رصد GPCR-β-arrestin1/2 التفاعلات في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي لتسريع اكتشاف المخدرات

Summary

التفاعلات GPCR-β-arrestin هي حقل الناشئة في اكتشاف المخدرات GPCR. ومن الضروري وضع أساليب دقيقة ودقيقة وسهلة الإعداد لرصد هذه التفاعلات في النظم الحية. نعرض فحص اكمبية هيكلية لمراقبة تفاعلات GPCR-β-arrestin في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي، ويمكن توسيعه إلى أي GPCR.

Abstract

التفاعلات بين مستقبلات G-البروتين المقترنة (GPCRs) وβ-arrestins هي عمليات حيوية مع الآثار الفسيولوجية ذات أهمية كبيرة. حاليا، فإن توصيف الأدوية الجديدة نحو تفاعلاتها مع β-arrestins وغيرها من البروتينات السيتوسية هو قيمة للغاية في مجال اكتشاف المخدرات GPCR لا سيما خلال دراسة الآلام المتحيزة GPCR. هنا، نعرض تطبيق تحليل استكمال الهيكلية رواية لرصد بدقة مستقبلات بيتا-arrestin التفاعلات في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي. هذه الطريقة بسيطة ودقيقة ويمكن أن تمتد بسهولة إلى أي GPCR ذات أهمية، وأيضا لديها ميزة أنه يتغلب على التفاعلات غير محددة بسبب وجود المروج التعبير منخفضة موجودة في كل نظام ناقلات. يوفر هذا التحليل التكامل الهيكلي السمات الرئيسية التي تسمح برصد دقيق ودقيق للتفاعلات مستقبلات بيتا-arrestin، مما يجعلها مناسبة في دراسة الآلام المتحيزة من أي نظام GPCR، فضلا عن GPCR c-terminus 'الفسفورية رموز ' مكتوبة من قبل مختلف GPCR-kinases (GRKs) والتعديلات ما بعد الترجمة من arrestins التي استقرار أو زعزعة استقرار مجمع مستقبلات بيتا-arrestin.

Introduction

تمثل GPCRs الهدف من ما يقرب من 35٪ من الأدوية الحالية في السوق^1،2 وفهم واضح للأدوية لها أمر بالغ الأهمية في تطوير الأدوية العلاجية الجديدة^3. واحدة من الجوانب الرئيسية في اكتشاف المخدرات GPCR، لا سيما خلال تطوير الناهضات المتحيزة هو توصيف ligands جديدة نحو مستقبلات بيتا-arrestin التفاعلات⁴ وبيتا-arrestin التفاعلات مع البروتينات الربابية الأخرى مثل كما clathrin⁵.

وقد تم توثيق أن إشارات تعتمد على β-arrestin يلعب دورا رئيسيا في الاضطرابات العصبية مثل اضطراب ثنائي القطب, الاكتئاب الكبير, والفصام⁶ وأيضا الآثار الجانبية الشديدة في بعض الأدوية مثل المورفين⁷.

الأساليب الحالية المستخدمة لرصد هذه التفاعلات عادة لا تمثل المستويات الذاتية الفعلية للبروتينات في الدراسة، في بعض الحالات أنها تظهر إشارة ضعيفة، وتبييض الصور واعتمادا على GPCR قد يكون من الصعب من الناحية الفنية لإعداد⁸. هذا الفحص التكامل الهيكلي الجديد يستخدم ناقلات المروج التعبير المنخفض من أجل تقليد المستويات الفسيولوجية الذاتية ويوفر حساسية عالية بالمقارنة مع الأساليب الحالية⁹. باستخدام هذا النهج، كان من الممكن بسهولة توصيف مستقبلات Galanin-β-arrestin € وأيضا β-arrestin2-clathrin التفاعلات¹⁰. ويمكن استخدام هذه المنهجية على نطاق واسع إلى أي GPCR ذات أهمية خاصة حيث β-arrestins تلعب وظيفة فسيولوجية رئيسية أو إشاراتها ذات الصلة في بعض الأمراض.

