גישה האכלה נוגדן כדי לחקור את הסחר בקולטן גלוטמט בתרבויות היפוקמא העיקרי ההיפוקיים

Summary

מאמר זה מציג שיטה לימוד קולטן גלוטמט (GluR) סחר בתרבויות היפוקמאל העיקרי הנתק. באמצעות גישה האכלה נוגדן התווית אנדודוגני או קולטנים מוגזם בשילוב עם גישות פרמקולוגית, שיטה זו מאפשרת זיהוי של מנגנונים מולקולריים הוויסות ביטוי המשטח של GluR על ידי מודולים תהליכי הפנמה או מיחזור.

Abstract

התגובות הסלולר גירויים חיצוניים להסתמך בכבדות על הסט של קולטנים מבוטא במשטח התא ברגע נתון. בהתאם לכך, אוכלוסיית הקולטנים המתבטאת בפני השטח מסתגלת כל הזמן ובכפוף למנגנונים נוקשים של רגולציה. הדוגמה פרדיגמטי ואחד האירועים ביותר ללמד סחר בביולוגיה היא השליטה מוסדר של הביטוי הסינפטית של קולטני גלוטמט (GluRs). GluRs לתווך את הרוב המכריע של הגירוי הנוירולוגי במערכת העצבים המרכזית ושליטה על פעילות פיזיולוגית התלויים שינויים פונקציונליים ומבניים ברמות סינפטית ועצביים (למשל, הפלסטיות הסינפטית). שינויים במספר, מיקום, והרכב תת יחידת של פני השטח הביע GluRs להשפיע עמוקות על תפקוד עצבי, למעשה, שינויים בגורמים אלה קשורים neuropathies שונים. מוצג כאן הוא שיטה ללמוד סחר GluR בנוירונים היפוקמאל ההיפוסוייםהינתק. גישה "להאכלת נוגדנים" משמשת כדי להמחיש באופן מהותי אוכלוסיות GluR המתבטאים על פני השטח והקרומים הפנימיים. על ידי תיוג קולטני פני השטח על תאים חיים ותיקון אותם בזמנים שונים כדי לאפשר קולטנים endocyציטוזה ו/או מיחזור, תהליכים אלה סחר ניתן להעריך באופן סלקטיבי למד. זהו פרוטוקול רב-תכליתי שניתן להשתמש בו בשילוב עם גישות פרמקולוגית או ביטוי יתר של קולטנים משתנים כדי לקבל מידע חשוב על גירויים ומנגנונים מולקולריים המשפיעים על סחר בסמים. באופן דומה, זה יכול להיות מותאם בקלות כדי ללמוד קולטנים אחרים או פני השטח הביעו חלבונים.

Introduction

תאים לנצל את התהליך הפעיל של סחר כדי לגייס חלבונים מסוימים לוקליזציה subcellular ולהפעיל רגולציה קפדנית הרקתית על הפונקציה שלהם¹. תהליך זה חשוב במיוחד עבור קולטנים טרנסקרום, כמו תגובות הסלולר גירויים סביבתיים שונים להסתמך על מפלי תאיים המופעל על ידי הפעלת הקולטן. תאים מסוגלים לשנות את התגובות הללו על ידי שינוי צפיפות, לוקליזציה, והרכב יחידת של קולטנים הביע במשטח התא באמצעות הקולטן יחידת בתקנה הסחר². החדרת קולטנים החדש מתחת לחומרים לתוך קרום הפלזמה, יחד עם אנדוקציטוזה ומיחזור של קולטנים קיימים הם דוגמאות של תהליכי סחר הקובעים את המאגר הנקי של המשטח הביע קולטנים². מנגנונים מולקולריים רבים משתפים פעולה כדי לווסת את סחר החלבונים, כולל אינטראקציות חלבונים בחלבון ושינויים פוסט-מפלגתיים כגון זירחון, אוביקוויציה, או פלמיטלציה².

