Überwachung von GPCR---Arrestin1/2-Interaktionen in Echtzeit-Lebenssystemen zur Beschleunigung der Arzneimittelentdeckung

Zusammenfassung

GPCR----Arrestin-Wechselwirkungen sind ein aufstrebendes Feld in GPCR-Medikamentenentdeckung. Genaue, präzise und einfach einzurichtende Methoden sind notwendig, um solche Wechselwirkungen in lebenden Systemen zu überwachen. Wir zeigen einen strukturellen Komplementierungstest zur Überwachung der GPCR----Arrestin-Interaktionen in Echtzeit lebenden Zellen und können auf jede GPCR erweitert werden.

Zusammenfassung

Wechselwirkungen zwischen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) und A-Arrestinen sind lebenswichtige Prozesse mit physiologischen Implikationen von großer Bedeutung. Derzeit ist die Charakterisierung neuartiger Medikamente in Bezug auf ihre Wechselwirkungen mit '-Arrestinen und anderen zytosolischen Proteinen im Bereich der GPCR-Medikamentenentdeckung besonders während der Untersuchung des GPCR-voreingenommenen Agonismus äußerst wertvoll. Hier zeigen wir die Anwendung eines neuartigen strukturellen Komplementierungs-Assays zur genauen Überwachung von Rezeptor----Arrestin-Interaktionen in Echtzeit-Lebenssystemen. Diese Methode ist einfach, genau und kann leicht auf jede GPCR von Interesse erweitert werden und hat auch den Vorteil, dass sie unspezifische Wechselwirkungen aufgrund des Vorhandenseins eines Low-Expression-Promotors in jedem Vektorsystem überwindet. Dieser strukturelle Komplementierungstest bietet Schlüsselmerkmale, die eine genaue und präzise Überwachung der Rezeptor---Arrestin-Wechselwirkungen ermöglichen, wodurch er für die Untersuchung des voreingenommenen Agonismus eines BELIEBIGEN GPCR-Systems sowie der GPCR-c-terminus-Phosphorylierung geeignet ist. Codes' geschrieben von verschiedenen GPCR-Kinasen (GRKs) und post-translationale Modifikationen von Arrestinen, die den Rezeptor---Arrestin-Komplex stabilisieren oder destabilisieren.

Einleitung

GPCRs stellen das Ziel von fast 35% der aktuellen Medikamente auf dem Markt^1,2 dar, und ein klares Verständnis ihrer Pharmakologie ist entscheidend für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Medikamente³. Einer der Schlüsselaspekte bei der Entdeckung von GPCR-Medikamenten, insbesondere bei der Entwicklung von voreingenommenen Agonisten, ist die Charakterisierung neuartiger Liganden hin zu Rezeptor---Arrestin-Wechselwirkungen⁴ und wie clathrin⁵.

Es wurde dokumentiert, dass die abhängige Signalisierung von '-arrestin eine Schlüsselrolle bei neurologischen Störungen wie bipolarer Störung, schwerer Depression und Schizophrenie⁶ sowie schweren Nebenwirkungen in einigen Medikamenten wie Morphin⁷spielt.

Aktuelle Methoden zur Überwachung dieser Wechselwirkungen stellen in der Regel keine tatsächlichen endogenen Werte der Proteine in der Studie dar, in einigen Fällen zeigen sie schwaches Signal, Photobleichung und je nach GPCR könnte es technisch schwierig sein,⁸einzurichten. Dieser neuartige strukturelle Komplementierungstest verwendet Vektoren mit niedrigem Ausdruckspromotor, um endogene physiologische Werte nachzuahmen und bietet eine hohe Empfindlichkeit im Vergleich zu aktuellen Methoden⁹. Mit diesem Ansatz war es möglich, Galanin-Rezeptor---Arrestin1/2 und auch die Wechselwirkungen^von10 -, arrestin2-clathrin, leicht zu charakterisieren. Diese Methode kann weit verbreitet für jede GPCR von besonderem Interesse verwendet werden, wo die '-Arrestine eine wichtige physiologische Funktion spielen oder ihre Signalisierung bei einigen Krankheiten relevant ist.

