Une approche d'alimentation d'anticorps pour étudier le trafic de récepteurs de glutamate dans les cultures hippocampal primaires dissociées

Résumé

Cet article présente une méthode pour étudier le trafic de récepteur de glutamate (GluR) dans les cultures hippocampal primaires dissociées. Utilisant une approche d'alimentation par anticorps pour étiqueter les récepteurs endogènes ou surexprimés en combinaison avec des approches pharmacologiques, cette méthode permet d'identifier les mécanismes moléculaires régulant l'expression de surface du GluR en modulant processus d'internalisation ou de recyclage.

Résumé

Les réponses cellulaires aux stimuli externes dépendent fortement de l'ensemble des récepteurs exprimés à la surface de la cellule à un moment donné. En conséquence, la population de récepteurs exprimés en surface s'adapte constamment et est soumise à des mécanismes stricts de régulation. L'exemple paradigmatique et l'un des événements de trafic les plus étudiés en biologie est le contrôle réglementé de l'expression synaptique des récepteurs du glutamate (GluRs). Les GluRs sont la médiation de la grande majorité de la neurotransmission excitatrice dans le système nerveux central et contrôlent les changements fonctionnels et structurels dépendants de l'activité physiologique aux niveaux synaptique et neuronal (p. ex., plasticité synaptique). Les modifications dans le nombre, l'emplacement, et la composition de sous-unité de la surface exprimée GluRs affectent profondément la fonction neuronale et, en fait, les changements dans ces facteurs sont associés à différentes neuropathies. Présenté ici est une méthode pour étudier le trafic de GluR dans les neurones primaires hippocampiques dissociés. Une approche d'« alimentation par anticorps » est utilisée pour visualiser différemment les populations de GluR exprimées à la surface et aux membranes internes. En étiquetant les récepteurs de surface sur les cellules vivantes et en les fixant à des moments différents pour permettre l'endocytose des récepteurs et/ou le recyclage, ces processus de trafic peuvent être évalués et étudiés de manière sélective. Il s'agit d'un protocole polyvalent qui peut être utilisé en combinaison avec des approches pharmacologiques ou la surexpression des récepteurs modifiés pour obtenir des informations précieuses sur les stimuli et les mécanismes moléculaires affectant le trafic de GluR. De même, il peut être facilement adapté pour étudier d'autres récepteurs ou protéines exprimées en surface.

Introduction

Les cellules utilisent le processus actif de trafic pour mobiliser les protéines à des localisations sous-cellulaires spécifiques et exercer une réglementation spatiotemporal stricte sur leur fonction¹. Ce processus est particulièrement important pour les récepteurs transmembranaires, car les réponses cellulaires à différents stimuli environnementaux reposent sur des cascades intracellulaires déclenchées par l'activation des récepteurs. Les cellules sont capables de modifier ces réponses en modifiant la densité, la localisation et la composition sous-unité des récepteurs exprimés à la surface des cellules par le biais de la régulation du trafic sous-cellulaire des récepteurs². L'insertion de récepteurs nouvellement synthétisés dans la membrane plasmatique, ainsi que l'endocytose et le recyclage des récepteurs existants sont des exemples de processus de traite qui déterminent le pool net de récepteurs exprimés en surface². De nombreux mécanismes moléculaires coopèrent pour réguler le trafic de protéines, y compris les interactions protéines-protéines et les modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, l'ubiquitination ou la palmitoylation².

La régulation du trafic de récepteurs est particulièrement nécessaire dans les cellules fortement polarisées avec des structures hautement spécialisées. L'exemple paradigmatique est le contrôle de la fonction neuronale par le trafic réglementé des récepteurs du glutamate (GluRs)^3,4. Le glutamate, le principal neurotransmetteur excitateur, lie et active les GluRs exprimés en surface pour contrôler les fonctions neuronales physiologiques fondamentales telles que la neurotransmission synaptique et la plasticité synaptique. Le fait que le trafic altéré de GluR a été observé dans un large éventail de neuropathies, allant des désordres neurodevelopmental aux maladies neurodegenerative, accentue l'importance de ce processus^5. Ainsi, la compréhension des événements moléculaires qui contrôlent le trafic de GluR est d'intérêt dans de nombreux domaines de recherche.

