Ein Antikörper-Fütterungsansatz zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels in dissoziierten primären Hippocampuskulturen

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels (GluR) in dissoziierten primären Hippocampuskulturen vor. Mit einem Antikörper-Fütterungsansatz zur Kennzeichnung endogenes oder überexprimierter Rezeptoren in Kombination mit pharmakologischen Ansätzen ermöglicht diese Methode die Identifizierung molekularer Mechanismen zur Regulierung der GluR-Oberflächenexpression durch Modulation Internalisierungs- oder Recyclingprozesse.

Zusammenfassung

Zelluläre Reaktionen auf äußere Reize hängen stark von der Reihe von Rezeptoren ab, die zu einem bestimmten Zeitpunkt an der Zelloberfläche ausgedrückt werden. Dementsprechend passt sich die Population der oberflächenausgedrückten Rezeptoren ständig an und unterliegt strengen Regulationsmechanismen. Das paradigmatische Beispiel und eines der am meisten untersuchten Handelsereignisse in der Biologie ist die regulierte Kontrolle der synaptischen Expression von Glutamatrezeptoren (GluRs). GluRs vermitteln die überwiegende Mehrheit der exzitatorischen Neurotransmission im zentralen Nervensystem und steuern physiologische aktivitätsabhängige funktionelle und strukturelle Veränderungen auf synaptischer und neuronaler Ebene (z. B. synaptische Plastizität). Veränderungen in der Anzahl, Lage und UntereinheitZusammensetzung der Oberfläche ausgedrückt GluRs tief beeinflussen neuronale Funktion und in der Tat, Veränderungen in diesen Faktoren sind mit verschiedenen Neuropathien verbunden. Präsentiert hier ist eine Methode zur Untersuchung des GluR-Handels mit dissoziierten Hippocampus-Primärneuronen. Ein "Antikörper-Feeding"-Ansatz wird verwendet, um GluR-Populationen, die an der Oberfläche und den inneren Membranen ausgedrückt werden, differenziell zu visualisieren. Durch die Kennzeichnung von Oberflächenrezeptoren auf lebenden Zellen und deren Fixierung zu unterschiedlichen Zeitpunkten, um Rezeptoren-Endozytose und/oder Recycling zu ermöglichen, können diese Handelsprozesse evaluiert und selektiv untersucht werden. Dies ist ein vielseitiges Protokoll, das in Kombination mit pharmakologischen Ansätzen oder Überexpression veränderter Rezeptoren verwendet werden kann, um wertvolle Informationen über Reize und molekulare Mechanismen zu gewinnen, die den GluR-Handel beeinflussen. In ähnlicher Weise kann es leicht angepasst werden, um andere Rezeptoren oder oberflächenausgedrückte Proteine zu untersuchen.

Einleitung

Zellen nutzen den aktiven Prozess des Menschenhandels, um Proteine zu bestimmten subzellulären Lokalisationen zu mobilisieren und eine strenge raumzeitliche Regulierung über ihre Funktion auszuüben¹. Dieser Prozess ist besonders wichtig für Transmembran-Rezeptoren, da zelluläre Reaktionen auf verschiedene Umweltreize auf intrazellulären Kaskaden beruhen, die durch Dieoraktivierung ausgelöst werden. Zellen sind in der Lage, diese Reaktionen zu ändern, indem sie die Dichte, Lokalisierung und Zusammensetzung der Untereinheiten von Rezeptoren ändern, die an der Zelloberfläche über die subzelluläre Handelsverordnung^desRezeptors 2 ausgedrückt werden. Das Einsetzen von neu synthetisierten Rezeptoren in die Plasmamembran, zusammen mit Endozytose und Recycling bestehender Rezeptoren sind Beispiele für Menschenhandelsprozesse, die den Netzpool von oberflächenausgedrückten Rezeptoren bestimmen². Viele molekulare Mechanismen arbeiten zusammen, um den Proteinhandel zu regulieren, einschließlich Protein-Protein-Wechselwirkungen und posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierung, Ubiquitination oder Palmitoylierung².