התקנה של סחר בקולטן נדרש במיוחד תאים מקוטב מאוד עם מבנים מיוחדים מאוד. הדוגמה פרדיגמטי היא השליטה של פונקציה עצבית על ידי סחר מוסדר של קולטני גלוטמט (glurs)^3,4. גלוטמט, נוירוטרנסמיטר הגירוי העיקרי, נקשר ומפעיל משטח הביע GluRs לשלוט פונקציות נוירואליות פיזיולוגית היסוד כגון המוח הנוירוטיות והפלסטיות הסינפטית. העובדה ששינוי סחר GluR נצפתה בספקטרום רחב של neuropathies, החל בהפרעות נוירותיות למחלות ניווניות, מדגיש את החשיבות של תהליך זה⁵. לפיכך, הבנת האירועים המולקולריים השולטים בסחר בגלואר הוא עניין בתחומים רבים של מחקר.

בפרוטוקול זה, האכלה נוגדן שיטה מבוססת משמש כדי לכמת את רמת הקרקע ביטא GluRs בנוירונים היפוקמאל העיקרי, כמו גם להעריך כיצד שינויים הפנמה ומיחזור תוצאה ביטוי נטו הנצפים השטח. השימוש פרמקולוגיה ו/או ביטוי יתר של קולטני אקסוגני מחסה מוטציות ספציפיות הופך פרוטוקול זה גישה רבת עוצמה במיוחד לחקר מנגנונים מולקולריים בבסיס הסתגלות עצבית לגירויים סביבתיים שונים. דוגמה אחרונה של כלי השירות של פרוטוקול זה היא לימוד כיצד שינויים רב-עצרת בסביבה (כגון מודלים של מחלות) משפיעים על סחר בסמים באמצעות בחינת ביטוי המשטח במודלים כאלה.

באמצעות דוגמאות ספציפיות, זה הוכיח בתחילה כיצד מניפולציה פרמקוקולוגי מחקה גירוי פיזיולוגי (ltp כימי (cltp)] מגביר את הביטוי פני השטח של GluA1 יחידת האנדוגניים של ה-אמסוגאס-סוג של glurs (ampars) ⁶. הסחר של הצורה המבוטאת בצורת פוספאו-מGluN2B של NMDA-סוג של GluRs (NMDARs) מנותח גם כדי להדגים כיצד פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד את הרגולציה של סחר GluR על ידי מסוים מיקוד שינויים. למרות דוגמאות ספציפיות אלה משמשים, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מוחל על GluRs אחרים וקולטנים אחרים וחלבונים בעלי תחומים מורים אנטיגניים. במקרה שאין נוגדנים זמינים עבור תחומים מגלותוניים, ביטוי יתר של אפיוליותאופ-מתויג (למשל, דגל-, Myc-, GFP-tagged, וכו ') חלבונים יכולים לסייע בתיוג חלבונים.

הפרוטוקול הנוכחי מספק הוראות לכימות צפיפות מסוג מסוים של GluR וסחר באמצעות נוגדנים ספציפיים. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל ללמוד 1) הכולל משטח GluR ביטוי, 2) הפנמה GluR, ו 3) מיחזור GluR. כדי ללמוד כל תהליך בנפרד, מומלץ להתחיל בסעיפים 1 ו-2 ולהמשיך בסעיף 3, 4 או 5. בכל המקרים, סיים עם סעיפים 6 ו-8 (איור 1).

Protocol

העבודה הקשורה הכנה התרבות הראשית נבדקה ואושרה על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת נורת'ווסטרן (פרוטוקולIS00001151).

