Подход к кормлению антител для изучения торговли рецепторами глутамата в диссоциированных первичных гиппокампальных культурах

Резюме

В этой статье представлен метод изучения глутаматных рецепторов (GluR) в разъединенных первичных гиппокампальных культурах. Используя подход к кормлению антител для маркировки эндогенных или переэкспрессированных рецепторов в сочетании с фармакологическими подходами, этот метод позволяет выявлять молекулярные механизмы, регулирующие экспрессию поверхности ГлюР путем модулирования процессов интернализации или рециркуляции.

Аннотация

Клеточные реакции на внешние раздражители в значительной степени полагаются на набор рецепторов, выраженных на поверхности клетки в данный момент. Соответственно, популяция поверхностно выраженных рецепторов постоянно адаптируется и подчиняется строгим механизмам регулирования. Парадигматический пример и один из наиболее изученных событий торговли людьми в биологии является регулируемый контроль синаптической экспрессии рецепторов глутамата (GluRs). GluRs посредничают в подавляющем большинстве возбуждающих нейротрансмиссии в центральной нервной системе и контролируют физиологическую активность-зависимые функциональные и структурные изменения на синаптических и нейрональных уровнях (например, синаптической пластичности). Изменения в количестве, местоположении и составе субъединиц поверхности, выраженные Глюры, глубоко влияют на функцию нейронов и, по сути, изменения в этих факторах связаны с различными невропатиями. Представлено здесь метод для изучения GluR торговли в диссоциированных гиппокампа первичных нейронов. Подход «кормления антител» используется для дифференциализации популяций ГлюР, выраженных на поверхности и внутренних мембранах. Путем маркировки поверхностных рецепторов на живых клетках и фиксируя их на разное время для того чтобы позволить для приемных устройств endocytosis and/or рециркулировать, эти процессы торговли можно оценить и селективно изучить. Это универсальный протокол, который может быть использован в сочетании с фармакологическими подходами или переэкспрессией измененных рецепторов, чтобы получить ценную информацию о стимулах и молекулярных механизмах, влияющих на торговлю GluR. Аналогичным образом, он может быть легко адаптирован для изучения других рецепторов или поверхностных протеинов.

Введение

Клетки используют активный процесс торговли, чтобы мобилизовать белки к конкретным субклеточным локализациям и осуществлять строгую пространственно-временное регулирование над их функцией^1. Этот процесс особенно важен для трансмембранных рецепторов, так как клеточные реакции на различные экологические стимулы опираются на внутриклеточные каскады, вызванные активацией рецепторов. Клетки способны изменять эти реакции, изменяя плотность, локализацию и состав субъединиц рецепторов, выраженных на поверхности клетки через регулирование субклеточного оборота рецепторов^2. Вставка вновь синтезированных рецепторов в плазменную мембрану, наряду с эндоцитозом и рециркуляцией существующих рецепторов являются примерами процессов торговли людьми, которые определяют чистый пул поверхностно выраженных рецепторов². Многие молекулярные механизмы сотрудничают для регулирования торговли белками, включая белково-белковые взаимодействия и постпереводные модификации, такие как фосфорилирование, убиквитинация или пальмитоилация^2.

Регулирование оборота рецепторов особенно необходимо в сильно поляризованных клетках с узкоспециализированными структурами. Парадигматический пример является контроль нейронной функции регулируемой торговли рецепторами глутамата (GluRs)^3,4. Глутамат, основной возбуждательный нейромедиатор, связывает и активирует поверхностно-выраженные GluRs для управления фундаментальными физиологическими нейрональными функциями, такими как синаптической нейротрансмиссии и синаптической пластичности. Тот факт, что измененный клей торговли наблюдается в широком спектре невропатий, начиная от нейроразвития расстройств нейродегенеративных заболеваний, подчеркивает важность этого процесса⁵. Таким образом, понимание молекулярных событий, контролирующих торговлю GluR, представляет интерес во многих областях исследований.