Die Regulierung des Rezeptorhandels ist insbesondere in stark polarisierten Zellen mit hochspezialisierten Strukturen erforderlich. Das paradigmatische Beispiel ist die Kontrolle der neuronalen Funktion durch regulierten Handel mit Glutamatrezeptoren (GluRs)^3,4. Glutamat, der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter, bindet und aktiviert oberflächenexprimierte GluRs, um grundlegende physiologische neuronale Funktionen wie synaptische Neurotransmission und synaptische Plastizität zu steuern. Die Tatsache, dass veränderter GluR-Handel in einem breiten Spektrum von Neuropathien beobachtet wurde, von neuroentwicklungsbedingten Störungen bis hin zu neurodegenerativen Erkrankungen, unterstreicht die Bedeutung dieses Prozesses⁵. Daher ist das Verständnis der molekularen Ereignisse, die den GluR-Handel kontrollieren, in vielen Forschungsbereichen von Interesse.

In diesem Protokoll wird eine Antikörper-Fütterungsmethode verwendet, um den Gehalt an oberflächenausgedrückten GluRs in primären Hippocampus-Neuronen zu quantifizieren und zu bewerten, wie Veränderungen der Internalisierung und des Recyclings zur beobachteten Nettooberflächenexpression führen. Die Verwendung von Pharmakologie und/oder Überexpression von exogenen Rezeptoren mit spezifischen Mutationen macht dieses Protokoll zu einem besonders leistungsfähigen Ansatz für die Untersuchung molekularer Mechanismen, die der neuronalen Anpassung an verschiedene Umweltreize zugrunde liegen. Ein letztes Beispiel für den Nutzen dieses Protokolls ist die Untersuchung, wie sich multifaktorielle Veränderungen in der Umwelt (z. B. bei Krankheitsmodellen) durch die Untersuchung der Oberflächenexpression in solchen Modellen auf den GluR-Handel auswirkt.

Anhand spezifischer Beispiele wird zunächst demonstriert, wie eine pharmakologische Manipulation, die physiologische synaptische Stimulation imitiert [chemische LTP (cLTP)] die Oberflächenexpression der endogenen GluA1-Untereinheit des AMPA-Typs von GluRs (AMPARs) ^{erhöht. 6}. Der Handel mit einer überexprimierten phospho-mimetischen Form der GluN2B-Untereinheit von GluRs (NMDARs) vom Typ NMDA wird ebenfalls analysiert, um zu veranschaulichen, wie dieses Protokoll verwendet werden kann, um die Regulierung des GluR-Handels durch spezifische posttranslationale Änderungen. Obwohl diese spezifischen Beispiele verwendet werden, kann dieses Protokoll leicht auf andere GluRs und andere Rezeptoren und Proteine angewendet werden, die antigene extrazelluläre Domänen besitzen. Für den Fall, dass keine Antikörper für extrazelluläre Domänen verfügbar sind, können Überexpression von extrazellulären Epitop-Tags (z. B. Flag-, Myc-, GFP-taggt, etc.) Proteine bei der Proteinkennzeichnung helfen.

Das aktuelle Protokoll enthält Anweisungen zur Quantifizierung der spezifischen GluR-Subtypdichte und des Menschenhandels mit spezifischen Antikörpern. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um 1) die gesamte GluR-Oberflächenexpression, 2) GluR-Internalisierung und 3) GluR-Recycling zu untersuchen. Um jeden Prozess einzeln zu studieren, wird empfohlen, mit den Abschnitten 1 und 2 zu beginnen und entweder mit Abschnitt 3, 4 oder 5 fortzufahren. In allen Fällen mit den Abschnitten 6 und 8 beenden (Abbildung 1).

Protokoll

Die Arbeiten im Zusammenhang mit der Vorbereitung der Primärkultur im Hippocampus wurden vom Northwestern University Animal Care and Use Committee (Protokoll #IS00001151) überprüft und genehmigt.