1. הכנה לפני תיוג

1. הכנה ואחזקה של תרביות היפוקאמאל הראשי
   1. הכנת תרבויות היפוקמאל העיקרי בצפיפות של 150,000 תאים מצופה פולי-D-ליזין-מצופה (0.1 mg/mL) 18 מילימטר לכסות משקפיים. מדריכים מצוינים להכנה לתרבות העצבית המונתק הינם זמינים^7,8.
      הערה: במידת הצורך, ניתן לטפל בתרבויות האלה באמצעות מDIV1 הציטוסין (Ara-C, 10 מ"מ מ-היום) כדי למנוע התפשטות גליה בהכנה.
      הערה: ציפוי אלטרנטיבי ריאגנטים כגון fibronectin (1 מ"ג/mL) או למינציה (5 מ"ג/mL) ניתן להשתמש במקום פולי-ליזין.
   2. לשמור על תרבויות בחממה תא ב 37 ° צ' ו 5% CO₂ ב 2 מ ל/טוב של מדיה נוירובסיס בתוספת עם B27 ו 2 מ"מ L-גלוטמין.
      הערה: ניתן להשתמש בתחליפים ל-L-גלוטמין (למשל גלוטמקס), במידת הצורך.
   3. על בסיס שבועי, להסיר חצי נפח של מדיה ולהחליף עם אותו כמות של מדיה נוירובסיס שיושלם.
2. אופציונלי: העברה של מוטציה ו/או אפיפיגים מתויגים קולטנים
   הערה: הנוירונים צריכים להיות מזוהמים לפחות 3-4 ימים לפני נקודת הזמן ניתוח כדי לאפשר ביטוי הקולטן. השימוש בנוירונים צעירים [ימים בתוך מבחנה 6 – 9 (DIV6 – 9)] תוצאות היעילות הרבה יותר מאשר מבוגר (DIV15-20) נוירונים, אבל מספר מספיק של תאים מזוהמים (> 20) ניתן להשיג ללא קשר ל-DIV המועסקים.
   1. עבור כל באר של 12-באר צלחת, לדלל 1.5 μg של פלסטלינה המכיל את המבנה של עניין 100 μL של מדיה נוירובסיס טריים ללא B27 או תוספת גלוטמין בצינור מיקרוצנטריפוגה ומערבבים על ידי vortexing במהירות.
      הערה: לצורך העברה מוצלחת, זה קריטי כי התקשורת הנוירובבית שבשימוש הוא טרי ככל האפשר, באופן אידיאלי פחות משבוע 1 לאחר פתיחת בקבוק.
   2. ב שפופרת מיקרוצנטריפוגה השני, לערבב 1 μL של הזיהום המתאים ליפוגל ב 100 μL של מדיה נוירובסיס טרי ולערבב בעדינות.
      הערה: אין לערבולת את התערובת הכימית. שימוש בליפוטריה טרייה יכול לשפר את היעילות של הזיהום.
   3. מודאת הצינורות עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   4. מוסיפים את התערובת הכימית ליפוף לתערובת ה-DNA, מערבבים בעדינות, ו דגירה עבור 20 דקות ב RT.
   5. התאם את נפח המדיה בכל התקן ל-1 מ ל של מדיה ממוזגת.
   6. הוסף את הזיהום ליפואת-התערובת-DNA הדרוד לבאר.
   7. החזר תאים לחממה והרשה לפחות 3-4 ימים לביטוי חלבון.
      הערה: למטרות הפנמה ומיחזור פרוטוקולים המפורטים להלן, נוירונים היפוקמאל היו מנוכר ב DIV11 – 12 עם בנייה ביטוי GluN2B מתויג עם GFP בתחום החילוץ (GFP-GluN2B) ו התמונה ב DIV15 – 16.
3. אופציונלי: דגירה של תאים עם תרופות (כרוניות או בחריפות) במדיה הממוזגת עד לקיבוע.
   הערה: לטיפול אקוטי, התחילו לטפל בתאים לפני תיוג. בהתאם לפרוטוקול טיפול בסמים הנמצא בשימוש, ניתן לתחזק תאים במדיה המכילה סמים במהלך סעיף 2. בדוגמה שלנו, תאים DIV21 היו כפופים פרוטוקול cLTP כדי להגדיל את פני השטח מבוטא AMPAR⁹.
   1. המרת מדיה ממוזגת לפתרון מסחטות (ECS).
   2. לטפל בתאים עם 300 μM גליצין ב ECS עבור 3 דקות ב RT. כפקד, לטפל שמיכות אחות עם ECS (ללא גליצין).
   3. לשטוף את התאים 3x עם 37 מעלות צלזיוס ECS ולהחזיר את התאים ECS (ללא גליצין) לחממה התא עבור 20 דקות לפני המשך עם סעיף 2.
      הערה: ecs (ב ממ): 150, 2 cacl₂, 5 KCL, 10 Hepes, 30 גלוקוז, 0.001 ttx, 0.01 סטריכנין, ו0.03 picrotoxin ב-pH 7.4.