В этом протоколе метод кормления антител используется для количественной оценки уровня поверхностных глюров в первичных гиппокампальных нейронах, а также для оценки того, как изменения в интернализации и рециркуляции приводят к наблюдаемому чистому экспрессии поверхности. Использование фармакологии и/или переэкспрессии экзогенных рецепторов, укрывающих специфические мутации, делает этот протокол особенно мощным подходом к изучению молекулярных механизмов, лежащих в основе нейронной адаптации к различным экологическим стимулам. Последним примером полезности этого протокола является изучение того, как многофакторные изменения в окружающей среде (например, в моделях заболеваний) влияют на торговлю GluR путем изучения поверхностного выражения в таких моделях.

Используя конкретные примеры, первоначально показано, как фармакологические манипуляции, имитирующие физиологическую синаптической стимуляции (cLTP) увеличивает поверхностное выражение эндогенного подразделения GluA1 амрац-типа GluRs (AMPARs) ^6.Торговля чрезмерно выраженной фосфо-миметической формой подразделения GluN2B NMDA-типа GluRs (NMDARs) также анализируется для примера того, как этот протокол может быть использован для изучения регулирования оборота ГлюР конкретными постпереводами Изменения. Хотя эти конкретные примеры используются, этот протокол может быть легко применен к другим GluRs и других рецепторов и белков, которые обладают антигенными внеклеточными доменами. В случае, если нет антител, доступных для внеклеточных доменов, переэкспрессия внеклеточных эпитопных меток (например, флаг-, Myc-, GFP-тегами и т.д.) белки могут помочь в маркировке белка.

В настоящем протоколе содержатся инструкции по количественной оценке конкретной плотности подтипов GluR и оборота с использованием конкретных антител. Этот протокол может быть использован для изучения 1) общего выражения поверхности GluR, 2) интернализации GluR и 3) переработки GluR. Для изучения каждого процесса индивидуально рекомендуется начинать с разделов 1 и 2 и продолжать либо раздел 3, 4, или 5. Во всех случаях, закончить с разделами 6 и 8(Рисунок 1).

протокол

Работа, связанная с подготовкой гиппокампа первичной культуры была рассмотрена и одобрена Северо-Западным университетом по уходу за животными и использованием комитета (протокол #IS00001151).

1. Подготовка перед маркировкой

1. Подготовка и поддержание первичных гиппокампа культур
   1. Приготовьте первичные гиппокампальные культуры при плотности 150 000 клеток, покрытых поли-D-лизин-покрытием (0,1 мг/мл) 18 мм. Отличные гиды для диссоциированной подготовки нейронной культуры доступны^7,8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости, культуры могут рассматриваться с цитозин арабиносид (Ара-С, 10 мМ от DIV1), чтобы избежать глиальной пролиферации в подготовке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо поли-Д-лизинможноиспользовать можно использовать альтернативные реагенты, такие как фибронектин (1 мг/мл) или ламинин (5 мг/мл).
   2. Поддержание культур в клеточном инкубаторе при 37 градусах По кв. м и 5% CO₂ в 2 мл/колодце нейробазальных носителей, дополненных B27 и 2 мМ L-глютамином.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При желании можно использовать заменители L-глютамина (например, Glutamax).
   3. На еженедельной основе, удалить половину объема средств массовой информации и заменить с тем же объемом дополненных нейробазальных носителей.
2. ФАКЦИЯ: Трансфекция мутировавших и/или эпитопных рецепторов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нейроны должны быть трансфицировать по крайней мере 3-4 дней до анализа точки времени, чтобы обеспечить экспрессию рецепторов. Использование молодых нейронов «Дни в пробирке 6-9 (DIV6-9)» приводит к лучшей эффективности трансфекции, чем старые (DIV15-20) нейронов, но достаточное количество трансинфицированных клеток (Зgt;20) может быть достигнуто независимо от DIV занятых.
   1. Для каждой скважины из 12-хорошо пластины, разбавить 1,5 мкг плазмиды, содержащей конструкцию интереса в 100 зл и средств массовой информации без B27 или глутамина добавок в микроцентрифуге трубки и смешать путем вихря быстро.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для успешного трансфекции, очень важно, чтобы нейробазальные средства массовой информации, используемые как свежие, как это возможно, в идеале менее чем через 1 неделю после открытия бутылки.
   2. Во второй микроцентрифуговой трубке смешайте 1 зл и соответствующий липотеционный реагент в 100 л свежих нейробазальных носителей и аккуратно перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не вихрь смеси реагента липотекции. Использование свежих реагентов липотекции может повысить эффективность трансфекции.
   3. Инкубировать трубки в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
   4. Добавьте смесь реагента липотекции в смесь ДНК, аккуратно перемешайте и инкубируйте в течение 20 минут на RT.
   5. Отрегулируйте объем носителей в каждой скважине до 1 мл условных носителей.
   6. Добавьте липотекционный реагент -ДНК смесь dropwise к колодцу.
   7. Вернуть клетки в инкубатор и позволяют по крайней мере 3-4 дней для экспрессии белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей интернализации и переработки протоколов, изложенных ниже, гиппокампа нейроны были трансинфицированы на DIV11-12 с конструкциями, выражающими GluN2B помечены GFP во внеклеточной области (GFP-GluN2B) и изображением на DIV15-16.
3. ФАКЦИЯ: Инкубация клеток препаратами (хронически или остро) в условных носителях до фиксации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для острого лечения, начать лечение клеток до маркировки. В зависимости от используемого протокола лечения наркомании, клетки могут поддерживаться в наркосодержащих носителях во время раздела 2. В нашем примере, DIV21 клетки были подпадают под протокол cLTP для увеличения поверхности выраженной AMPAR⁹.
   1. Обмен условных носителей для внеклеточного раствора (ECS).
   2. Лечить клетки с 300 мкм глицином в ECS в течение 3 мин на RT. В качестве контроля, лечить сестру coverslip с ECS (без глицина).
   3. Вымойте клетки 3x с 37 КК ECS и вернуть клетки в ECS (без глицина) в клеточный инкубатор в течение 20 минут до продолжения раздела 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ECS (в мМ): 150 NaCl, 2 CaCl₂, 5 KCl, 10 HEPES, 30 Глюкоза, 0,001 TTX, 0,01 стрихнин, и 0,03 пикотоксина при рН 7,4.

