول.

8. تحليل الصور

1. من المستحسن استخدام FIJI لإجراء تحليل الصورة، لأنه متوافق مع تنسيقات ملفات متعددة. بالنسبة لبياناتنا، تم الحصول على صور بتنسيق ملف نيكون ND2.
2. يتم توفير برنامج نصي ماكرو لتحديد كمية دفعية سهلة من معلمات مختلفة تم اختيارها مسبقًا من قبل FIJI. يتم تضمين الخطوات التالية في الماكرو:
   ملاحظة: وبالنسبة لهذه الأمثلة، تم قياس "الكثافة المتكاملة".
3. افتح ملفات الصور في FIJI وقنوات منفصلة.
4. Z-project كل كومة قناة كإسقاط كثافة قصوى.
5. تعيين عتبة أقل لكل قناة.
   ملاحظة: وينبغي تحديد العتبات تجريبيالكل مجموعة بيانات تجريبية. في حين يمكن أن يكون لكل قناة قيمة عتبة أقل منفصلة، فمن المهم أن يتم الاحتفاظ قيم عتبة القناة باستمرار لجميع الصور من نفس مجموعة البيانات.
6. اختر ثلاثة إلى خمسة من الديندرات الثانوية أو الثالثة ووفرها كمناطق ذات أهمية.
7. قياس الكثافة المتكاملة لكل عائد استثمار في القنوات السطحية وداخل الخلايا.
8. قم بتطبيع الإشارة لكل عائد استثمار عن طريق تقسيم قيمة الكثافة المتكاملة للقناة السطحية على القناة داخل الخلايا.
9. كرر قياسات جميع الصور التجريبية والتحكم وتطبيع القيم التجريبية للتحكم في القيم (على سبيل المثال، GluN2B WT أو شروط عدم الجلايسين).

النتائج

ويستند هذا البروتوكول لدراسة الاتجار مستقبلات الغلوتامات على وضع العلامات التفاضلية للمستقبلات المعبر عنها في سطح الخلية وتلك التي أعرب عنها في الأغشية الداخلية. ويتحقق الفصل عن طريق وضع العلامات على المستقبلات قبل وبعد نفاذية الغشاء، وذلك باستخدام نفس الجسم المضاد ا?...

Discussion

التفاعل بين الخلية وبيئتها (على سبيل المثال، التواصل مع الخلايا الأخرى، والاستجابة لمحفزات مختلفة، وما إلى ذلك)، يعتمد بشكل كبير على التعبير الصحيح للمستقبلات على سطح الخلية. التنظيم السريع والدقيق في محتوى المستقبلات التي يتم التعبير عنها على السطح يتيح الاستجابة الخلوية المناسبة لبيئ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses	Neuvitro	GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary	Life Technologies	A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary	Life Technologies	A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary	Life Technologies	A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary	Life Technologies	A21245
B27	Gibco	17504044
CaCl2	Sigma	C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning	3513
Dynasore	Tocris	2897
Glucose	Sigma	G8270
Glycine	Tocris	0219
Goat anti-rabbit Fab fragments	Sigma	SAB3700970
HEPES	Sigma	H7006
KCl	Sigma	P9541
L-Glutamine	Sigma	G7513
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Mouse anti-GluA1 antibody	Millipore	MAB2263
NaCl	Sigma	S6546
Neurobasal Media	Gibco	21103049
NGS	Abcam	Ab7481
Parafilm	Bemis	PM999
PBS	Gibco	10010023
Pelco BioWave	Ted Pella	36500
PFA	Alfa Aesar	43368
Picrotoxin	Tocris	1128
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
ProLong Gold Antifade Mountant	Life Technologies	P36934
Rabbit anti-GFP antibody	Invitrogen	A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody	Cell Signaling	2507
Strychnine	Tocris	2785
Sucrose	Sigma	S0389
Superfrost plus microscope slides	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	X100
TTX	Tocris	1078