抗体喂养方法研究分离原发性希马培养物中的谷氨酸受体贩运

摘要

本文提出了一种研究分离原发海马培养物的谷氨酸受体(GluR)贩运的方法。使用抗体喂养方法将内源性或过度表达的受体与药理学方法相结合,该方法允许通过调节来识别调节GluR表面表达的分子机制内部化或回收过程。

摘要

细胞对外部刺激的反应严重依赖在给定时刻在细胞表面表达的受体组。因此,表面表达受体的种群不断适应,并受到严格的调节机制的制约。生物学中研究最多的贩运事件是谷氨酸受体(GluRs)突触表达的调节控制。GluRs调解中枢神经系统的绝大多数兴奋性神经传递,并控制突触和神经元水平(例如,突触可塑性)的生理活动依赖性功能和结构变化。表面表达的GluRs的数量、位置和亚单位成分的修改深刻地影响神经元功能,事实上,这些因素的变化与不同的神经病变有关。这里介绍的是一个研究分离海马原神经元的GluR贩运的方法。"抗体喂养"方法用于对表面和内膜表示的 GluR 群体进行差异可视化。通过在活细胞上标记表面受体并在不同时间固定它们,以便受体内分泌和/或循环利用,可以评估并选择性地研究这些贩运过程。这是一个多功能的协议,可以结合药理学方法或过度表达改变的受体,以获得有关影响GluR贩运的刺激和分子机制的宝贵信息。同样,它可以很容易地适应研究其他受体或表面表达的蛋白质。

引言

细胞利用贩运的活性过程来将蛋白质动员到特定的亚细胞定位中,并对其功能进行严格的时空调节1。这个过程对于跨膜受体尤其重要,因为细胞对不同环境刺激的反应依赖于受体激活触发的细胞内级联。细胞可以通过改变受体亚细胞贩运^调节2在细胞表面表达的受体的密度、定位和亚单位组成来改变这些反应。将新合成的受体插入血浆膜,以及内分泌和现有受体的循环利用,是确定表面表达受体2的净池的贩运过程^的例子。许多分子机制合作调节蛋白质贩运,包括蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后修饰,如磷酸化、泛化或棕榈化2。

在结构高度专业化的强极化细胞中,特别需要调节受体贩运。典型的例子是通过调节贩运谷氨酸受体(GluRs)^控制神经元功能3,4。谷氨酸,主要兴奋神经递质,结合和激活表面表达的GluRs,以控制基本的生理神经元功能,如突触神经传递和突触可塑性。从神经发育障碍到神经退行性疾病,在广泛的神经病变中观察到了改变的GluR贩运,这一事实凸显了这个过程的重要性5。因此,了解控制GluR贩运的分子事件在许多研究领域是值得关注的。

在此协议中,使用基于抗体馈送的方法量化原海马神经元表面表达的GluRs水平,并评估内化和再循环的变化如何导致观察到的净表面表达。使用药理学和/或过度表达具有特定突变的外源受体,使该协议成为研究神经元适应不同环境刺激的分子机制的一种特别有力的方法。该协议效用的最后一个例子是研究环境中的多因素变化(如疾病模型中)通过检查此类模型中的表面表达如何影响 GluR 贩运。

使用具体的例子,初步演示了模仿生理突触刺激的药理学操作[化学LTP(cLTP)]如何增加AMPA型GluRs(AMPARs)^{内源性GluA1亚单位的表面表达6.}还分析了NMDA型GluRs(NmDARs)的GluN2B亚单位的过度表达磷-模拟形式的贩运,以说明如何利用该协议研究特定翻译后对GluR贩运的管制修改。虽然使用这些具体的例子,该协议可以很容易地应用于其他GluRs和其他受体和蛋白质,具有抗原细胞外域。如果没有可用于细胞外域的抗体,过度表达细胞外表位标记(例如,标记、Myc-、GFP 标记等)蛋白质有助于蛋白质标记。

当前协议提供了使用特定抗体量化特定 GluR 亚型密度和贩运的说明。该协议可用于研究 1) 总 GluR 表面表达,2) GluR 内化,以及 3) GluR 回收。要单独研究每个过程,建议从第 1 节和第 2 节开始,然后继续第 3、4 或 5 节。在所有情况下,以第 6 和 8 节结束 (图 1)。