2. Live Маркировка поверхностных рецепторов

1. Подготовка крышки для маркировки
   1. Для сохранения реагентов и облегчения манипуляций, передача охватывает крышки ячейки сторону до парафина пленки покрыты лоток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно никогда не позволять образцам высохнуть.
   2. Сохранить и поддерживать кондиционированные носители при 37 градусов по Цельсию для инкубации и стирки шагов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 18-мм крышки рекомендуется инкубация с 75-100 л носителей для маркировки антител и 120-150 л для интернализации/переработки.
2. Маркировка поверхностных рецепторов первичными антителами
   1. Инкубировать клетки с первичными антителами, разбавленными в условных носителях в течение 15 мин на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для GFP-тегами рецепторов, кролик анти-GFP антитела при разбавлении 1:1000 был использован. Для эндогенного GluA1 использовалась мышь anti-GluA1 при разбавлении 1:200.
   2. Тщательно аспирируйте антитела-содержащие средства с помощью вакуумной пипетки и мыть клетки три раза с условными носителями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если условные носители недоступны, все стирки могут быть выполнены с помощью PBS »фосфат буферный солевой раствор (PBS), содержащий 1 мМ MgCl₂ и 0,1 мМ CaCl_2. Ручное стремление с помощью микропайпета может быть выполнено, если нежный вакуума аспирации не доступна.

3. Выражение поверхности(рисунок2)