1. Vorbereitung vor der Etikettierung

1. Vorbereitung und Aufrechterhaltung der primären Hippocampuskulturen
   1. Bereiten Sie primäre Hippocampuskulturen mit einer Dichte von 150.000 Zellen vor, die auf poly-D-Lysin-beschichteten (0,1 mg/ml) 18 mm Deckgläsern plattiert sind. Ausgezeichnete Anleitungen für dissoziierte neuronale Kulturvorbereitung sind verfügbar^7,8.
      HINWEIS: Bei Bedarf können die Kulturen mit Zytosin-Arabinosid (Ara-C, 10 mM von DIV1) behandelt werden, um eine Gliaproliferation in der Zubereitung zu vermeiden.
      HINWEIS: Anstelle von Poly-D-Lysin können alternative Beschichtungsreagenzien wie Fibronectin (1 mg/ml) oder Laminin (5 mg/ml) verwendet werden.
   2. Bewahren Sie die Kulturen in einem Zellinkubator bei 37 °C und 5% CO2 in 2 ml/Well neurobasaler Medien, ergänzt durch B27 und 2 mM L-Glutamin.
      HINWEIS: Ersatzstoffe für L-Glutamin (z.B. Glutamax) können auf Wunsch verwendet werden.
   3. Auf wöchentlicher Basis, entfernen Sie die Hälfte der Menge der Medien und ersetzen Sie mit dem gleichen Volumen von ergänzten neurobasalen Medien.
2. OPTIONAL: Transfektion mutierter und/oder epitopmarkierter Rezeptoren
   HINWEIS: Neuronen sollten mindestens 3 bis 4 Tage vor dem Analysezeitpunkt transfiziert werden, um eine Rezeptorexpression zu ermöglichen. Die Verwendung junger Neuronen [Tage in vitro 6–9 (DIV6–9)] führt zu einer besseren Transfektionseffizienz als ältere (DIV15–20) Neuronen, aber eine ausreichende Anzahl von transfizierten Zellen (>20) kann unabhängig von der verwendeten DIV erreicht werden.
   1. Für jeden Brunnen einer 12-Well-Platte 1,5 g Plasmid verdünnen, das das Konstrukt von Interesse in 100 l frischen neurobasalen Medien ohne B27 oder Glutamin-Supplementierung in einem Mikrozentrifugenrohr enthält, und durch schnelles Wirbeln mischen.
      HINWEIS: Für eine erfolgreiche Transfektion ist es wichtig, dass die verwendeten neurobasalen Medien so frisch wie möglich sind, idealerweise weniger als 1 Woche nach dem Flaschenöffnen.
   2. In einem zweiten Mikrozentrifugenrohr 1 L eines geeigneten Lipofektionsreagenzes in 100 l frischen neurobasalen Medien mischen und sanft mischen.
      HINWEIS: Wirbeln Sie die Lipofektionsreagenzmischung nicht. Die Verwendung von frischen Lipofektionsreagenzien kann die Transfektionseffizienz verbessern.
   3. Inkubieren Sie die Rohre für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
   4. Fügen Sie die Lipofection Reagenz Mischung tropfenweise in die DNA-Mischung, mischen Sie sanft, und inkubieren für 20 min bei RT.
   5. Passen Sie die Medienlautstärke in jedem Brunnen auf 1 ml konditionierte Medien an.
   6. Fügen Sie das Lipofection-Reagenz -DNA-Mischung tropfenweise in den Brunnen.
   7. Geben Sie die Zellen in den Inkubator zurück und lassen Sie mindestens 3 bis 4 Tage für die Proteinexpression ein.
      HINWEIS: Für die zwecke der unten beschriebenen Internalisierungs- und Recyclingprotokolle wurden Hippocampus-Neuronen bei DIV11–12 mit Konstrukten transfiziert, die GluN2B mit GFP in der extrazellulären Domäne (GFP-GluN2B) kenngegliedert und bei DIV15–16 abgebildet sind.
3. OPTIONAL: Inkubation von Zellen mit Medikamenten (chronisch oder akut) in den konditionierten Medien bis zur Fixierung.
   HINWEIS: Für die akute Behandlung beginnen Sie mit der Behandlung von Zellen vor der Etikettierung. Je nach verwendetem Arzneimittelbehandlungsprotokoll können Zellen in medikamentenhaltigen Medien während Abschnitt 2 aufrechterhalten werden. In unserem Beispiel waren DIV21-Zellen einem cLTP-Protokoll unterworfen, um die Oberfläche exprimierte AMPAR⁹zu erhöhen.
   1. Exchange-Konditionierte Medien für extrazelluläre Lösung (ECS).
   2. Behandeln Sie Zellen mit 300 M Glycin in ECS für 3 min bei RT. Behandeln Sie als Kontrolle einen Schwesterdeckel mit ECS (ohne Glycin).
   3. Waschen Sie Zellen 3x mit 37 °C ECS und geben Sie die Zellen in ECS (ohne Glycin) 20 min lang in den Zellinkubator zurück, bevor Sie mit Abschnitt 2 fortfahren.
      ANMERKUNG: ECS (in mM): 150 NaCl, 2 CaCl₂, 5 KCl, 10 HEPES, 30 Glucose, 0.001 TTX, 0.01 Strychnine und 0.03 Picrotoxin bei pH 7.4.