研究方案

西北大学动物护理和使用委员会(协议#IS00001151)审查并批准了与海马原文化制备有关的工作。

1. 标签前的准备

1. 原始海马培养物的准备与维持
   1. 在聚D-Lysin--lysin涂层(0.1 mg/mL)18mm盖眼镜上镀有150,000个细胞的密度下制备原发海马培养物。用于分离神经元培养准备的优秀指南有^7、8。
      注:如果需要,可以使用青霉素(Ara-C,来自DIV1的10 mM)处理培养物,以避免在制备中胶质增殖。
      注:替代涂层试剂,如纤维质(1毫克/mL)或层宁(5毫克/mL)可用于代替聚D-赖因。
   2. 在37°C和5%CO₂的神经巴管培养基中保持培养物,辅以B27和2 mM L-谷氨酰胺。
      注:如果需要,可以使用L-谷氨酰胺(例如谷氨酸)的替代品。
   3. 每周一次,去除一半的介质量,用相同体积的辅助神经巴塞介质替换。
2. 可选:突变和/或表位标记受体的转染
   注:神经元应在分析时间点前至少3~4天转染,以允许受体表达。使用年轻神经元 [天体外 6_9 (DIV6_9)] 比较旧的 (DIV15_20) 神经元具有更好的转染效率,但无论采用的 DIV 如何,都可以实现足够数量的转染细胞 (>20)。
   1. 对于12孔板的每口井,稀释1.5μg的质粒,含有100μL新鲜神经基质培养基的感兴趣结构,无需B27或微离心管中补充谷氨酰胺,并通过涡旋快速混合。
      注:为了成功转染,使用的神经基质介质必须尽可能新鲜,最好是在瓶打开后不到1周。
   2. 在第二微离心管中,将1μL的适当脂蛋白试剂混合到100μL的新鲜神经基质介质中,然后轻轻混合。
      注:不要涡旋利菲反应剂混合物。使用新鲜的脂裂试剂可以提高转染效率。
   3. 在室温 (RT) 下孵育管 5 分钟。
   4. 将唇裂试剂混合物滴入DNA混合物中,轻轻混合,在RT孵育20分钟。
   5. 将每个井中的介质音量调整到 1 mL 的调节介质。
   6. 将唇裂试剂-DNA混合物滴滴加入井中。
   7. 将细胞返回到培养箱,并留出至少3~4天的蛋白质表达。
      注:为了进行下面概述的内部化和回收协议,海马神经元在DIV11-12处转染,其构造表示在细胞外域(GFP-GluN2B)中带有GFP标记的GluN2B,并在DIV15_16上成像。
3. 可选:在条件介质中用药物(慢性或急性)孵育细胞,直到固定。
   注:对于急性治疗,在贴标签前开始治疗细胞。根据所使用的药物治疗方案,细胞可在第2节期间保存在含药物介质中。在我们的示例中,DIV21 细胞受 cLTP 协议约束,以增加表面表达的 AMPAR⁹。
   1. 交换细胞外溶液(ECS)的调节介质。
   2. 在RT处用ECS中300μM甘氨酸处理细胞3分钟。作为对照,用ECS(不含甘氨酸)处理姐妹盖玻片。
   3. 用37°C ECS清洗细胞3倍,在继续第2节之前,将ECS中的细胞(不含甘氨酸)返回到细胞培养箱20分钟。
      注: ECS (以 mM 表示): 150 纳Cl, 2 CaCl_2,5 KCl, 10 HEPES, 30 葡萄糖, 0.001 TTX, 0.01 石氨酸, 和 0.03 丙毒素在 pH 7.4.