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Protokoll

1. Primer Design-Strategie

1. Designprimer zur Einführung von Genen von Interesse in pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] und pBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectors.
2. Wählen Sie mindestens einen dieser drei Standorte als eines der beiden einzigartigen Restriktionsenzyme aus, die für das richtungsweisende Klonen aufgrund des Vorhandenseins eines In-Frame-Stop-Codons benötigt werden, das die Multiklonierungsstelle teilt, wie in Abbildung 1¹¹dargestellt.
3. Integrieren Sie die Nukleotidsequenz in die Primer, wie in Tabelle 1 dargestellt, um die in Tabelle 2¹¹rot dargestellten Linkerrückstände zu kodieren.
4. Stellen Sie bei pBiT1.1-C [TK/LgBiT] und pBiT2.1-C [TK/SmBiT] Vektoren sicher, dass der 5-Primr ein ATG-Codon und eine potente Kozak-Konsenssequenz (GCCGCCACC) enthält.
5. Stellen Sie bei pBiT1.1-N [TK/LgBiT] und pBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vektoren sicher, dass die 3-Grundierung ein Stop-Codon enthält.
   HINWEIS: Jeder Vektor enthält den HSV-TK-Promoter, um unspezifische Assoziationen zu minimieren und experimentelle Artefakte zu reduzieren, auch hat jeder Vektor eine Expressionskassette für ampicillin Resistenz in Bakterien.

2. PCR

1. Einrichten und Ausführen von PCR-Reaktionen zur Verstärkung der Insert-DNA des gens von Interesse mit den Primern, die aus Schritt 1 entwickelt wurden. Es ist wichtig, eine hochtreue DNA-Polymerase zu verwenden, um Mutationen zu minimieren.
2. Verwenden Sie genau die folgende Reihenfolge, um 50 l PCR-Reaktion vorzubereiten. Fügen Sie 35,5 l destilliertes Wasser, 5 l 10x Polymerase-Puffer, 5 l dNTP-Mischung (je 2,5 mM), 1 l Plasmidschablone (200 ng/l), 1,25 l Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung (10 m) und 1 l Hochtreuepolymerase (5 U/L) hinzu.
3. Richten Sie mit einem Thermocycler das folgende DNA-Amplifikationsprogramm ein.
   1. Denatur bei 95 °C für 5 min.
   2. Wiederholen Sie 25 Mal den folgenden thermischen Zyklus: 95 °C für 30 s, 60 °C für 1 min, 72 °C für 2 min pro 1 kbp zu verstärken.
   3. Führen Sie eine Endverlängerung bei 72 °C für 10 min.
   4. Halten Sie die Proben bei 4 °C im Thermocycler.
      HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, eine Hochtreuepolymerase zu verwenden, um Punktmutationen zu minimieren, insbesondere solche, die während der Amplifikation langer Sequenzen auftreten. Wenn das Amplikon länger wird, nimmt der Grad der Genauigkeit bei der Replikation der DNA ab. Für die PCR-Reaktion wählen Sie die Glühtemperatur basierend auf der Schmelztemperatur der Region, in der die Oligos direkt mit der DNA-Vorlage und nicht mit der gesamten Sequenz des Primers hybridisieren.
4. PCR-Produktreinigung
   1. Isolieren Sie das PCR-Produkt vom Rest der PCR-Reaktion mit einem Kit eines Herstellers von Präferenz¹². Das PCR-Produkt ist nun bereit für die Restriktionsverdauung.

3. DNA-Verdauung

1. Für das PCR-Produkt Verdauung bereiten 50 l der Verdauungsreaktion wie folgt.
   1. Mit einem 1,5 ml-Rohr 12 l destilliertes Wasser hinzufügen.
   2. Fügen Sie 5 l 10x Puffer mit der besten Kompatibilität mit beiden Restriktionsenzymen hinzu.
   3. Ab Schritt 2.4 30 L PCR-Produkt hinzufügen
   4. Fügen Sie schließlich 1,5 l jedes Restriktionsenzyms hinzu.
   5. Kurz durch Wirbel mischen und bei 37,5 °C über Nacht inkubieren.
2. Für den Empfänger Plasmid Verdauung bereiten 50 L der Verdauungsreaktion wie folgt:
   1. Mit einem 1,5 ml-Rohr 23 l destilliertes Wasser hinzufügen.
   2. Fügen Sie 5 l 10x Puffer mit der besten Kompatibilität mit beiden Restriktionsenzymen hinzu.
   3. Fügen Sie 15 l des Empfänger-Plasmids (200 ng/L) hinzu.
   4. Fügen Sie 1,5 l jedes Restriktionsenzyms hinzu.
   5. Kurz durch Wirbel mischen und bei 37,5 °C über Nacht inkubieren.
      HINWEIS: Es ist wichtig, 3 g Empfängerplasmid zu verwenden, um nach der Reinigung des DNA-Agarose-Gels ausreichend Material zu erhalten. Es ist auch relevant, DNA-Verdauungen über Nacht mit beiden Enzymen zu verlassen, um eine hohe Kloneffizienz zu erhalten.