Protocol

1. التمهيدي استراتيجية التصميم

1. تصميم مواد أولية لإدخال الجينات ذات الأهمية في pBiT1.1-C [TK/LgBiT]، pBiT2.1-C [TK/SmBiT]، pBiT1.1-N [TK/LgBiT] وpBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectors.
2. حدد واحدًا على الأقل من هذه المواقع الثلاثة كواحد من اثنين من إنزيمات التقييد الفريدة اللازمة للاستنساخ الاتجاهي نظرًا لوجود codon توقف في الإطار يقسم موقع الاستنساخ المتعدد كما هو موضح في الشكل 1¹¹.
3. إدراج تسلسل النيوكليوتيد في المواد التمهيدية كما هو مبين في الجدول 1 لترميز بقايا الرابط المبينة باللون الأحمر في الجدول 2^11.
4. بالنسبة لناقلات pBiT1.1-C [TK/LgBiT] وpBiT2.1-C [TK/SmBiT]، تأكد من أن الدليل التمهيدي 5 يحتوي على codon ATG وتسلسل توافق الآراء Kozak قوية (GCCGCCACC).
5. لpBiT1.1-N [TK/LgBiT] و pBiT2.1-N [TK/SmBiT] ناقلات, تأكد من أن التمهيدي 3 € يحتوي على وقف codon.
   ملاحظة: يحتوي كل ناقل على مروج HSV-TK لتقليل الارتباط غير المحدد وتقليل القطع الأثرية التجريبية، كما أن كل ناقل لديه كاسيت تعبير لمقاومة أمبيسيلين في البكتيريا.

2. PCR

1. إعداد وتشغيل ردود فعل PCR لتضخيم الحمض النووي إدراج الجين ذات الفائدة باستخدام التمهيديات المصممة من الخطوة 1. من المهم استخدام بوليميراز الحمض النووي عالية الدقة للحد من الطفرات.
2. استخدم بالضبط الترتيب التالي لإعداد 50 ميكرولتر من تفاعل PCR. إضافة 35.5 ميكرولتر من الماء المقطر، و5 ميكرولتر من 10 x عازلة للبوليميراز، و5 ميكرولتر من خليط dNTP (2.5 مليمتر لكل منهما)، و1 ميكرولتر من قالب البلازميد (200 نانوغرام/لتر)، و1.25 ميكرولتر من المواد التمهيدية الأمامية والعكسية (10 ميكرومتر) و1 ميكرولتر من بوليميراز عالية الدقة (5 U/μL).
3. باستخدام دراجة حرارية إعداد برنامج تضخيم الحمض النووي التالي.
   1. تشوه في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   2. كرر 25 مرة الدورة الحرارية التالية: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة لكل 1 كيلوبت في الدقيقة ليتم تضخيمها.
   3. تشغيل ملحق النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   4. عقد العينات في 4 درجة مئوية داخل دراجة حرارية.
      ملاحظة: من المستحسن للغاية استخدام بوليميراز عالية الدقة من أجل تقليل الطفرات نقطة خاصة تلك التي تحدث أثناء تضخيم تسلسل طويل. كما يصبح amplicon أطول، ودرجة الدقة في النسخ المتماثل للحمض النووي يقلل. لرد فعل PCR، اختر درجة حرارة الصلب على أساس درجة حرارة ذوبان المنطقة حيث القلة تهجين مباشرة مع قالب الحمض النووي وليس مع كل تسلسل التمهيدي.
4. PCR تنقية المنتج
   1. عزل المنتج PCR من بقية رد فعل PCR باستخدام مجموعة من الشركة المصنعة للتفضيل¹². منتج PCR جاهز الآن لتقييد الهضم.

3. هضم الحمض النووي

1. لهضم المنتج PCR إعداد 50 درجة مئوية من رد فعل الهضم على النحو التالي.
   1. باستخدام أنبوب 1.5 مل، إضافة 12 ميكرولتر من الماء المقطر.
   2. إضافة 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10X مع أفضل التوافق مع كل من الإنزيمات تقييد.
   3. من الخطوة 2.4 إضافة 30 μL من المنتج PCR
   4. وأخيرا، إضافة 1.5 ميكرولتر من كل إنزيم تقييد.
   5. مزيج لفترة وجيزة من دوامة وحضانة في 37.5 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
2. للهضم بلازميد المتلقي إعداد 50 درجة مئوية من رد فعل الهضم على النحو التالي:
   1. باستخدام أنبوب 1.5 مل، إضافة 23 ميكرولتر من الماء المقطر.
   2. إضافة 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10X مع أفضل التوافق مع كل من الإنزيمات تقييد.
   3. إضافة 15 ميكرولتر من بلازميد المتلقي (200 نانوغرام / ميكرولتر).
   4. إضافة 1.5 ميكرولتر من كل إنزيم تقييد.
   5. مزيج لفترة وجيزة من دوامة وحضانة في 37.5 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: من المهم استخدام 3 ميكروغرام من بلازميد المتلقي من أجل الحصول على ما يكفي من المواد بعد تنقية هلام أغاروز الحمض النووي. ومن المهم أيضا أن تترك هضم الحمض النووي بين عشية وضحاها باستخدام كلا الإنزيمات للحصول على كفاءة استنساخ عالية.