1. Вторичная маркировка антител поверхностно-выраженных рецепторов
   1. Вымойте один раз с PBS.
   2. Исправьте клетки путем инкубации с 4% параформальдегидом (PFA) и 4% сахарозой в PBS в течение 7-8 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от других методов фиксации, таких как инкубация метанола, ПФА не проникает в плазменную мембрану и поэтому подходит для анализа поверхностно-экспрессионных выражений. Для достижения оптимальных результатов используйте свежеприготовленный PFA. Краткосрочное хранение ПФЕ при 4 градусах Цельсия или длительное (до 30 дней) хранение при -20 градусов по Цельсию является разрешительным для адекватной фиксации.
      ПРЕДЕКТО: PFA является известным канцерогеном. Используйте надлежащее индивидуальное защитное оборудование и защитный капот при обращении.
   3. Вымойте клетки три раза с регулярными PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, 0,1 М глицин может быть использован для мытья PFA вместо PBS, как глицин будет утолить любые оставшиеся фиксаторы, которые могут увеличить фон в подготовке.
   4. Блок неспецифических связывающих сайтов путем инкубации с 10% нормальной сыворотки козы (NGS) в PBS в течение 30 минут на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время блокировки может быть продлено без побочных эффектов на маркировку.
   5. Инкубировать флуоресцентно помеченными вторичными антителами, разбавленными в 3% NGS в PBS в течение 1 ч на RT для обозначения первичных рецепторов с маркировкой антител (т.е. поверхностно выраженных).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этих примерах, 1:500 разбавления Alexa 555-конъюгированных вторичных антител: коза анти-кролик для GFP-маркированных рецепторов и коза анти-мышь для GluA1 был использован.
   6. Вымойте клетки с PBS 3x.
2. Маркировка внутриклеточных рецепторов
   1. Пермяки клетки с 0,25% Тритон X-100 в PBS в течение 5-10 мин на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить, что начальный раунд маркировки антител занимает все поверхностные эпитопы, этот шаг permeabilization можно пропустить в культуре сестры. В этом случае сигнал для внутриклеточных рецепторов получить не следует. Кроме того, чтобы проверить, что никакие внутренние рецепторы не были помечены в предыдущем разделе 2 (т.е. показывая целостность плазменных мембран в культуре), шаг permeabilization можно пропустить в культуре сестры, и первичное антитело против внутриклеточный белок (например, PSD-95 или MAP2) может быть использован в шаге 2.2.1. В этих условиях от этого первичного не следует получать сигнал. В этом случае использовалось антитело кролика против PSD-95 (1:500).
   2. Блок с 10% NGS в PBS в течение 30 минут на RT.
   3. Этикетка внутриклеточных рецепторов путем инкубации пермяковых клеток с темже первичным антителом, используемым в разделе 2.2 разбавленных в 3% NGS в PBS для 1 ч на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление антител для маркировки внутриклеточных рецепторов может отличаться от того, что требуется для маркировки поверхностных рецепторов. В примере GluA1 использовалось то же разбавление антител (1:200).
   4. Вымойте клетки 3x с PBS.
   5. Этикетка со вторым флуоресцентно помечены вторичные антитела разбавленные в 3% NGS в PBS для 1 ч на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этих примерах, 1:500 разбавления козы анти-мышь Alexa 647-конъюгированных вторичных антител (для GluA1) был использован.
   6. Вымойте клетки 3x с PBS.

4. Интернализация(рисунок3)

1. Интернализация поверхностных рецепторов, маркированных антителами
   1. После маркировки поверхностных рецепторов и промывки антител (раздел 2.2) поддерживать клетки в условных носителях без антител и возвращать их в инкубатор (37 градусов по Цельсию), чтобы обеспечить интернализацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для NMDA рецепторов рекомендуется 30 мин для интернализации. В качестве контроля, сестра культуры могут быть сохранены с условными средствами массовой информации на 4 кВ в процессе интернализации. Минимальная интернализация рецепторов должна происходить в этих условиях.
2. Маркировка поверхностных рецепторов
   1. Вымойте клетки один раз с ПОМОЩЬю PBS.
   2. Исправьте клетки с 4% PFA и 4% сахарозы в PBS в течение 7-8 мин.
      ПРЕДЕКТО: Используйте надлежащее индивидуальное защитное оборудование и защитный капот при работе с PFA.
   3. Вымойте клетки 3x с регулярными PBS.
   4. Блок с 10% NGS в PBS в течение 30 минут на RT, чтобы предотвратить неспецифические связывания.
   5. Инкубировать образцы с флуоресцентно помечены вторичные антитела разбавленного в 3% NGS в PBS в течение 1 ч на RT для обозначения первичных антител помечены рецепторов (т.е. поверхностно выраженных рецепторов, которые не были интернализированы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого примера, Alexa 555-конъюгированный коза анти-кролик вторичного антитела (1:500) был использован для маркировки.
   6. Вымойте клетки 3x с PBS.
3. Маркировка интернализированных рецепторов
   1. Пермяки клетки с 0,25% Тритон X-100 в PBS в течение 5-10 мин.
   2. Блок неспецифическая связывание инкубации с 10% NGS в PBS в течение 30 мин на RT.
   3. Инкубировать образцы с флуоресцентно помечены вторичные антитела разбавленные в 3% NGS в PBS в течение 1 ч на RT для обозначения интернализированных антител помечены рецепторами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого примера, Alexa 647-конъюгированный коза анти-кролик вторичного антитела (1:500) используется для маркировки.
   4. Вымойте клетки 3x с PBS.