2. לחיות תיוג של משטח המתבטאת קולטנים

1. הכנת שמיכות לתיוג
   1. כדי לשמור ריאגנטים ולהקל על מניפולציה, העברת כיסוי צד התא עד מגש הסרט מכוסה פרפין.
      הערה: זה קריטי לעולם לא לתת. לדגימות להתייבש
   2. שמור ותחזק מדיה ממוזגת ב-37 ° c לדגירה ושטיפת מדרגות.
      הערה: עבור coverslip 18 מ"מ, דגירה עם 75 – 100 μL של מדיה עבור תיוג נוגדנים 120 – 150 μL עבור הפנמה/מיחזור מומלץ.
2. התוויות של קולטני פני השטח עם הנוגדן העיקרי
   1. התאים דגירה עם הנוגדן העיקרי מדולל במדיה ממוזג עבור 15 דקות ב RT.
      הערה: עבור קולטני GFP-מתויגים, ארנב אנטי-GFP בדילול של 1:1000 שימש. עבור אנדודוגני GluA1, העכבר נגד GluA1 בדילול 1:200 היה בשימוש.
   2. בזהירות לשאוב את המדיה המכילה נוגדן באמצעות פיפטה ואקום ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם מדיה ממוזג.
      הערה: אם המדיה הממוזגת אינה זמינה, כל שלבי הכביסה עשויים להתבצע באמצעות ה-PBS + (מלוחים באגירה (PBS) המכיל 1 מ"מ MgCl₂ ו 0.1 MM cacl₂]. שאיפה ידנית באמצעות מיקרופיפטה ניתן לבצע אם שאיפה ואקום עדין לא זמין.

3. ביטוי פני השטח (איור 2)

1. נוגדן משני תיוג של קולטני משטח הביע
   1. התרחץ פעם אחת עם הערוץ המקביל.
   2. תקן את התאים על-ידי דגירה עם 4% פאראפורמלדהיד (בלסת) ו-4% סוכרוז ב-PBS במשך 7 – 8 דקות.
      הערה: בניגוד לשיטות קיבעון אחרות, כגון דגירה מתנול, לא מחלחל את קרום הפלזמה ולכן מתאים לניתוח ביטוי פני השטח. לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש ב-לכדורגלן טרי מוכן. מקום אחסון לטווח קצר בחצי הגמר בשטח של 4 ° צ' או לטווח ארוך (עד 30 יום) בנפח של 20 ° c הוא מתירני לקיבוע נאותה.
      זהירות: מסרטן הוא ידוע. השתמש בציוד הגנה אישי תקין ובמכסה בטיחות בעת הטיפול.
   3. רוחצים את התאים שלוש פעמים עם PBS רגיל.
      הערה: לחילופין, 0.1 M גליצין ניתן להשתמש עבור כביסה בתחתית במקום PBS, כמו גליצין יהיה להרוות את כל התיקונים הנותרים שעשויים להגדיל את הרקע בהכנה.
   4. לחסום אתרי קשירה לא ספציפיים על ידי הדגירה עם 10% סרום עז רגיל (NGS) ב-PBS עבור 30 דקות ב-RT.
      הערה: ניתן להאריך את זמן החסימה ללא תופעות לוואי על תיוג.
   5. דגירה עם פלואור-מתויג נוגדן משני מדולל ב 3% NGS ב-PBS עבור 1 h ב RT כדי לסמן את הקולטנים הראשי נוגדן התווית (כלומר, משטח מבוטא).
      הערה: בדוגמאות אלה, דילול 1:500 של אלקסה 555-מצותת נוגדנים משני: עז אנטי ארנב עבור קולטנים GFP התווית ו עז נגד העכבר עבור GluA1 היה בשימוש.
   6. לשטוף את התאים עם PBS 3x.
2. תוויות של קולטנים תאיים
   1. תאים מחלחלים עם 0.25% טריטון X-100 בערוץ הPBS במשך 5 – 10 דקות בשעה RT.
      הערה: כדי לבדוק את הסיבוב ההתחלתי של תיוג הנוגדן תופסת את כל משטח האפיסקופים, שלב זה חדירות ניתן לדלג בתרבות אחות. במקרה זה, אין אות עבור קולטנים תאיים יש להשיג. בנוסף, כדי לבדוק כי אין קולטנים פנימיים שסומנו בסעיף הקודם 2 (כלומר, מראה את השלמות של ממברנות פלזמה בתרבות), את השלב החדירות ניתן לדלג בתרבות אחות, ונוגדן עיקרי נגד חלבון תאיים (למשל, PSD-95 או MAP2) יכול להיות מנוצל בשלב 2.2.1. אין לקבל אות מראשוני זה תחת תנאים אלה. במקרה זה, שימש הארנב אנטי PSD-95 נוגדן (1:500).
   2. בלוק עם 10% NGS ב PBS עבור 30 דקות ב RT.
   3. לייבל קולטנים תאיים על ידי התאים החדירות הדגירה עם הנוגדן העיקרי זהה בשימוש בסעיף 2.2 מדולל 3% NGS ב-PBS עבור 1 h ב RT.
      הערה: דילול נוגדנים לתיוג קולטנים תאיים עשוי להיות שונה מזה נדרש עבור תיוג משטח ביטא קולטנים. בדוגמה של GluA1, שימשו את אותו דילול נוגדנים (1:200).
   4. לשטוף את התאים 3x עם PBS.
   5. תווית עם השני fluorescently מתויג משני נוגדנים מדולל ב 3% NGS ב PBS עבור 1 h ב RT.
      הערה: בדוגמאות אלה, דילול 1:500 של עז נגד עכבר אלקסה 647-מעלה נוגדן משני (עבור GluA1) שימש.
   6. לשטוף את התאים 3x עם PBS.