4. الحمض النووي أغاروز هلام تنقية والاستنساخ

1. إعداد هلام أغاروز 1٪ لتشغيل بلازميد الحمض النووي المهضوم وإدراج والمضي قدما في خفض العصابات المقابلة. وبمجرد تنقية المتجهات المقابلة ونطاقات الإدراج12، حدد تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
2. إجراء ربط الحمض النووي لصهر إدراج إلى بلازميد المتلقي.
3. إعداد ردود الفعل الربط من حوالي 100 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي بما في ذلك 50 نانوغرام من ناقلات بلازميد.
4. إعداد نسبة بلازميد-إدراج المستلم من حوالي 1:3; يمكن حسابها باستخدام آلة حاسبة إدراج ناقلات¹³.
5. إعداد عناصر تحكم سالبة في نفس الوقت. على سبيل المثال، فإن ربط الحمض النووي بلازميد المتلقي دون أي إدراج سوف توفر معلومات حول مدى الخلفية من بلازميد المتلقي غير مهضوم أو الذاتي الربط موجود.

5- تحويل الحيوانات المستنسخة

1. وضع أنبوب من الخلايا المختصة DH5α من الثلاجة في -80 درجة مئوية ونقلها على الفور على الجليد لمدة 20 دقيقة.
2. بعد ذلك الوقت، تأخذ 55 درجة مئوية من الخلايا المختصة DH5α وإضافة 4 ميكرولتر من رد فعل الربط ومزيج عن طريق نفض الغبار الأنبوب وتخزينها على الجليد لمدة 45 دقيقة.
3. وضع الأنبوب في حمام مائي كان يسخن سابقا في 42 درجة مئوية ل48 ق بالضبط والحصول على الفور أنابيب مرة أخرى على الجليد لمدة 3 دقائق أخرى.
4. إضافة 600 درجة مئوية من المرق لوريا (LB) المتوسطة التي كانت تسخن سابقا في 37.5 درجة مئوية وحضانة مع الهز لمدة 1 ساعة في 200 دورة في الدقيقة.
5. نقل 200 درجة مئوية في لوحة أجار تحتوي على أمبيسيلين 100 ميكروغرام / مل وتنتشر بلطف على السطح مع يتم امتصاص السائل في الغالب.
6. احتضان لوحات بين عشية وضحاها لرؤية المستعمرات صباح اليوم التالي. يجب أن يكون البلازميد المتلقي على لوحة إدراج المستعمرات أكثر بكثير من لوحة بلازميد المتلقي وحدها.

6. عزل بلازميد الانتهاء

1. اختيار 3-10 المستعمرات البكتيرية الفردية ونقل إلى 1 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على أمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل) وحضانة لمدة 6 ساعة.
2. خذ 200 ميكرو لتر من التعليق البكتيري ونقل إلى 5 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على نفس تركيز أمبيسيلين كما هو الحال في الخطوة 6.1 وحضانة بين عشية وضحاها في 37.5 درجة مئوية مع هز في 200 دورة في الدقيقة.
3. باستخدام تنقية مجموعة الحمض النووي miniprep، إجراء تنقية الحمض النووي miniprep باستخدام 5 مل من LB نمت بين عشية وضحاها بعد تعليمات الشركة المصنعة^14.
4. ولتحديد الأربطة الناجحة، قم بإعداد ردود فعل تفاعل PCR بنفس الطريقة الواردة في القسم 2 باستخدام الحمض النووي الذي تم الحصول عليه من الخطوة 6-3 كقالب بنفس المواد التمهيدية كما هو الحال في القسم 2 أثناء الـ PCR الأول. سوف استنساخ إيجابية تنتج منتجات PCR مع الحجم المقابل.
5. بعد تنقية الحمض النووي الإعدادية الكبيرة من الحيوانات المستنسخة الإيجابية، وإجراء عملية هضم تقييد التشخيص من 500 نانوغرام من الحمض النووي النقي مع الإنزيمات المستخدمة خلال خطوة الاستنساخ وتشغيل المنتجات المهضومة على هلام أغاروز 1٪. يجب أن يكون هناك نطاقين: واحد حجم المتجه وواحد في حجم إدراج جديد.
6. تحقق من تسلسل الإنشاء عن طريق التسلسل باستخدام التمهيديات التالية: إلى الأمام 5 '- aaggtgacgcgtgggcctcgaac-3' وعكس 5 '-gcatttttttcactccttagtt-3'.
   ملاحظة: عندما يتم نسخ الحمض النووي باستخدام PCR، هناك دائماً إمكانية حدوث أخطاء أثناء التضخيم حتى عند استخدام بوليميراز عالية الدقة، وبالتالي من المهم جداً تسلسل المنشآت النهائية.