5. Переработка(рисунок 4)

1. Интернализация поверхностных рецепторов, маркированных антителами
   1. После маркировки поверхностных рецепторов и промывки антител (раздел 2.2) поддерживать клетки в условных носителях без антител и возвращать их в инкубатор (37 градусов по Цельсию), чтобы обеспечить интернализацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для NMDA рецепторов рекомендуется 30 мин для интернализации.
2. Блокирование стабильных поверхностных выраженных рецепторов
   1. Чтобы блокировать эпитопы на первичных антителах, прикрепленных к поверхностно-выраженным рецепторам, которые не были интернализированы, инкубируют клетки с неконъюгированными фрагментами анти-Игг (H'L) антитела (против первичного, используемого в разделе 2.2) разбавленных в условных носителях ( 20 мкг/мл) в течение 20 мин на RT. Это лечение предотвращает дальнейшее взаимодействие со вторичными антителами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого примера были использованы фрагменты Коза против кролика Фаба.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольный эксперимент: для обеспечения полного блокирования поверхностно выраженных рецепторов произошло, сестра coverslips могут быть инкубированы с и без Fab. Культуры должны быть исправлены сразу после лечения Fab, и обе культуры инкубируются с Alexa 555-конъюгированных вторичных антител. Нет Alexa 555 сигнал агенетвии в Fab-инкубированных клетках указывает на надлежащее блокирование антител.
   2. Вымойте клетки 3x с условными носителями.
   3. Инкубировать клетки с условными носителями, содержащими 80 мкм диназора для предотвращения дальнейшей интернализации и возвращения клеток в инкубатор (37 градусов по Цельсию), чтобы обеспечить рециркуляцию интернализированных рецепторов. Dynasore является ингибитором GTPase, который подавляет динамин и, следовательно, предотвращает интернализацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется 45 мин для переработки NMDAR. Обратите внимание, что Dynasore исключительно блокирует процесс интернализации, зависящей от динаминов (например, интернализацию NMDARs). Тем не менее, интернализация другого синаптического белка (динамина-независимого) все еще может произойти в присутствии диназора.
3. Маркировка переработанных рецепторов
   1. Вымойте клетки один раз с ПОМОЩЬю PBS.
   2. Исправьте клетки с 4% PFA и 4% сахарозы в PBS в течение 7-8 мин.
      ПРЕДЕКТО: Используйте надлежащее индивидуальное защитное оборудование и защитный капот при работе с PFA.
   3. Вымойте клетки 3x с PBS.
   4. Блок с 10% NGS в PBS в течение 30 минут на RT, чтобы предотвратить неспецифические связывания.
   5. Этикетка клетки с первым флуоресцентно помечены вторичные антитела разбавленные в 3% NGS в PBS в течение 1 ч на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого примера, Alexa 555-конъюгированный коза анти-кролик антитела (1:500) был использован для маркировки.
   6. Вымойте клетки 3x с PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительные смывы с PBS (5-10 мин) может помочь уменьшить фон в подготовке.
4. Маркировка интернализированных рецепторов
   1. Пермяки клетки с 0,25% Тритон X-100 в PBS в течение 5-10 мин.
   2. Блок с 10% NGS в PBS в течение 30 минут на RT.
   3. Этикетка со вторым флуоресцентно помечены вторичные антитела разбавленные в 3% NGS в PBS для 1 ч на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого примера, Alexa 647-конъюгированный коза анти-кролик антитела (1:500) был использован для маркировки.
   4. Вымойте клетки 3x с PBS.

6. Монтаж и визуализация образцов

1. Монтировать клетки, аккуратно помещая крышки клеток вниз на 12-15 мл соответствующих монтажных носителей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стремление к избыточному монтажу носителей улучшит качество изображений.
2. Изображение клеток на соответствующем конфокальном микроскопе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется изображение z-стек на 60x увеличение с 0,35 мкм шаги, охватывающие всю толщину нейрона.