2. Live-Etikettierung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren

1. Vorbereiten von Coverlips für die Etikettierung
   1. Um Reagenzien zu speichern und die Manipulation zu erleichtern, transferieren Sie Dielipse auf der Zellseite bis zu einem paraffinfilmbedeckten Fach.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Proben niemals austrocknen zu lassen.
   2. Speichern und pflegen Sie konditionierte Medien bei 37 °C für Inkubations- und Waschschritte.
      HINWEIS: Für einen 18-mm-Abdeckungsschlupf wird eine Inkubation mit 75–100 l Medien für die Antikörperkennzeichnung und 120–150 l für die Internalisierung/Recycling empfohlen.
2. Kennzeichnung von Oberflächenrezeptoren mit Primärantikörpern
   1. Inkubieren Sie Zellen mit primärem Antikörper, der in konditionierten Medien für 15 min bei RT verdünnt wird.
      HINWEIS: Für GFP-markierte Rezeptoren wurde ein Anti-GFP-Antikörper gegen Kaninchen bei einer Verdünnung von 1:1000 verwendet. Für endogenes GluA1 wurde Maus anti-GluA1 bei einer Verdünnung von 1:200 verwendet.
   2. Saugen Sie die antikörperhaltigen Medien vorsichtig mit einer Vakuumpipette ab und waschen Sie Zellen dreimal mit konditionierten Medien.
      HINWEIS: Wenn konditionierte Medien nicht verfügbar sind, können alle Waschschritte mit PBS+ [Phosphatgepufferte Saline (PBS) mit 1 mM MgCl₂ und 0,1 mM CaCl₂] durchgeführt werden. Die manuelle Aspiration mit einer Mikropipette kann durchgeführt werden, wenn keine schonende Vakuumaspiration verfügbar ist.