4. הפנמה (איור 3)

1. הפנמה של קולטני שטח המסומנים בנוגדן
   1. לאחר תיוג של קולטנים מפני השטח ושטיפת נוגדנים (סעיף 2.2), לשמור על תאים במדיה ממוזג ללא נוגדן ולהחזיר אותם לחממה (37 ° c) כדי לאפשר הפנמה.
      הערה: עבור קולטני NMDA, מומלץ לעשות שימוש של 30 דקות עבור הפנמה. בתור שליטה, ניתן לשמור על תרבות אחות עם מדיה ממוזגת ב -4 ° c במהלך תהליך הפנמה. הפנמה קולטן מינימלית צריכה להתרחש תחת תנאים אלה.
2. תוויות של קולטני פני השטח
   1. שטוף את התאים פעם אחת עם PBS +.
   2. תקן תאים עם 4% בכיוון הערוץ ו -4% סוכרוז ב-PBS במשך 7 – 8 דקות.
      זהירות: השתמשו בציוד הגנה אישי מתאים ובמכסה בטיחות כשאתם מטפלים בלקלטיים.
   3. לשטוף את התאים 3x עם PBS רגיל.
   4. בלוק עם 10% NGS ב-PBS עבור 30 דקות ב-RT כדי למנוע איגוד ספציפי.
   5. דגירה דגימות עם מתויג-נוגדן משני המתויג מדולל ב 3% NGS ב-PBS עבור 1 h ב RT כדי לסמן את הקולטנים הראשי נוגדן התווית (כלומר, קולטני משטח אשר לא הפנימו).
      הערה: לדוגמה זו, אלקסה 555-מצומדת עז אנטי ארנבון משני הארנב (1:500) שימש תיוג.
   6. לשטוף את התאים 3x עם PBS.
3. תוויות של קולטני הפנימו
   1. תאים מחלחלים עם 0.25% טריטון X-100 ב PBS במשך 5 – 10 דקות.
   2. חסימת איגוד לא ספציפי על ידי דגירה עם 10% NGS ב-PBS עבור 30 דקות ב-RT.
   3. דגירה דגימות עם מתויג בקצב משני נוגדנים משנית מדולל ב 3% NGS ב PBS עבור 1 h ב RT כדי לתייג קולטנים הפנבית נוגדנים המסומנים.
      הערה: לדוגמה זו, אלקסה 647-מצומת עז אנטי ארנבון משני הארנב (1:500) משמש לתיוג.
   4. לשטוף את התאים 3x עם PBS.

5. מיחזור (איור 4)