7. Рассмотрение времени

1. Это длинный протокол, который может быть остановлен в нескольких точках. При желании выполните блокирующие и первичные инкубации антител на ночь при 4 градусах по Цельсию во влажной камере.
2. Кроме того, при желании, используйте процессор микроволновой ткани, чтобы значительно ускорить время инкубации после фиксации. Для всех шагов используйте 150 Вт при 30 градусах по Цельсию для настроек "On".
   1. Чтобы заблокировать, запустите процессор на 2 мин "На", 1 мин "Off", и 2 мин "На".
   2. Для первичных и вторичных шагов инкубации антител, запустить процессор на 3 мин "На", 2 мин "Off", и 3 мин "На".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не наблюдаем никакой разницы в качестве, внося вышеперечисленные изменения в протокол.

8. Анализ изображений

1. Рекомендуется использовать FIJI lt;https:///fiji.sc/'gt; для проведения анализа изображений, так как он совместим с несколькими форматами файлов. По нашим данным, были получены изображения в формате файла Nikon ND2.
2. Макроскрипт предусмотрен для легкой пакетной количественной оценки различных параметров, предварительно отобранных FIJI. Следующие шаги включены в макрос:
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этих примерах была измерена "интегрированная интенсивность".
3. Откройте файлы изображений в FIJI и отдельных каналах.
4. Проект каждого канала стек в качестве максимальной интенсивности проекции.
5. Установите нижний порог для каждого канала.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пороговые значения должны быть эмпирически определены для каждого экспериментального набора данных. Хотя каждый канал может иметь отдельное низкое значение порога, крайне важно, чтобы значения порога канала постоянно поддерживались для всех изображений одного и того же набора данных.
6. Выберите от трех до пяти вторичных или третичных дендритов и сохраните их в качестве регионов, представляющих интерес (ROIs).
7. Измерьте плотность каждой рентабельности инвестиций во поверхностных и внутриклеточных каналах.
8. Нормализовать сигнал для каждой рентабельности инвестиций путем деления значения плотности поверхностного канала на внутриклеточный канал.
9. Повторите измерения для всех контрольных и экспериментальных изображений и нормализуйте экспериментальные значения для контроля значений (например, GluN2B WT или условия без глицина).

Результаты

Этот протокол для изучения торговли рецепторами глутамата основан на дифференциальной маркировке рецепторов, выраженных на поверхности клетки, и тех, которые выражены во внутренних мембранах. Сегрегация достигается путем маркировки рецепторов до и после мембраны per...

Обсуждение

Взаимодействие между клеткой и ее окружающей средой (например, общение с другими клетками, реакция на различные раздражители и т.д.), в значительной степени зависит от правильного выражения рецепторов на поверхности клетки. Быстрая и отлаженная регуляция содержания поверхностных реце?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses	Neuvitro	GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary	Life Technologies	A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary	Life Technologies	A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary	Life Technologies	A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary	Life Technologies	A21245
B27	Gibco	17504044
CaCl2	Sigma	C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning	3513
Dynasore	Tocris	2897
Glucose	Sigma	G8270
Glycine	Tocris	0219
Goat anti-rabbit Fab fragments	Sigma	SAB3700970
HEPES	Sigma	H7006
KCl	Sigma	P9541
L-Glutamine	Sigma	G7513
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Mouse anti-GluA1 antibody	Millipore	MAB2263
NaCl	Sigma	S6546
Neurobasal Media	Gibco	21103049
NGS	Abcam	Ab7481
Parafilm	Bemis	PM999
PBS	Gibco	10010023
Pelco BioWave	Ted Pella	36500
PFA	Alfa Aesar	43368
Picrotoxin	Tocris	1128
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
ProLong Gold Antifade Mountant	Life Technologies	P36934
Rabbit anti-GFP antibody	Invitrogen	A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody	Cell Signaling	2507
Strychnine	Tocris	2785
Sucrose	Sigma	S0389
Superfrost plus microscope slides	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	X100
TTX	Tocris	1078