3. Oberflächenausdruck (Abbildung 2)

1. Sekundäre Antikörperkennzeichnung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren
   1. Einmal mit PBS+ waschen.
   2. Fixzellen durch Inkubation mit 4% Paraformaldehyd (PFA) und 4% Saccharose in PBS für 7–8 min.
      HINWEIS: Im Gegensatz zu anderen Fixierungsmethoden wie der Methanolinkubisierung durchdringt PFA die Plasmamembran nicht und eignet sich daher für die Oberflächenexpressionsanalyse. Für optimale Ergebnisse verwenden Sie frisch zubereitetes PFA. Die kurzfristige Lagerung von PFA bei 4 °C oder eine Langzeitlagerung (bis zu 30 Tagen) bei -20 °C ist für eine angemessene Fixierung zulässig.
      ACHTUNG: PFA ist ein bekanntes Karzinogen. Verwenden Sie bei der Handhabung die richtige persönliche Schutzausrüstung und eine Schutzhaube.
   3. Waschen Sie Zellen dreimal mit regulären PBS.
      HINWEIS: Alternativ kann 0,1 M Glycin zum Waschen von PFA anstelle von PBS verwendet werden, da Glycin alle verbleibenden Fixierungen, die den Hintergrund in der Zubereitung erhöhen können, abschrecken.
   4. Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen, indem Sie mit 10% normalem Ziegenserum (NGS) in PBS für 30 min bei RT inkubieren.
      HINWEIS: Die Sperrzeit kann ohne nachteilige Auswirkungen auf die Etikettierung verlängert werden.
   5. Inkubieren Sie mit fluoreszierend markiertem Sekundärantikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wird, um primäre Antikörper-markierte Rezeptoren (d. h. oberflächenausgedrückt) zu kennzeichnen.
      HINWEIS: In diesen Beispielen wurde eine 1:500 Verdünnung von Alexa 555-konjugierten Sekundärantikörpern verwendet: Ziegen-Anti-Kaninchen für GFP-markierte Rezeptoren und Ziegenantimaus für GluA1.
   6. Waschen Sie Zellen mit PBS 3x.
2. Kennzeichnung von intrazellulären Rezeptoren
   1. Permeabilisieren Sie Zellen mit 0,25% Triton X-100 in PBS für 5–10 min bei RT.
      HINWEIS: Um zu überprüfen, ob die anfängliche Runde der Antikörperkennzeichnung alle Oberflächenepitope einnimmt, kann dieser Permeabilisierungsschritt in einer Schwesterkultur übersprungen werden. In diesem Fall sollte kein Signal für intrazelluläre Rezeptoren erhalten werden. Um zu überprüfen, ob im vorherigen Abschnitt 2 keine internen Rezeptoren gekennzeichnet wurden (d. h. die Integrität der Plasmamembranen in der Kultur zeigen), kann der Permeabilisierungsschritt in einer Schwesterkultur übersprungen werden, und ein primärer Antikörper gegen intrazelluläres Protein (z. B. PSD-95 oder MAP2) kann in Schritt 2.2.1 verwendet werden. Unter diesen Bedingungen sollte kein Signal von diesem Primär erhalten werden. In diesem Fall wurde ein Kaninchen Anti-PSD-95 Antikörper (1:500) verwendet.
   2. Block mit 10% NGS in PBS für 30 min bei RT.
   3. Etikettieren Sie intrazelluläre Rezeptoren durch Inkubation permeabilisierter Zellen mit demselben primären Antikörper, der in Abschnitt 2.2 verwendet wird, verdünnt in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT.
      HINWEIS: Die Antikörperverdünnung zur Kennzeichnung intrazellulärer Rezeptoren kann anders sein als die, die für die Kennzeichnung oberflächenausgedrückter Rezeptoren erforderlich ist. Im Beispiel von GluA1 wurde die gleiche Antikörperverdünnung (1:200) verwendet.
   4. Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.
   5. Etikett mit zweitem fluoreszierend markiertem Sekundärantikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wird.
      HINWEIS: In diesen Beispielen wurde eine 1:500 Verdünnung der Ziegenantimaus Alexa 647-konjugierten Sekundärantikörper (für GluA1) verwendet.
   6. Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.