Dans ce protocole, une méthode basée sur l'alimentation des anticorps est utilisée pour quantifier le niveau de GluRs exprimés en surface dans les neurones hippocampiques primaires ainsi que pour évaluer comment les changements dans l'internalisation et le recyclage entraînent l'expression de surface nette observée. L'utilisation de la pharmacologie et/ou de la surexpression de récepteurs exogènes abritant des mutations spécifiques fait de ce protocole une approche particulièrement puissante pour l'étude des mécanismes moléculaires sous-jacents à l'adaptation neuronale à différents stimuli environnementaux. Un dernier exemple de l'utilité de ce protocole est d'étudier comment les changements multifactoriels dans l'environnement (comme dans les modèles de maladie) affectent le trafic de GluR par l'examen de l'expression de surface dans de tels modèles.

À l'aide d'exemples spécifiques, il est d'abord démontré comment une manipulation pharmacologique imitant la stimulation synaptique physiologique [LTP chimique (cLTP)] augmente l'expression de surface de la sous-unité endogène GluA1 du type AMPA de GluRs (AMPA) ⁶. Le trafic d'une forme phospho-mimétique surexprimée de la sous-unité GluN2B de Type NMDA de GluR (NMDA) est également analysé pour illustrer comment ce protocole peut être utilisé pour étudier la régulation du trafic de GluR par modifications. Bien que ces exemples spécifiques soient utilisés, ce protocole peut facilement être appliqué à d'autres GluRs et d'autres récepteurs et protéines qui possèdent des domaines extracellulaires antigéniques. Dans le cas où il n'y a pas d'anticorps disponibles pour les domaines extracellulaires, la surexpression des protéines épitopères extracellulaires (p. ex. Flag-, Myc-, GFP-tagged, etc.) peut aider à l'étiquetage des protéines.

Le protocole actuel fournit des instructions pour quantifier la densité et le trafic spécifiques du sous-type GluR à l'aide d'anticorps spécifiques. Ce protocole peut être utilisé pour étudier 1) l'expression totale de surface de GluR, 2) l'internalisation de GluR, et 3) le recyclage de GluR. Pour étudier chaque processus individuellement, il est conseillé de commencer par les articles 1 et 2 et de continuer avec les sections 3, 4 ou 5. Dans tous les cas, terminez avec les sections 6 et 8 (figure1).

Protocole

Les travaux relatifs à la préparation de la culture primaire hippocampal ont été examinés et approuvés par le Northwestern University Animal Care and Use Committee (protocole #IS00001151).