7. التغوط والتعبير عن البروتين

1. في لوحة بيضاء مغلفة سابقا بولي-L-يسين 96 جيدا، وأداء البذر الخلية يوم واحد قبل transfection في 2.5 × 10⁴ خلايا لكل بئر باستخدام دولبكو تعديل النسر المتوسطة تستكمل مع 10٪ من المصل البقري الجنين، 100 U / مل البنسلين G، و 100 ميكروغرام / 100 ميكروغرام / مل ستربيومسين.
2. استخدم فقط الآبار الداخلية الـ 60 لتقليل إمكانية التدرجات الحرارية عبر اللوحة وآثار الحافة من التبخر. إضافة 200 درجة مئوية من المياه المقطر المعقمة إلى 36 آبار خارجية و 150 درجة مئوية في المساحات بينالآبار والحضانة بين عشية وضحاها عند 37.5 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون 2.
3. في صباح اليوم التالي إجراء التغوط باستخدام 100 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي (50 نانوغرام كل بناء).
4. إعداد أربع تركيبات بلازميد مختلفة (مستقبلات: β-arrestin) وفقا للرقم 2ب.
5. لكل تركيبة بلازميد استخدام 20 €L من الحد الأدنى من الوسائط الأساسية النسر المعدلة المخزنة مع HEPES باستخدام 0.3 ميكرولتر من الكاشف الانجليب الدهون لكل بئر.
6. إضافة 20 درجة مئوية من خليط الكاشف الحمض النووي الكاشف الدهون إلى كل بئر وخلط لوحة في دوائر لمدة 10 ثانية.
7. تغيير المتوسطة الطازجة بعد حضانة 6 ساعة في 37.5درجة مئوية و 5٪ CO 2.
8. احتضان لوحة لمدة 24 ساعة في 37.5 درجةمئوية و 5٪ CO 2.

8. رصد مستقبلات بيتا-arrestin € التفاعلات في خلايا HEK293

1. يستنشق المتوسطة وإضافة 100 درجة مئوية من الحد الأدنى من وسائل الإعلام الأساسية النسر المعدلة المخزنة مع HEPES إلى كل بئر والسماح لللوحة استقرار في RT لمدة 10 دقيقة.
2. إعداد الركيزة furimazine عن طريق الجمع بين 1 حجم من الركيزة 100X مع 19 مجلدات من LCS تخفيف العازلة (20 أضعاف تخفيف)¹¹، وخلق مخزون 5X لخلط مع وسط ثقافة الخلية.
3. إضافة 25 درجة مئوية من 5x furimazine إلى كل بئر وتخلط بلطف في دوائر لمدة 10 ثانية.
4. قياس الإنارة لمدة 10 دقيقة لتثبيت إشارة في RT.
   ملاحظة: باستخدام إشارة خط الأساس هذه لتطبيع استجابة كل بئر سوف يساعد على الحد من التباين الناجم عن الاختلافات في عدد الخلايا المطلية في البئر، وكذلك الاختلافات في كفاءة الانف، الخ. بمجرد حسابها، متوسط الاستجابة العادية من تكرار الآبار لعلاج المخدرات معين.
5. إعداد 13.5x حل ligand في تعديل النسر الحد الأدنى من الوسائط الأساسية المخزنة مؤقتا مع HEPES.
6. بالنسبة للتجارب في درجة حرارة الغرفة مع 10 ميكرولتر من 13.5x ligand بالإضافة، إضافة المركبات باستخدام الحقن أو ماصة متعددة القنوات وخلط لوحة باليد أو باستخدام شاكر المداري (20 ثانية في 200 دورة في الدقيقة).
7. بالنسبة للتجارب عند درجة حرارة 37.5 درجة مئوية مع إضافة 10 ميكرولتر من 13.5 x ligand، استخدم الحقن لتوزيع المركبات والاختلاط باستخدام الهزاز المداري للأداة. في حالة عدم استخدام الحقن، قم بإزالة اللوحة من مقياس الإنارة، وأضف الأربطة واخلط اللوحة باليد أو باستخدام شاكر مداري (20 s at 200 rpm).
   ملاحظة: استخدام الحقن وشاكر داخل أداة الكشف لتقليل تقلبات درجة الحرارة المرتبطة بإزالة لوحة من مقياس الإنارة. ويمكن استخدام أجهزة قياس الإضاءة القياسية من أعلى مقاعد البدلاء لهذا الفحص. استخدم وقت تكامل من 0.25-2 s.