1. הפנמה של קולטני שטח המסומנים בנוגדן
   1. לאחר תיוג של קולטנים מפני השטח ושטיפת נוגדנים (סעיף 2.2), לשמור על תאים במדיה ממוזג ללא נוגדן ולהחזיר אותם לחממה (37 ° c) כדי לאפשר הפנמה.
      הערה: עבור קולטני NMDA, מומלץ לעשות שימוש של 30 דקות עבור הפנמה.
2. חסימת משטח יציב הביע קולטנים
   1. כדי לחסום את האפיסקופים על הנוגדן העיקרי מצורף קולטני משטח שאינם הפנימו, מודקות תאים עם בלתי מובח Fab anti-IgG (H + L) שברי נוגדנים (נגד העיקרי המשמש בסעיף 2.2) מדולל מדיה ממוזג ( 20 μg/mL) עבור 20 דקות ב-RT. טיפול זה מונע אינטראקציה עתידית עם נוגדנים משניים.
      הערה: לדוגמה זו נעשה שימוש בקטעים Fab נגד ארנבת.
      הערה: ניסוי בקרה: כדי להבטיח כי חסימה מלאה של קולטנים מפני השטח אירעה, שמיכות האחות יכול להיות מודקרת עם ובלי Fab. תרבויות צריך להיות קבוע מיד לאחר טיפול Fab, ושתי התרבויות הן מודונות עם אלקסה 555-מצותת נוגדן משני. No 555 האות של אלקסה בתאים הFab-מודתים מציין חסימת נוגדנים נכונה.
   2. לשטוף את התאים 3x עם מדיה ממוזג.
   3. מודלת תאים עם מדיה ממוזג המכיל 80 μM dynasore כדי למנוע הפנמה נוספת ולהחזיר תאים לחממה (37 ° c) כדי לאפשר מיחזור של קולטני הפניתים. Dynasore הוא מעכב GTPase כי מעכב את הדינמיות ולכן מונע הפנמה.
      הערה: 45 דקות עבור מיחזור NMDAR מומלץ. לידיעתכם, Dynasore חוסם באופן בלעדי את תהליך הפנמה תלויי-התלות (למשל, NMDARs הפנמה). עם זאת, הפנמה של חלבון סינפטית אחרים (בלתי תלוי בעצמו) עדיין יכול להתרחש בנוכחות של Dynasore.
3. תוויות של קולטנים ממוחזרים
   1. שטוף את התאים פעם אחת עם PBS +.
   2. תקן תאים עם 4% בכיוון הערוץ ו -4% סוכרוז ב-PBS במשך 7 – 8 דקות.
      זהירות: השתמשו בציוד הגנה אישי מתאים ובמכסה בטיחות כשאתם מטפלים בלקלטיים.
   3. לשטוף את התאים 3x עם PBS.
   4. בלוק עם 10% NGS ב-PBS עבור 30 דקות ב-RT כדי למנוע איגוד ספציפי.
   5. תווית תאים עם הראשון fluorescently מתויג נוגדן משני מדולל ב 3% NGS ב PBS עבור 1 h ב RT.
      הערה: לדוגמה זו, אלקסה 555-מצומנת (1:500) שימשו לתיוג.
   6. לשטוף את התאים 3x עם PBS.
      הערה: שוטף ארוך יותר עם PBS (5 – 10 דקות) עשוי לסייע להפחית את הרקע בהכנה.
4. תוויות של קולטני הפנימו
   1. תאים מחלחלים עם 0.25% טריטון X-100 ב PBS במשך 5 – 10 דקות.
   2. בלוק עם 10% NGS ב PBS עבור 30 דקות ב RT.
   3. תווית עם השני fluorescently מתויג משני נוגדנים מדולל ב 3% NGS ב PBS עבור 1 h ב RT.
      הערה: לדוגמה זו, אלקסה 647-מצומנת (1:500) שימשו לתיוג.
   4. לשטוף את התאים 3x עם PBS.

6. הרכבה והדמיה של דגימות

1. להתאים את התאים על ידי בעדינות למקם את התא הכיסויים למטה על 12-15 mL של מדיה הרכבה המתאים.
   הערה: שאיפה של מדיה להרכבה עודפת ישפר את איכות התמונות.
2. . תאי תמונה במיקרוסקופ מתאים
   הערה: מומלץ לדמות z-מחסנית בהגדלה 60x עם שלבים 0.35 יקרומטר, המקיף את העובי כולו של תא העצב.

7. שיקולי שעון

1. זהו פרוטוקול ארוך שניתן לעצור במספר נקודות. במקרה הצורך, לבצע חסימה והדגירה העיקרי הנוגדן שלבים לילה ב 4 ° c בחדר לח.
2. לחילופין, אם רצונך בכך, השתמש במעבד רקמת מיקרוגל כדי להאיץ את השימוש בזמני הדגירה שלאחר הקיבוע. עבור כל השלבים, השתמש ב-150 W ב -30 ° c עבור הגדרות "On".
   1. כדי לחסום, הפעל את המעבד ב-2 דקות "On," 1 דקות "Off," ו-2 דקות "מופעל.
   2. עבור שלבים ראשיים ומשניים הדגירה הנוגדן, להפעיל את המעבד ב 3 דקות "על," 2 דקות "Off," ו 3 דקות "On."
      הערה: אנו לא צופים בהבדל באיכות על ידי הפיכת השינויים הנ ל לפרוטוקול.