1. Préparation avant l'étiquetage

1. Préparation et entretien des cultures hippocampiques primaires
   1. Préparer les cultures hippocampales primaires à une densité de 150 000 cellules plaquées sur des verres de couverture de 18 mm recouverts de poly-D-lysine (0,1 mg/mL). D'excellents guides pour la préparation de la culture neuronale dissociée sont disponibles^7,8.
      REMARQUE: Si nécessaire, les cultures peuvent être traitées avec cytosine arabinoside (Ara-C, 10 mM de DIV1) pour éviter la prolifération gliale dans la préparation.
      REMARQUE: D'autres réactifs de revêtement tels que la fibronectine (1 mg/ml) ou la laminin (5 mg/mL) peuvent être utilisés au lieu de la poly-D-lysine.
   2. Maintenir les cultures dans un incubateur cellulaire à 37 oC et 5 % de CO₂ en 2 ml/puits de neurobasal, complété par du B27 et 2 mM de L-glutamine.
      REMARQUE: Des substituts à la L-glutamine (p. ex. Glutamax) peuvent être utilisés, si désiré.
   3. Sur la base hebdomadaire, retirez la moitié du volume des médias et remplacez-les par le même volume de médias neurobasal complétés.
2. OPTIONAL: Transfection de récepteurs mutés et/ou épitope
   REMARQUE : Les neurones doivent être transfectés au moins 3 à 4 jours avant le point de temps d'analyse pour permettre l'expression des récepteurs. L'utilisation de jeunes neurones [Jours in vitro 6-9 (DIV6-9)] se traduit par une meilleure efficacité de transfection que les neurones plus anciens (DIV15-20), mais un nombre suffisant de cellules transfectées (-gt;20) peut être atteint indépendamment du DIV utilisé.
   1. Pour chaque puits d'une plaque de 12 puits, diluer 1,5 g de plasmide contenant la construction de l'intérêt dans 100 l de milieux neurobasal frais sans supplémentation B27 ou glutamine dans un tube microcentrifuge et mélanger en vortexant rapidement.
      REMARQUE: Pour une transfection réussie, il est essentiel que le milieu neurobasal utilisé soit aussi frais que possible, idéalement moins d'une semaine après l'ouverture de la bouteille.
   2. Dans un deuxième tube de microcentrifuge, mélanger 1 L d'un réactif lipofection approprié dans 100 oL de médias neurobasal frais et mélanger délicatement.
      REMARQUE: Ne pas vortex le mélange de réactif lipofection. L'utilisation de réactifs à lipofection frais peut améliorer l'efficacité de la transfection.
   3. Incuber les tubes pendant 5 min à température ambiante (RT).
   4. Ajouter le mélange de réactif lipofection dropwise au mélange d'ADN, mélanger doucement, et incuber pendant 20 min à RT.
   5. Ajuster le volume de support dans chaque puits à 1 ml de support conditionné.
   6. Ajouter le réagent lipofection -MÉLANGE d'ADN dropwise au puits.
   7. Retournez les cellules à l'incubateur et accordez au moins 3 à 4 jours pour l'expression des protéines.
      REMARQUE: Aux fins des protocoles d'internalisation et de recyclage décrits ci-dessous, les neurones hippocampes ont été transfectés à DIV11-12 avec des constructions exprimant GluN2B étiqueté avec GFP dans le domaine extracellulaire (GFP-GluN2B) et représenté à DIV15-16.
3. OPTIONAL: Incubation des cellules avec des médicaments (chroniquement ou aiguement) dans le support conditionné jusqu'à la fixation.
   REMARQUE : Pour un traitement aigu, commencez à traiter les cellules avant l'étiquetage. Selon le protocole de traitement médicamenteux utilisé, les cellules peuvent être maintenues dans les médias contenant des médicaments pendant la section 2. Dans notre exemple, les cellules DIV21 ont été soumises à un protocole cLTP pour augmenter AMPAR⁹exprimé en surface.
   1. Échange de médias conditionnés pour une solution extracellulaire (ECS).
   2. Traiter les cellules avec 300 M de glycine dans ECS pendant 3 min à RT. Comme un contrôle, traiter un coverslip soeur avec ECS (sans glycine).
   3. Laver les cellules 3x avec un SCEde de 37 oC et les retourner dans l'ECS (sans glycine) à l'incubateur cellulaire pendant 20 minutes avant de continuer avec la section 2.
      REMARQUE: ECS (en mM): 150 NaCl, 2 CaCl₂, 5 KCl, 10 HEPES, 30 Glucose, 0.001 TTX, 0.01 strychnine, et 0.03 picrotoxine au pH 7.4.