4. DNA-Agarose-Gel-Reinigung und Klonen

1. Bereiten Sie ein 1% Agarose-Gel vor, um das verdaute DNA-Plasmid und die Einsätze auszuführen, und schneiden Sie die entsprechenden Bänder. Sobald die entsprechenden Vektor- und Insert-Bänder gereinigt sind12, bestimmen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
2. Führen Sie eine DNA-Ligation durch, um den Einsatz mit dem Empfängerplasmid zu verschmelzen.
3. Bereiten Sie Ligationsreaktionen von etwa 100 ng der gesamten DNA einschließlich 50 ng Desplasmidvektor.
4. Einrichten des Empfänger-Plasmid-Insert-Verhältnisses von ca. 1:3; es kann mit einem Vektor-Insert-Rechner berechnet werden¹³.
5. Richten Sie negative Steuerelemente parallel ein. Zum Beispiel wird eine Ligation der Empfänger-Plasmid-DNA ohne Insert Informationen darüber liefern, wie viel Hintergrund des unverdauten oder selbstligatierenden Empfängerplasmids vorhanden ist.

5. Transformation von Klonen

1. Legen Sie eine Röhre von DH5- kompetenten Zellen aus dem Gefrierschrank bei -80 °C und übertragen Sie sie sofort für 20 min auf Eis.
2. Nehmen Sie danach 55 l DH5-fähige Zellen und fügen Sie 4 l Ligationsreaktion hinzu und mischen Sie sie, indem Sie das Rohr flicken und 45 min auf Eis lagern.
3. Legen Sie das Rohr in ein Wasserbad, das zuvor bei 42 °C für genau 48 s erwärmt wurde, und bringen Sie die Rohre sofort für weitere 3 min wieder auf Eis.
4. Luria Broth (LB) Medium zuvor bei 37,5 °C erwärmt und 1 Stunde bei 200 Rpm mit Schütteln bebrüten.
5. Übertragen Sie 200 l in eine Agarplatte, die Ampicillin 100 g/ml enthält, und wird mit der Flüssigkeit vorsichtig über die Oberfläche verteilt.
6. Inkubieren Sie die Platten über Nacht, um die Kolonien am nächsten Morgen zu sehen. Das Empfängerplasmid auf der Insert-Platte sollte deutlich mehr Kolonien haben als das Empfängerplasmid allein.

6. Isolierung des fertigen Plasmids

1. 3-10 einzelne Bakterienkolonien pflücken und in 1 ml LB-Medium mit Ampicillin (100 g/ml) übertragen und 6 h brüten.
2. Nehmen Sie 200 l bakterielle Suspension und übertragen Sie auf 5 ml MEDIUM mit der gleichen Konzentration von Ampicillin wie in Schritt 6.1 und inkubieren Sie über Nacht bei 37,5 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute.
3. Mit einem Miniprep DNA-Kit Reinigung, führen Miniprep DNA-Reinigungen mit 5 ml über Nacht nach den Anweisungen des Herstellers¹⁴.
4. Um erfolgreiche Ligationen zu identifizieren, richten Sie PCR-Reaktionen auf die gleiche Weise ein wie in Abschnitt 2 unter Verwendung der DNA aus Schritt 6.3 als Vorlage mit den gleichen Primern wie in Abschnitt 2 während der ersten PCR. Positive Klone produzieren PCR-Produkte mit der entsprechenden Größe.
5. Führen Sie nach großer Vorbereitungs-DNA-Reinigung der positiven Klone eine diagnostische Restriktionsverdauung von 500 ng gereinigter DNA mit den während des Klonschritts verwendeten Enzymen durch und führen Sie die verdauten Produkte auf einem 1% Agarose-Gel aus. Es sollte zwei Bänder geben: eines von der Größe des Vektors und eines die Größe des neuen Inserts.
6. Überprüfen Sie die Konstruktsequenz durch Sequenzierung mit den folgenden Primern: Forward 5'- aaggtgacgcgtgtggcctcgaac-3' und reverse 5'-gcatttttttcactgcattctagtt-3'.
   HINWEIS: Wenn DNA mit PCR repliziert wird, gibt es immer die Möglichkeit von Fehlern während der Amplifikation auch bei Verwendung einer High-Fidelity-Polymerase, daher ist es sehr wichtig, die endgültigen Konstrukte zu sequenzieren.