2. 表面表达受体的实时标签

1. 准备用于标记的盖玻片
   1. 为了节省试剂和便于操作,将盖玻片细胞侧转移到石蜡薄膜覆盖的托盘上。
      注:切勿让样品干燥,这一点至关重要。
   2. 在37°C下保存并维持调节介质,用于孵育和洗涤步骤。
      注:对于 18 mm 盖玻片,建议使用 75–100 μL 介质进行孵育,用于抗体标记,120*150 μL 用于内化/回收。
2. 表面受体与原抗体的标记
   1. 在RT,在条件介质中稀释原抗体的孵育细胞15分钟。
      注:对于GFP标记的受体,使用兔抗GFP抗体,稀释1:1000。对于内源性GluA1,使用鼠标抗GluA1在1:200稀释。
   2. 使用真空移液器小心吸出含抗体的介质,并用调节介质清洗细胞三次。
      注:如果条件介质不可用,则可以使用 PBS* [磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 包含 1 mM MgCl₂和 0.1 mM CaCl₂] 进行所有洗涤步骤。如果没有温和的真空吸气,可以使用微移液器进行手动吸气。

3. 表面表情(图2)

1. 表面表达受体的二次抗体标记
   1. 用 PBS® 洗涤一次。
   2. 在PBS中用4%的甲醛(PFA)和4%蔗糖孵育7-8分钟,修复细胞。
      注:与其他固定方法(如甲醇孵育)不同,PFA 不会渗透等离子膜,因此适用于表面表达分析。为获得最佳效果,请使用新鲜烹制的 PFA。在4°C或长期(30天)储存在-20°C时短期储存PFA,允许进行适当的固定。
      警告:PFA 是一种已知的致癌物质。操作时,请使用适当的个人防护设备和安全罩。
   3. 用常规PBS清洗细胞三次。
      注:或者,0.1M甘氨酸可用于洗涤PFA而不是PBS,因为甘氨酸将淬火任何剩余的固定剂,可能会增加制备的背景。
   4. 在RT用PBS中10%正常山羊血清(NGS)孵育30分钟,阻止非特异性结合位点。
      注:可以延长阻塞时间,而不会对标签造成不利影响。
   5. 在RT处用荧光标记的二级抗体在PBS中稀释3%NGS1小时孵育,以标记原抗体标记受体(即表面表达)。
      注:在这些示例中,使用 Alexa 555 结合二级抗体的 1:500 稀释:GFP 标记受体的山羊抗兔子和 GluA1 的山羊抗小鼠。
   6. 用PBS 3x清洗细胞。
2. 细胞内受体的标签
   1. 在PBS中用0.25%Triton X-100渗透细胞,在RT时进行5-10分钟。
      注:为了检查第一轮抗体标记占据所有表面表位,可以在姐妹文化中跳过这个渗透步骤。在这种情况下,不应获得细胞内受体的信号。此外,为了检查前一节 2 中未标记任何内部受体(即,显示培养中血浆膜的完整性),可以在姐妹培养中跳过渗透步骤,以及针对细胞内蛋白(例如PSD-95或MAP2)可在步骤2.2.1中使用。在这些情况下,不应从该主数据库获得任何信号。在这种情况下,使用了兔子抗PSD-95抗体(1:500)。
   2. 在 RT 中用 10% NGS 块 30 分钟。
   3. 通过孵育渗透细胞,在RT时用PBS中3%NGS稀释的2.2部分中相同的原抗体,为细胞内受体贴上标签。
      注:标记细胞内受体的抗体稀释可能与标记表面表达受体所需的抗体稀释不同。在GluA1的例子中,使用相同的抗体稀释(1:200)。
   4. 用PBS清洗细胞3倍。
   5. 标签与第二荧光标记二级抗体稀释在3%NGS在PBS在RT1小时。
      注:在这些示例中,使用了山羊抗小鼠 Alexa 647 偶发二级抗体(用于 GluA1)的 1:500 稀释。
   6. 用PBS清洗细胞3倍。

4. 内部化 (图 3)