2. Étiquetage en direct des récepteurs exprimés par surface

1. Préparer des fiches de couverture pour l'étiquetage
   1. Pour enregistrer les réactifs et faciliter la manipulation, transférer les couvertures côté cellule jusqu'à un plateau recouvert de paraffine.
      REMARQUE: Il est essentiel de ne jamais laisser sécher les échantillons.
   2. Enregistrer et maintenir les supports conditionnés à 37 oC pour les étapes d'incubation et de lavage.
      REMARQUE: Pour un bordereau de 18 mm, l'incubation avec 75 à 100 l de supports pour l'étiquetage des anticorps et 120 à 150 l pour l'internalisation/recyclage sont recommandées.
2. Étiquetage des récepteurs de surface avec anticorps primaires
   1. Incuber les cellules avec l'anticorps primaire dilué dans le support conditionné pendant 15 min à RT.
      REMARQUE: Pour les récepteurs marqués GFP, l'anticorps anti-GFP de lapin à une dilution de 1:1000 a été employé. Pour gluA1 endogène, la souris anti-GluA1 à une dilution 1:200 a été utilisée.
   2. Aspirez soigneusement les supports contenant des anticorps à l'aide d'une pipette à vide et lavez les cellules trois fois avec des supports conditionnés.
      REMARQUE: Si les supports conditionnés ne sont pas disponibles, toutes les étapes de lavage peuvent être effectuées à l'aide de PBSMD [saline tamponnée de phosphate (PBS) contenant 1 mM MgCl₂ et 0,1 mM CaCl₂]. L'aspiration manuelle à l'aide d'une micropipette peut être effectuée si l'aspiration de vide doux n'est pas disponible.

3. Expression de surface (Figure 2)

1. Étiquetage secondaire des anticorps des récepteurs exprimés en surface
   1. Laver une fois avec PBSMD.
   2. Fixer les cellules en coucuba avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) et 4% de saccharose en PBS pendant 7 à 8 min.
      REMARQUE: Contrairement à d'autres méthodes de fixation telles que l'incubation du méthanol, PFA ne perméabibilise pas la membrane plasmatique et est donc adapté à l'analyse de l'expression de surface. Pour des résultats optimaux, utilisez un PFA fraîchement préparé. Le stockage à court terme de pfA à 4 oC ou à long terme (jusqu'à 30 jours) de stockage à -20 oC est permissif pour une fixation adéquate.
      MISE EN GARDE: La PFA est un cancérogène connu. Utilisez un équipement de protection individuelle approprié et une hotte de sécurité lors de la manipulation.
   3. Laver les cellules trois fois avec un SCP régulier.
      REMARQUE: Alternativement, 0,1 M de glycine peut être utilisé pour laver PFA au lieu de PBS, comme la glycine étanchera tout fixatif restant qui peut augmenter l'arrière-plan dans la préparation.
   4. Bloquer les sites de liaison non spécifiques en couvant avec 10% de sérum de chèvre normal (NGS) en PBS pendant 30 min à RT.
      REMARQUE: Le temps de blocage peut être prolongé sans effets néfastes sur l'étiquetage.
   5. Incuber avec des anticorps secondaires étiquetés fluorescents dilués en 3 % de NGS en PBS pendant 1 h à RT pour étiqueter les récepteurs primaires étiquetés par anticorps (c.-à-d. exprimés en surface).
      REMARQUE: Dans ces exemples, une dilution de 1:500 d'anticorps secondaires Alexa 555-conjugués : anti-lapin de chèvre pour les récepteurs GFP-étiquetés et anti-souris de chèvre pour GluA1 a été employée.
   6. Laver les cellules avec PBS 3x.
2. Étiquetage des récepteurs intracellulaires
   1. Cellules de perméabilize avec 0.25% Triton X-100 dans PBS pendant 5-10 min à RT.
      REMARQUE: Pour vérifier que le premier cycle d'étiquetage des anticorps occupe toutes les épitopes de surface, cette étape de perméabilisation peut être ignorée dans une culture sœur. Dans ce cas, aucun signal pour les récepteurs intracellulaires ne devrait être obtenu. De plus, pour vérifier qu'aucun récepteur interne n'a été étiqueté dans la section 2 précédente (c.-à-d. montrant l'intégrité des membranes plasmatiques en culture), l'étape de perméabilisation peut être ignorée dans une culture sœur, et un anticorps primaire contre un les protéines intracellulaires (p. ex. PSD-95 ou MAP2) peuvent être utilisées à l'étape 2.2.1. Aucun signal ne doit être obtenu à partir de cette primaire dans ces conditions. Dans ce cas, un anticorps anti-PSD-95 de lapin (1:500) a été employé.
   2. Bloc avec 10% NGS en PBS pendant 30 min à RT.
   3. Étiqueter les récepteurs intracellulaires en incuber des cellules perméabilisées avec le même anticorps primaire utilisé dans la section 2.2 diluée en 3% NGS en PBS pendant 1 h à RT.
      REMARQUE: La dilution d'anticorps pour l'étiquetage des récepteurs intracellulaires peut être différente de celle requise pour étiqueter les récepteurs exprimés en surface. Dans l'exemple de GluA1, la même dilution d'anticorps (1:200) a été utilisée.
   4. Laver les cellules 3x avec PBS.
   5. Étiquette avec le deuxième anticorps secondaire fluorescent-étiqueté dilué dans 3% NGS dans PBS pendant 1 h à RT.
      REMARQUE: Dans ces exemples, une dilution de 1:500 de chèvre anti-souris Alexa 647-conjugué anticorps secondaires (pour GluA1) a été utilisé.
   6. Laver les cellules 3x avec PBS.