4. Internalisierung (Abbildung 3)

1. Internalisierung von Antikörper-markierten Oberflächenrezeptoren
   1. Nach der Kennzeichnung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren und Antikörperwäsche (Abschnitt 2.2) zellenin konditionierten Medien ohne Antikörper pflegen und an den Inkubator (37 °C) zurückgeben, um eine Internalisierung zu ermöglichen.
      HINWEIS: Für NMDA-Rezeptoren wird 30 min zur Internalisierung empfohlen. Als Kontrolle kann eine Schwesterkultur mit konditionierten Medien bei 4 °C während des Internalisierungsprozesses aufrechterhalten werden. Minimale Rezeptor-Internalisierung sollte unter diesen Bedingungen auftreten.
2. Kennzeichnung von Oberflächenrezeptoren
   1. Einmal Zellen mit PBS+ waschen.
   2. Fix Zellen mit 4% PFA und 4% Saccharose in PBS für 7-8 min.
      ACHTUNG: Verwenden Sie beim Umgang mit PFA die richtige persönliche Schutzausrüstung und eine Schutzhaube.
   3. Waschen Sie Zellen 3x mit regulären PBS.
   4. Block mit 10% NGS in PBS für 30 min bei RT, um unspezifische Bindung zu verhindern.
   5. Inkubieren Sie Proben mit fluoreszierend markiertem sekundären Antikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wurde, um primäre Antikörper-markierte Rezeptoren (d. h. oberflächenausgedrückte Rezeptoren, die nicht internalisiert wurden) zu kennzeichnen.
      HINWEIS: In diesem Beispiel wurde Alexa 555-konjugierter Ziegenanti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500) zur Kennzeichnung verwendet.
   6. Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.
3. Kennzeichnung von internalisierten Rezeptoren
   1. Permeabilisieren Sie Zellen mit 0,25% Triton X-100 in PBS für 5–10 min.
   2. Blockieren Sie unspezifische Bindung durch Inkubation mit 10% NGS in PBS für 30 min bei RT.
   3. Inkubieren Sie Proben mit fluoreszierend markiertem sekundären Antikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wird, um internalisierte Antikörper-markierte Rezeptoren zu kennzeichnen.
      HINWEIS: In diesem Beispiel wird Alexa 647-konjugierter Ziegenanti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500) zur Kennzeichnung verwendet.
   4. Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.