8. ניתוח תמונה

1. מומלץ להשתמש ב-פיג'י < https:/fil.sa> כדי לבצע ניתוח תמונה, כפי שהוא תואם לתבניות קובץ מרובות. עבור הנתונים שלנו, תמונות בתבנית הקובץ ND2 ניקון נרכשו.
2. סקריפט מאקרו מסופק לכימות אצווה קלה של פרמטרים שונים שנבחרו מראש על ידי פיג'י. השלבים הבאים נכללים במאקרו:
   הערה: לדוגמאות אלה נמדד "עוצמה משולבת".
3. פתחו את קובצי התמונה בפיג ובערוצים נפרדים.
4. פרוייקט Z כל מחסנית ערוץ כהטלה בעוצמה מרבית.
5. הגדר סף נמוך עבור כל אחד מהערוצים.
   הערה: יש לקבוע במידה מדעית את הספי המידע עבור כל ערכת נתונים ניסויית. בעוד שלכל ערוץ יכול להיות ערך סף תחתון נפרד, הכרחי שערכי הסף של הערוץ יישמרו בעקביות עבור כל התמונות של אותה ערכת נתונים.
6. בחר שלוש עד חמש דנדרוטים משניים או שלישוני ושמור אותם כאזורי עניין (ROIs).
7. למדוד את הצפיפות המשולבת של כל ROI ב פני השטח ו תאיים ערוצים.
8. לנרמל את האות עבור כל ROI על ידי חלוקת ערך הדחיסות המשולבת של ערוץ פני השטח בערוץ תאיים.
9. חזור על המידות עבור כל הפקדים והתמונות הנסיוניות והמשך לנרמל ערכים ניסיוניים כדי לשלוט בערכים (למשל, GluN2B WT או אי-גליצין תנאים).

תוצאות

פרוטוקול זה כדי לחקור את הסחר בקולטן גלוטמט מבוסס על תיוג דיפרנציאלי של קולטנים ביטא על פני השטח התא ואלה ביטא ממברנות פנימיים. הפרדה מושגת על ידי תיוג הקולטנים לפני ואחרי החדירות הממברנה, באמצעות הנוגדן העיקרי אותו אבל נוגדן משני מצועם שונות fluorophore. כפי שמתואר בצעדים הא?...

Discussion

האינטראקציה בין תא לסביבתו (למשל, תקשורת עם תאים אחרים, תגובה לגירויים שונים וכו '), נשענת בכבדות על ביטוי נכון של קולטנים במשטח התא. התקנה המהירה והטובה ביותר של תוכן הקולטן לפני השטח מאפשרת תגובה תאית נאותה לסביבה שמשתנה ללא הרף. במקרה מסוים של נוירונים, שינויים במספר, לוקליזציה, והרכב יחי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses	Neuvitro	GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary	Life Technologies	A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary	Life Technologies	A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary	Life Technologies	A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary	Life Technologies	A21245
B27	Gibco	17504044
CaCl2	Sigma	C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning	3513
Dynasore	Tocris	2897
Glucose	Sigma	G8270
Glycine	Tocris	0219
Goat anti-rabbit Fab fragments	Sigma	SAB3700970
HEPES	Sigma	H7006
KCl	Sigma	P9541
L-Glutamine	Sigma	G7513
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Mouse anti-GluA1 antibody	Millipore	MAB2263
NaCl	Sigma	S6546
Neurobasal Media	Gibco	21103049
NGS	Abcam	Ab7481
Parafilm	Bemis	PM999
PBS	Gibco	10010023
Pelco BioWave	Ted Pella	36500
PFA	Alfa Aesar	43368
Picrotoxin	Tocris	1128
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
ProLong Gold Antifade Mountant	Life Technologies	P36934
Rabbit anti-GFP antibody	Invitrogen	A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody	Cell Signaling	2507
Strychnine	Tocris	2785
Sucrose	Sigma	S0389
Superfrost plus microscope slides	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	X100
TTX	Tocris	1078