4. Internalisation (Figure 3)

1. Internalisation des récepteurs de surface étiquetés anticorps
   1. Après l'étiquetage des récepteurs exprimés en surface et le lavage des anticorps (section 2.2), maintenir les cellules dans des médias conditionnés sans anticorps et les retourner à l'incubateur (37 oC) pour permettre l'internalisation.
      REMARQUE: Pour les récepteurs NMDA, 30 min pour l'internalisation est recommandé. En tant que contrôle, une culture sœur peut être maintenue avec des supports conditionnés à 4 oC pendant le processus d'internalisation. L'internalisation minimale des récepteurs devrait se produire dans ces conditions.
2. Étiquetage des récepteurs de surface
   1. Laver les cellules une fois avec PBSMD.
   2. Fixer les cellules avec 4% PFA et 4% saccharose en PBS pendant 7 à 8 min.
      MISE EN GARDE: Utilisez un équipement de protection individuelle approprié et une hotte de sécurité lors de la manipulation de PFA.
   3. Laver les cellules 3x avec un PBS régulier.
   4. Bloquer avec 10% NGS en PBS pendant 30 min à RT pour empêcher la liaison non spécifique.
   5. Incuber des échantillons avec des anticorps secondaires étiquetés fluorescents dilués en 3 % de NGS en PBS pendant 1 h à RT pour étiqueter les récepteurs primaires étiquetés par anticorps (c.-à-d. récepteurs exprimés en surface qui n'ont pas été intériorisés).
      REMARQUE: Pour cet exemple, Alexa 555-conjugué chèvre anti-lapin anticorps secondaires (1:500) a été utilisé pour l'étiquetage.
   6. Laver les cellules 3x avec PBS.
3. Étiquetage des récepteurs intériorisés
   1. Cellules de perméabilize avec 0.25% Triton X-100 dans PBS pendant 5-10 min.
   2. Bloquer la liaison non spécifique par incubation avec 10% de NGS en PBS pendant 30 min à RT.
   3. Incuber des échantillons avec des anticorps secondaires étiquetés fluorescents dilués en 3 % de NGS en PBS pendant 1 h à RT pour étiqueter les récepteurs étiquetés intériorisés.
      REMARQUE: Pour cet exemple, Alexa 647-conjugué chèvre anti-lapin anticorps secondaires (1:500) est utilisé pour l'étiquetage.
   4. Laver les cellules 3x avec PBS.