5. Recycling (Abbildung 4)

1. Internalisierung von Antikörper-markierten Oberflächenrezeptoren
   1. Nach der Kennzeichnung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren und Antikörperwäsche (Abschnitt 2.2) zellenin konditionierten Medien ohne Antikörper pflegen und an den Inkubator (37 °C) zurückgeben, um eine Internalisierung zu ermöglichen.
      HINWEIS: Für NMDA-Rezeptoren wird 30 min zur Internalisierung empfohlen.
2. Blockierung stabiler Oberflächenexprimoren
   1. Um die Epitope des primären Antikörpers zu blockieren, der an oberflächenexprimierten Rezeptoren befestigt ist, die nicht internalisiert wurden, inkubieren Zellen mit unkonjugierten Fab-Anti-IgG-Antikörperfragmenten (gegen die in Abschnitt 2.2 verwendeten primär verwendeten) in konditionierten Medien ( 20 g/ml) für 20 min bei RT. Diese Behandlung verhindert zukünftige Wechselwirkungen mit sekundären Antikörpern.
      HINWEIS: Für dieses Beispiel wurden Ziegenanti-Kaninchen Fab-Fragmente verwendet.
      HINWEIS: Kontrollexperiment: Um sicherzustellen, dass eine vollständige Blockierung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren stattgefunden hat, können Schwesterabdeckungen mit und ohne Fab inkubiert werden. Kulturen sollten unmittelbar nach der Fab-Behandlung fixiert werden, und beide Kulturen werden mit Alexa 555-konjugiertem Sekundärantikörper inkubiert. Kein Alexa 555 Signal in den Fab-inkubierten Zellen weist auf eine ordnungsgemäße Antikörperblockierung hin.
   2. Waschen Sie Zellen 3x mit konditionierten Medien.
   3. Inkubieren Sie Zellen mit konditionierten Medien, die 80 M Dynasore enthalten, um eine weitere Internalisierung zu verhindern und Zellen in den Inkubator (37 °C) zurückbringen, um das Recycling von internalisierten Rezeptoren zu ermöglichen. Dynasore ist ein GTPase-Hemmer, der Dynamin hemmt und somit eine Internalisierung verhindert.
      HINWEIS: 45 min für NMDAR-Recycling wird empfohlen. Beachten Sie, dass Dynasore ausschließlich den dynaminabhängigen Internalisierungsprozess blockiert (z. B. NMDARs Internalisierung). Jedoch, Internalisierung von anderen synaptischen Protein (dynamin-unabhängig) kann immer noch in Gegenwart von Dynasore auftreten.
3. Kennzeichnung von recycelten Rezeptoren
   1. Einmal Zellen mit PBS+ waschen.
   2. Fix Zellen mit 4% PFA und 4% Saccharose in PBS für 7-8 min.
      ACHTUNG: Verwenden Sie beim Umgang mit PFA die richtige persönliche Schutzausrüstung und eine Schutzhaube.
   3. Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.
   4. Block mit 10% NGS in PBS für 30 min bei RT, um unspezifische Bindung zu verhindern.
   5. Etikettzellen mit erstem fluoreszierend markiertem Sekundärantikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wird.
      HINWEIS: Für dieses Beispiel wurde Alexa 555-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (1:500) zur Kennzeichnung verwendet.
   6. Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.
      HINWEIS: Längere Wässerungen mit PBS (5–10 min) können helfen, den Hintergrund in der Vorbereitung zu reduzieren.
4. Kennzeichnung von internalisierten Rezeptoren
   1. Permeabilisieren Sie Zellen mit 0,25% Triton X-100 in PBS für 5–10 min.
   2. Block mit 10% NGS in PBS für 30 min bei RT.
   3. Etikett mit zweitem fluoreszierend markiertem Sekundärantikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wird.
      HINWEIS: Für dieses Beispiel wurde Alexa 647-konjugierter Ziegen-Antikaninchen-Antikörper (1:500) zur Kennzeichnung verwendet.
   4. Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.

6. Montage und Bildgebung von Proben

1. Montieren Sie Zellen, indem Sie die Abdeckungslipsen-Zellseite vorsichtig auf 12–15 ml des entsprechenden Montagemediums nach unten legen.
   HINWEIS: Die Aspiration von überschüssigen Montagemedien wird die Qualität der Bilder verbessern.
2. Bildzellen auf einem geeigneten konfokalen Mikroskop.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Z-Stack bei 60-facher Vergrößerung mit 0,35 m Schritten abzubilden, der die gesamte Dicke des Neurons umfasst.

7. Zeitüberlegungen

1. Dies ist ein langes Protokoll, das an mehreren Punkten angehalten werden kann. Wenn gewünscht, führen Sie Blockierungs- und Primärantikörperinkubationsschritte über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer durch.
2. Alternativ, wenn gewünscht, verwenden Sie einen Mikrowellen-Gewebeprozessor, um die Inkubationszeiten nach der Fixierung erheblich zu beschleunigen. Verwenden Sie für alle Schritte 150 W bei 30 °C für die "Ein"-Einstellungen.
   1. Um zu blockieren, führen Sie den Prozessor bei 2 min "Ein", 1 min "Aus" und 2 min "Ein".
   2. Führen Sie den Prozessor für primäre und sekundäre Antikörperinkubationsschritte bei 3 min "Ein", 2 min "Aus" und 3 min "Ein" aus.
      HINWEIS: Wir beobachten keinen Qualitätsunterschied, indem wir die oben genannten Änderungen am Protokoll vornehmen.