1. 抗体标记表面受体的内部化
   1. 贴上表面表达的受体和抗体洗涤(第2.2节)后,在没有抗体的调节介质中保持细胞,并将其返回到培养箱(37°C),以便内化。
      注:对于NMDA受体,建议30分钟内化。作为一种控制,在内部化过程中,可以使用4°C的调节介质维持姐妹培养。在这些条件下,应实现最小受体内化。
2. 表面受体的标签
   1. 用PBS+清洗一次细胞。
   2. 在PBS中用4%PFA和4%蔗糖修复细胞7-8分钟。
      警告:处理 PFA 时,请使用适当的个人防护设备和安全罩。
   3. 用常规PBS清洗细胞3倍。
   4. 在 RT 处用 10% NGS 块 30 分钟,以防止非特异性结合。
   5. 在RT处用荧光标记的二级抗体在PBS中稀释3%NGS的孵育样品1小时,以标记原抗体标记受体(即未内化的表面表达受体)。
      注:在本例中,Alexa 555 偶联山羊抗兔子二级抗体 (1:500) 用于标记。
   6. 用PBS清洗细胞3倍。
3. 内化受体的标签
   1. 在PBS中用0.25%Triton X-100渗透细胞5~10分钟。
   2. 在RT用10%NGS在PBS中孵育30分钟,阻止非特异性结合。
   3. 在PBS中用荧光标记的二级抗体在PBS中稀释1小时,在RT上孵育样品,以标记内化抗体标记受体。
      注:对于此示例,Alexa 647 偶联山羊抗兔子二级抗体 (1:500) 用于标记。
   4. 用PBS清洗细胞3倍。

5. 回收(图4)

1. 抗体标记表面受体的内部化
   1. 贴上表面表达的受体和抗体洗涤(第2.2节)后,在没有抗体的调节介质中保持细胞,并将其返回到培养箱(37°C),以便内化。
      注:对于NMDA受体,建议30分钟内化。
2. 阻止稳定表面表达受体
   1. 为了阻断附着在表面表达受体上尚未内化的主抗体上表位,用未结合的Fab抗IgG(H+L)抗体片段(针对第2.2节中使用的原发性)孵育细胞(20 μg/mL),在 RT 下 20 分钟。这种治疗可以防止将来与二级抗体的相互作用。
      注:对于此示例,使用了山羊防兔法布碎片。
      注:对照实验:为确保表面表达受体完全阻断,姐妹盖唇可以孵育,有法布和无法布。培养物应在 Fab 治疗后立即固定,并且两种培养物均使用 Alexa 555 结合的二次抗体孵育。Fab 孵化细胞中没有 Alexa 555 信号表示抗体阻塞正确。
   2. 用调节介质清洗细胞3倍。
   3. 用含有80μM发电机的调节介质孵育细胞,以防止进一步内化,并将细胞返回到孵化器(37°C),以便回收内化受体。Dynasore 是一种 GTPase 抑制剂,可抑制丁那明,从而防止内化。
      注:建议 45 分钟进行 NMDAR 回收。请注意,Dynasore 专门阻止与发电机相关的内化过程(例如,NmDA 内部化)。然而,其他突触蛋白(独立于丁纳明)的内化仍然可能发生在Dynasore的存在。
3. 再生受体的标签
   1. 用PBS+清洗一次细胞。
   2. 在PBS中用4%PFA和4%蔗糖修复细胞7-8分钟。
      警告:处理 PFA 时,请使用适当的个人防护设备和安全罩。
   3. 用PBS清洗细胞3倍。
   4. 在 RT 处用 10% NGS 块 30 分钟,以防止非特异性结合。
   5. 在RT时,在PBS中用3%NGS稀释的第一个荧光标记二级抗体的标记细胞1小时。
      注:对于此示例,Alexa 555 偶联山羊抗兔子抗体 (1:500) 用于标记。
   6. 用PBS清洗细胞3倍。
      注:使用 PBS 进行较长的处理(5-10 分钟)可能有助于减少准备中的背景。
4. 内化受体的标签
   1. 在PBS中用0.25%Triton X-100渗透细胞5~10分钟。
   2. 在 RT 中用 10% NGS 块 30 分钟。
   3. 标签与第二荧光标记二级抗体稀释在3%NGS在PBS在RT1小时。
      注:对于此示例,Alexa 647 偶联山羊抗兔子抗体 (1:500) 用于标记。
   4. 用PBS清洗细胞3倍。