5. Recyclage (Figure 4)

1. Internalisation des récepteurs de surface étiquetés anticorps
   1. Après l'étiquetage des récepteurs exprimés en surface et le lavage des anticorps (section 2.2), maintenir les cellules dans des médias conditionnés sans anticorps et les retourner à l'incubateur (37 oC) pour permettre l'internalisation.
      REMARQUE: Pour les récepteurs NMDA, 30 min pour l'internalisation est recommandé.
2. Blocage des récepteurs exprimés à la surface stable
   1. Pour bloquer les épitopes sur l'anticorps primaire attaché aux récepteurs exprimés en surface qui n'ont pas été intériorisés, incuber des cellules avec des fragments d'anticorps non conjugués Fab anti-IgG (H-L) (contre le primaire utilisé dans la section 2.2) dilués dans des supports conditionnés ( 20 g/mL) pendant 20 min à RT. Ce traitement empêche l'interaction future avec les anticorps secondaires.
      REMARQUE: Pour cet exemple, des fragments de Chèvre anti-lapin Fab ont été utilisés.
      REMARQUE: Expérience de contrôle : pour s'assurer qu'un blocage complet des récepteurs exprimés en surface a eu lieu, les couvertures soeurs peuvent être incubées avec et sans Fab. Les cultures doivent être fixées immédiatement après le traitement Fab, et les deux cultures sont incubées avec Alexa 555-conjugué anticorps secondaires. Aucun signal Alexa 555 dans les cellules incubées Fab n'indique un blocage approprié des anticorps.
   2. Laver les cellules 3x avec des supports conditionnés.
   3. Incuber les cellules avec des supports conditionnés contenant 80 m de dynasore pour empêcher l'internalisation et retourner les cellules à l'incubateur (37 oC) pour permettre le recyclage des récepteurs intériorisés. Dynasore est un inhibiteur de GTPase qui inhibe le dynamin et empêche donc l'internalisation.
      REMARQUE: 45 min pour le recyclage NMDAR est recommandé. Notez que Dynasore bloque exclusivement le processus d'internalisation dépendant du dynamin (p. ex., l'internalisation des NMDR). Cependant, l'internalisation d'autres protéines synaptiques (dynamin-indépendante) peut encore se produire en présence de Dynasore.
3. Étiquetage des récepteurs recyclés
   1. Laver les cellules une fois avec PBSMD.
   2. Fixer les cellules avec 4% PFA et 4% saccharose en PBS pendant 7 à 8 min.
      MISE EN GARDE: Utilisez un équipement de protection individuelle approprié et une hotte de sécurité lors de la manipulation de PFA.
   3. Laver les cellules 3x avec PBS.
   4. Bloquer avec 10% NGS en PBS pendant 30 min à RT pour empêcher la liaison non spécifique.
   5. Étiqueter les cellules avec le premier anticorps secondaire étiqueté fluorescent dilué en 3% NGS en PBS pendant 1 h à RT.
      REMARQUE: Pour cet exemple, Alexa 555-conjugué anticorps anti-lapin de chèvre (1:500) a été utilisé pour l'étiquetage.
   6. Laver les cellules 3x avec PBS.
      REMARQUE: Des lavages plus longs avec PBS (5-10 min) peuvent aider à réduire l'arrière-plan dans la préparation.
4. Étiquetage des récepteurs intériorisés
   1. Cellules de perméabilize avec 0.25% Triton X-100 dans PBS pendant 5-10 min.
   2. Bloc avec 10% NGS en PBS pendant 30 min à RT.
   3. Étiquette avec le deuxième anticorps secondaire fluorescent-étiqueté dilué dans 3% NGS dans PBS pendant 1 h à RT.
      REMARQUE: Pour cet exemple, Alexa 647-conjugué anticorps anti-lapin de chèvre (1:500) a été utilisé pour l'étiquetage.
   4. Laver les cellules 3x avec PBS.

6. Montage et imagerie d'échantillons

1. Monter les cellules en plaçant doucement le côté des cellules des couvertures vers le bas sur 12 à 15 ml du support de montage approprié.
   REMARQUE: L'aspiration d'un excès de supports de montage améliorera la qualité des images.
2. Cellules d'image sur un microscope confocal approprié.
   REMARQUE: Il est recommandé d'imager une z-pile à un grossissement de 60x avec des étapes de 0,35 m, englobant toute l'épaisseur du neurone.

7. Considérations temporelles

1. Il s'agit d'un long protocole qui peut être arrêté à plusieurs points. Si désiré, effectuer des étapes de blocage et d'incubation des anticorps primaires pendant la nuit à 4 oC dans une chambre humide.
2. Alternativement, si désiré, utilisez un processeur de tissu micro-ondes pour accélérer considérablement les temps d'incubation post-fixation. Pour toutes les étapes, utilisez 150 W à 30 oC pour les réglages "On".
   1. Pour bloquer, exécutez le processeur à 2 min "On", 1 min "Off," et 2 min "On."
   2. Pour les étapes d'incubation des anticorps primaires et secondaires, exécutez le processeur à 3 min « On », 2 min « Off » et 3 min « On ».
      REMARQUE: Nous n'observons aucune différence de qualité en apportant les modifications ci-dessus au protocole.