7. Transfektion und Proteinexpression

1. In einer zuvor poly-L-Lysin-beschichteten weißen 96-Well-Platte führen Sie die Zellaussaat einen Tag vor der Transfektion bei 2,5 x 10⁴ Zellen pro Brunnen mit dem modifizierten Eagle-Medium von Dulbecco durch, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin G und 100 mL Streptomycin.
2. Verwenden Sie nur die 60 Innenbrunnen, um das Potenzial für thermische Gradienten über die Platte und Kanteneffekte durch Verdunstung zu minimieren. Fügen Sie den 36 Außenbrunnen 200 l steriles destilliertes Wasser hinzu und 150 l in die Räume zwischen den Brunnenund brüten über Nacht bei 37,5 °C und 5 % CO2.
3. Am nächsten Morgen transfekieren Sie mit 100 ng Gesamt-DNA (50 ng pro Konstrukt).
4. Richten Sie vier verschiedene Plasmidkombinationen (Rezeptor: -arrestin) gemäß Abbildung 2bein.
5. Verwenden Sie für jede Plasmid-Kombination 20 l modifizierte Eagle es Minimum Essential Media, gepuffert mit HEPES, wobei 0,3 l lipidisches Transfektionsreagenz pro Bohrgut verwendet werden.
6. Fügen Sie jedem Brunnen 20 l lipidioniertereagenz-DNA-Mischung hinzu und mischen Sie die Platte in Kreisen für 10 s.
7. Frisches Medium nach 6-Stunden-Inkubation bei 37,5 °C und 5%_CO2wechseln.
8. Inkubieren Sie die Platte für 24 h bei 37,5 °C und 5%_CO2.

8. Überwachung von Rezeptor---Arrestin1-Arrestin1-2-Wechselwirkungen in HEK293-Zellen

1. Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie jedem Bohrkörper 100 l modifizierte Eagle es Minimum Essential Media mit HEPES hinzu und lassen Sie die Platte 10 min bei RT stabilisieren.
2. Bereiten Sie das Furimazin-Substrat vor, indem Sie 1 Volumen von 100x Substrat mit 19 Bänden LCS-Verdünnungspuffer (eine 20-fache Verdünnung)¹¹kombinieren und so einen 5-fachen Vorrat für die Mischung mit Zellkulturmedium erzeugen.
3. Fügen Sie 25 l 5x Furimazin zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie vorsichtig in Kreisen für 10 s.
4. Messen Sie die Lumineszenz für 10 min für die Signalstabilisierung bei RT.
   ANMERKUNG: Durch die Verwendung dieses Basissignals zur Normalisierung der Reaktion jedes Brunnens wird es dazu beitragen, die Variabilität zu reduzieren, die durch Unterschiede in der Anzahl der pro Bohrkörper plattierten Zellen, auch Unterschiede in der Transfektionseffizienz usw. verursacht wird. Einmal berechnet, durchschnittlich die normalisierte Reaktion von Replizieren Brunnen für eine bestimmte medikamentöse Behandlung.
5. Bereiten Sie 13,5x Ligand-Lösung in modifizierten Eagle es Minimum Essential Media mit HEPES gepuffert.
6. Für Experimente bei Raumtemperatur mit 10 l 13,5x Ligandzugabe die Verbindungen mit Injektoren oder einer Mehrkanalpipette hinzufügen und die Platte von Hand oder mit einem Orbital-Shaker (20 s bei 200 Umdrehungen pro Minute) mischen.
7. Für Experimente bei 37,5 °C mit 10 l 13,5-facher Ligand-Zugabe verwenden Sie Injektoren, um Verbindungen zu verteilen und mit dem Instrumenten-Orbital-Shaker zu mischen. Bei Nichtbenutzung von Injektoren die Platte aus dem Leuchtkraftmesser entfernen, die Liganden hinzufügen und die Platte von Hand oder mit einem Orbital-Shaker (20 s bei 200 Rpm) mischen.
   HINWEIS: Verwenden Sie Injektoren und einen Shaker innerhalb des Detektionsinstruments, um Temperaturschwankungen im Zusammenhang mit dem Entfernen der Platte aus dem Luminometer zu minimieren. Für diesen Test können Standard-Tischleuchter verwendet werden. Verwenden Sie eine Integrationszeit von 0,25–2 s.