6. 样品的安装和成像

1. 将盖玻片单元侧轻轻置于相应安装介质的 12~15 mL 上,以安装细胞。
   注:过度安装介质的渴望将提高图像质量。
2. 在适当的共聚焦显微镜上成像细胞。
   注:建议以 60 倍放大倍率对 z 堆栈进行成像,步长为 0.35 μm,包括神经元的整个厚度。

7. 时间考虑

1. 这是一个可以在多个点停止的长协议。如果需要,在潮湿腔室中4°C处进行阻断和原发抗体孵育步骤过夜。
2. 或者,如果需要,使用微波组织处理器可以大大加快固定后孵育时间。对于所有步骤,在 30°C 下使用 150 W 进行"打开"设置。
   1. 要阻止,在 2 分钟"开"、1 分钟"关闭"和 2 分钟"开"时运行处理器。
   2. 对于初级和二级抗体孵育步骤,在 3 分钟"开"、2 分钟"关闭"和 3 分钟"开"时运行处理器。
      注:我们对协议进行上述修改,在质量上没有差异。

8. 图像分析

1. 建议使用 FIJI 进行图像分析,因为它与多种文件格式兼容。对于我们的数据,以尼康ND2文件格式的图像被获取。
2. 提供了一个宏脚本,用于轻松批量量化由 FIJI 预先选择的不同参数。宏中包括以下步骤:
   注:对于这些示例,测量了"综合强度"。
3. 在 FIJI 和单独的通道中打开图像文件。
4. Z 将每个通道堆栈投影为最大强度投影。
5. 为每个通道设置较低的阈值。
   注:阈值应为每个实验数据集进行经验确定。虽然每个通道可以有单独的较低阈值,但对于同一数据集的所有图像,必须始终如一地维护通道阈值。
6. 选择三到五个二级或三级树突,并将其保存为感兴趣的区域 (ROIs)。
7. 测量每个 ROI 在表面和细胞内通道中的集成密度。
8. 通过将表面通道的集成密度值除以细胞内通道来标准化每个 ROI 的信号。
9. 对所有控制和实验图像重复测量,并标准化实验值以控制值(例如,GluN2B WT 或无甘氨酸条件)。

结果

研究谷氨酸受体贩运的这个方案基于细胞表面表达的受体和内部膜表达的受体的差分标记。分离是通过在膜渗透之前和之后标记受体,使用相同的原抗体,但二级抗体与不同的荧光团结合。正如包括协议在内的可选步骤所概述的,这是一种非常通用的方法,用于询问不同的受体贩运过程,如内部化和回收化,并可轻松适应调查人员的需求(图1).

讨论

细胞与其环境之间的相互作用(例如,与其他细胞的沟通、对不同刺激的反应等)在很大程度上依赖于细胞表面受体的正确表达。表面表达受体含量的快速和微调调节使细胞能够对不断变化的环境做出适当的反应。在神经元的特殊情况下,合成表达受体的数量、定位和亚单位组成的变化严重影响突触交流、突触可塑性、突触发生和突触修剪^{3, 5,}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses	Neuvitro	GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary	Life Technologies	A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary	Life Technologies	A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary	Life Technologies	A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary	Life Technologies	A21245
B27	Gibco	17504044
CaCl2	Sigma	C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning	3513
Dynasore	Tocris	2897
Glucose	Sigma	G8270
Glycine	Tocris	0219
Goat anti-rabbit Fab fragments	Sigma	SAB3700970
HEPES	Sigma	H7006
KCl	Sigma	P9541
L-Glutamine	Sigma	G7513
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Mouse anti-GluA1 antibody	Millipore	MAB2263
NaCl	Sigma	S6546
Neurobasal Media	Gibco	21103049
NGS	Abcam	Ab7481
Parafilm	Bemis	PM999
PBS	Gibco	10010023
Pelco BioWave	Ted Pella	36500
PFA	Alfa Aesar	43368
Picrotoxin	Tocris	1128
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
ProLong Gold Antifade Mountant	Life Technologies	P36934
Rabbit anti-GFP antibody	Invitrogen	A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody	Cell Signaling	2507
Strychnine	Tocris	2785
Sucrose	Sigma	S0389
Superfrost plus microscope slides	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	X100
TTX	Tocris	1078