النتائج

باستخدام الإجراء المعروض هنا، تم رصد التفاعلات بين GPCR نموذجي واثنين من isoforms β-arrestin. تم إجراء الجلوكاجون مثل مستقبلات الببتيد (GLP-1r) المنشآت باستخدام التمهيديات التي تحتوي على مواقع تقييد إنزيم NheI وEcoRI واستنساخها في ناقلات pBiT1.1-C [TK/LgBiT] و pBiT2.1-C [TK/SmBiT] بينما في حالة بيتا-arrestins، كان اثنان من ناقلا...

Discussion

باستخدام الطريقة المعروضة هنا، يمكن رصد التفاعلات بين أي GPCR وβ-arrestin1/2 في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي باستخدام هذا الفحص المكمّل الهيكلي GPCR-β-arrestin. في هذا الصدد، تمكنا من مراقبة التفاضلة β-arrestin التجنيد بين isoforms بيتا-arrestin اثنين من قبل GLP-1r (A prototypical فئة B GPCR)، لاحظنا أيضا تفكك مستقبلات بيتا-ar...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotics penicillin streptomycin	Welgene	LS202-02	Penicillin/Streptomycin
Bacterial Incubator	JEIO Tech	IB-05G	Incubator (Air-Jacket), Basic
Cell culture medium	Welgene	LM 001-05	DMEM Cell culture medium
Cell culture transfection medium	Gibco	31985-070	Optimem 1X cell culture medium
CO2 Incubator	NUAIRE	NU5720	Direct Heat CO2 Incubator
Digital water bath	Lab Tech	LWB-122D	Digital water bath lab tech
DNA Polymerase proof reading	ELPIS Biotech	EBT-1011	PfU DNA polymerase
DNA purification kit	Cosmogenetech	CMP0112	miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini
DNA Taq Polymerase	Enzynomics	P750	nTaq DNA polymerase
Enzyme restriction BglII	New England Biolabs	R0144L	BglII
Enzyme restriction buffer	New England Biolabs	B72045	CutSmart 10X Buffer
Enzyme restriction EcoRI	New England Biolabs	R3101L	EcoRI-HF
Enzyme restriction NheI	New England Biolabs	R01315	NheI
Enzyme restriction XhoI	New England Biolabs	R0146L	XhoI
Fetal Bovine Serum	Gibco Canada	12483020	Fetal Bovine Serum
Gel/PCR DNA MiniKit	Real Biotech Corporation	KH23108	HiYield Gel/PCR DNA MiniKit
Ligase	ELPIS Biotech	EBT-1025	T4 DNA Ligase
Light microscope	Olympus	CKX53SF	CKX53 Microscope Olympus
lipid transfection reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000
Luminometer	Biotek/Fisher Scientific	12504386	Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers
NanoBiT System	Promega	N2014	NanoBiT PPI MCS Starter System
Nanoluciferase substrate	Promega	N2012	Nano-Glo Live Cell assay system
PCR Thermal cycler	Eppendorf	6336000015	Master cycler Nexus SX1
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P4707-50ML	Poly-L-lysine solution
Trypsin EDTA	Gibco	25200-056	Trysin EDTA 10X
White Cell culture 96 well plates	Corning	3917	Assay Plate 96 well plate