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Ergebnisse

Mit dem hier vorgestellten Verfahren wurden Wechselwirkungen zwischen einem prototypischen GPCR und zwei '-Arrestin-Isoformen überwacht. Glucagon-ähnliche Peptidrezeptorkonstrukte (GLP-1r) wurden mit Primern hergestellt, die NheI- und EcoRI-Enzymrestriktionsstellen enthalten, und in die Vektoren pBiT1.1-C [TK/LgBiT] und pBiT2.1-C [TK/SmBiT] geklont, während bei pBiT1.1-N [TK/LgBiT] und pBiT2.1-N [TK/SmBiT] unter Verwendung der Enzymrestriktionsstellen BgIII und EcoRI im Fall von '-arrestin2 und NheI und XhoI im Falle ...

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Diskussion

Mit der hier vorgestellten Methode können Die Wechselwirkungen zwischen jedem GPCR und dem '-arrestin1'2 in Echtzeit-Lebendenmitsystemen mit diesem GPCR---Arrestin-Strukturkomplementierungstest überwacht werden. In diesem Zusammenhang konnten wir die unterschiedliche Rekrutierung von -Arrestin-Rekrutierungen zwischen den beiden -arrestin-Isoformen durch die GLP-1r (A prototypische Klasse B GPCR) beobachten, wir beobachteten auch eine Dissoziation des Rezeptor---Arrestin-Komplexes wenige Minuten nach Erreichen des Lumin...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotics penicillin streptomycin	Welgene	LS202-02	Penicillin/Streptomycin
Bacterial Incubator	JEIO Tech	IB-05G	Incubator (Air-Jacket), Basic
Cell culture medium	Welgene	LM 001-05	DMEM Cell culture medium
Cell culture transfection medium	Gibco	31985-070	Optimem 1X cell culture medium
CO2 Incubator	NUAIRE	NU5720	Direct Heat CO2 Incubator
Digital water bath	Lab Tech	LWB-122D	Digital water bath lab tech
DNA Polymerase proof reading	ELPIS Biotech	EBT-1011	PfU DNA polymerase
DNA purification kit	Cosmogenetech	CMP0112	miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini
DNA Taq Polymerase	Enzynomics	P750	nTaq DNA polymerase
Enzyme restriction BglII	New England Biolabs	R0144L	BglII
Enzyme restriction buffer	New England Biolabs	B72045	CutSmart 10X Buffer
Enzyme restriction EcoRI	New England Biolabs	R3101L	EcoRI-HF
Enzyme restriction NheI	New England Biolabs	R01315	NheI
Enzyme restriction XhoI	New England Biolabs	R0146L	XhoI
Fetal Bovine Serum	Gibco Canada	12483020	Fetal Bovine Serum
Gel/PCR DNA MiniKit	Real Biotech Corporation	KH23108	HiYield Gel/PCR DNA MiniKit
Ligase	ELPIS Biotech	EBT-1025	T4 DNA Ligase
Light microscope	Olympus	CKX53SF	CKX53 Microscope Olympus
lipid transfection reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000
Luminometer	Biotek/Fisher Scientific	12504386	Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers
NanoBiT System	Promega	N2014	NanoBiT PPI MCS Starter System
Nanoluciferase substrate	Promega	N2012	Nano-Glo Live Cell assay system
PCR Thermal cycler	Eppendorf	6336000015	Master cycler Nexus SX1
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P4707-50ML	Poly-L-lysine solution
Trypsin EDTA	Gibco	25200-056	Trysin EDTA 10X
White Cell culture 96 well plates	Corning	3917	Assay Plate 96 well plate