8. Analyse d'image

1. Il est recommandé d'utiliser FIJI 'lt;https://fiji.sc/'gt; pour effectuer une analyse d'image, car il est compatible avec plusieurs formats de fichiers. Pour nos données, des images dans le format de fichier Nikon ND2 ont été acquises.
2. Un script macro est fourni pour la quantification par lots facile de différents paramètres présélectionnés par FIJI. Les étapes suivantes sont incluses dans la macro :
   REMARQUE: Pour ces exemples, « l'intensité intégrée » a été mesurée.
3. Ouvrez les fichiers d'images dans les canaux FIJI et séparés.
4. Z-projeter chaque pile de canal comme projection d'intensité maximale.
5. Définir un seuil inférieur pour chaque canal.
   REMARQUE: Les seuils doivent être déterminés empiriquement pour chaque ensemble de données expérimentales. Bien que chaque canal puisse avoir une valeur de seuil inférieure distincte, il est crucial que les valeurs de seuil de canal soient constamment maintenues pour toutes les images d'un même ensemble de données.
6. Sélectionnez trois à cinq dendrites secondaires ou tertiaires et sauvez-les en tant que régions d'intérêt (IA).
7. Mesurer la densité intégrée de chaque retour sur investissement dans les canaux de surface et intracellulaires.
8. Normaliser le signal pour chaque retour sur investissement en divisant la valeur de densité intégrée du canal de surface par le canal intracellulaire.
9. Répétez les mesures pour toutes les images de contrôle et expérimentales et normalisez les valeurs expérimentales pour contrôler les valeurs (p. ex., GluN2B WT ou les conditions sans glycine).

Résultats

Ce protocole pour étudier le trafic de récepteurs de glutamate est basé sur l'étiquetage différentiel des récepteurs exprimés à la surface de la cellule et ceux exprimés dans les membranes internes. La ségrégation est réalisée par l'étiquetage des récepteurs avant et après la perméabilisation de la membrane, en utilisant le même anticorps primaire, mais un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore différent. Comme le décrivent les étapes facultatives incluses d...

Discussion

L'interaction entre une cellule et son environnement (par exemple, la communication avec d'autres cellules, la réponse à différents stimuli, etc.) repose fortement sur l'expression correcte des récepteurs à la surface de la cellule. La régulation rapide et affinée du contenu des récepteurs expriméens en surface permet une réponse cellulaire appropriée à un environnement en constante évolution. Dans le cas particulier des neurones, des altérations dans le nombre, la localisation, et la composition de subunit...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses	Neuvitro	GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary	Life Technologies	A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary	Life Technologies	A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary	Life Technologies	A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary	Life Technologies	A21245
B27	Gibco	17504044
CaCl2	Sigma	C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning	3513
Dynasore	Tocris	2897
Glucose	Sigma	G8270
Glycine	Tocris	0219
Goat anti-rabbit Fab fragments	Sigma	SAB3700970
HEPES	Sigma	H7006
KCl	Sigma	P9541
L-Glutamine	Sigma	G7513
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Mouse anti-GluA1 antibody	Millipore	MAB2263
NaCl	Sigma	S6546
Neurobasal Media	Gibco	21103049
NGS	Abcam	Ab7481
Parafilm	Bemis	PM999
PBS	Gibco	10010023
Pelco BioWave	Ted Pella	36500
PFA	Alfa Aesar	43368
Picrotoxin	Tocris	1128
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
ProLong Gold Antifade Mountant	Life Technologies	P36934
Rabbit anti-GFP antibody	Invitrogen	A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody	Cell Signaling	2507
Strychnine	Tocris	2785
Sucrose	Sigma	S0389
Superfrost plus microscope slides	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	X100
TTX	Tocris	1078