8. Bildanalyse

1. Es wird empfohlen, FIJI zu verwenden, um Bildanalysen durchzuführen, da sie mit mehreren Dateiformaten kompatibel sind. Für unsere Daten wurden Bilder im Nikon ND2-Dateiformat aufgenommen.
2. Für die einfache Batch-Quantifizierung verschiedener Parameter, die von FIJI vorab ausgewählt wurden, wird ein Makroskript bereitgestellt. Die folgenden Schritte sind im Makro enthalten:
   HINWEIS: Für diese Beispiele wurde die "integrierte Intensität" gemessen.
3. Öffnen Sie die Bilddateien in FIJI und separate Kanäle.
4. Z-Projekt jedes Kanalstapels als maximale Intensitätsprojektion.
5. Legen Sie einen niedrigeren Schwellenwert für jeden Kanal fest.
   HINWEIS: Für jeden experimentellen Datensatz sollten empirisch Schwellenwerte ermittelt werden. Obwohl jeder Kanal einen separaten niedrigeren Schwellenwert haben kann, ist es entscheidend, dass Kanalschwellenwerte für alle Bilder desselben Datensatzes konsistent beibehalten werden.
6. Wählen Sie drei bis fünf sekundäre oder tertiäre Dendriten aus und speichern Sie sie als Interessengebiete (ROIs).
7. Messen Sie die integrierte Dichte jedes ROI in Oberflächen- und intrazellulären Kanälen.
8. Normalisieren Sie das Signal für jeden ROI, indem Sie den integrierten Dichtewert des Oberflächenkanals durch den intrazellulären Kanal dividieren.
9. Wiederholen Sie die Messungen für alle Kontroll- und Versuchsbilder und normalisieren Sie experimentelle Werte, um Werte (z. B. GluN2B WT oder No-Glycin-Bedingungen) zu steuern.

Ergebnisse

Dieses Protokoll zur Untersuchung des Schmieramrezeptorhandels basiert auf der Differentialkennzeichnung von Rezeptoren, die an der Zelloberfläche ausgedrückt werden, und solchen, die in internen Membranen ausgedrückt werden. Die Segregation wird durch die Kennzeichnung der Rezeptoren vor und nach der Membranpermeabilisierung unter Verwendung desselben primären Antikörpers, aber eines sekundären Antikörpers, der mit einem anderen Fluorophor konjugiert ist, erreicht. Wie in den opti...

Diskussion

Die Interaktion zwischen einer Zelle und ihrer Umgebung (z. B. Kommunikation mit anderen Zellen, Reaktion auf unterschiedliche Reize usw.) beruht stark auf der korrekten Expression von Rezeptoren an der Zelloberfläche. Die schnelle und fein abgestimmte Regulierung des oberflächenausgedrückten Rezeptorinhalts ermöglicht eine angemessene zelluläre Reaktion auf eine sich ständig verändernde Umgebung. Im besonderen Fall von Neuronen, Veränderungen in der Anzahl, Lokalisierung und Untereinheit Zusammensetzung der syna...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses	Neuvitro	GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary	Life Technologies	A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary	Life Technologies	A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary	Life Technologies	A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary	Life Technologies	A21245
B27	Gibco	17504044
CaCl2	Sigma	C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning	3513
Dynasore	Tocris	2897
Glucose	Sigma	G8270
Glycine	Tocris	0219
Goat anti-rabbit Fab fragments	Sigma	SAB3700970
HEPES	Sigma	H7006
KCl	Sigma	P9541
L-Glutamine	Sigma	G7513
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Mouse anti-GluA1 antibody	Millipore	MAB2263
NaCl	Sigma	S6546
Neurobasal Media	Gibco	21103049
NGS	Abcam	Ab7481
Parafilm	Bemis	PM999
PBS	Gibco	10010023
Pelco BioWave	Ted Pella	36500
PFA	Alfa Aesar	43368
Picrotoxin	Tocris	1128
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
ProLong Gold Antifade Mountant	Life Technologies	P36934
Rabbit anti-GFP antibody	Invitrogen	A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody	Cell Signaling	2507
Strychnine	Tocris	2785
Sucrose	Sigma	S0389
Superfrost plus microscope slides	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	X100
TTX	Tocris	1078