Мониторинг GPCR-я-arrestin1/2 Взаимодействия в режиме реального времени живых систем для ускорения обнаружения наркотиков

Резюме

Взаимодействия GPCR-и-arrestin являются новой областью в открытии наркотиков GPCR. Для мониторинга таких взаимодействий в живых системах необходимы точные, точные и простые в настройке методы. Мы показываем структурный контроль комплемента для мониторинга взаимодействия GPCR-я-arrestin в реальном времени живых клеток, и он может быть распространен на любой GPCR.

Аннотация

Взаимодействие между G-белковыми рецепторами (GPCRs) и з-арестинами являются жизненно важными процессами с физиологическими последствиями большой важности. В настоящее время характеристика новых препаратов к их взаимодействию с з-арестинов и других цитосолильных белков является чрезвычайно ценным в области GPCR открытие наркотиков особенно во время изучения GPCR предвзятого агонизма. Здесь мы показываем применение нового структурного анализа комплемента для точного мониторинга взаимодействия рецепторов и-арестина в живых системах реального времени. Этот метод прост, точен и может быть легко распространен на любой GPCR интересов, а также он имеет то преимущество, что он преодолевает неспецифические взаимодействия из-за присутствия низкой промоутер выражения присутствует в каждой векторной системе. Это структурное дополнение обзор обеспечивает ключевые особенности, которые позволяют точного и точного мониторинга рецепторов-я-арестина взаимодействий, что делает его пригодным в изучении предвзятого агонизма любой системы GPCR, а также GPCR c-терминус 'фосфорилирования коды, написанные различными GPCR-киназы (GRKs) и пост-трансляционные изменения арестинов, которые стабилизируют или дестабилизируют рецептор-я-арестин комплекса.

Введение

GPCRs представляют собой цель почти 35% текущих препаратов на рынке^1,2 и четкое понимание их фармакологии имеет решающее значение в разработке новых терапевтических препаратов³. Одним из ключевых аспектов в GPCR открытие наркотиков, особенно во время развития предвзятых агонистов является характеристика новых лиганд оврецепторов к рецептору-и-арестин взаимодействий⁴ и -арестин взаимодействия с другими цитосолильных белков, таких как как клатрин⁵.

Было документально подтверждено, что зависимые сигнализации з-арестин играет ключевую роль в неврологических расстройств, таких как биполярное расстройство, тяжелая депрессия, и шизофрения^6, а также тяжелые побочные эффекты в некоторых лекарствах, таких как морфин⁷.

Текущие методы, используемые для мониторинга этих взаимодействий, как правило, не представляют фактические эндогенные уровни белков в исследовании, в некоторых случаях они показывают слабый сигнал, фотоотбеление и в зависимости от GPCR это может быть технически сложно й создать⁸. Этот новый структурный анализ дополнения использует низкий экспрессионист векторов для того, чтобы имитировать эндогенных физиологических уровней и обеспечивает высокую чувствительность по сравнению с нынешними методами⁹. Используя этот подход, можно было легко охарактеризовать Галанин рецептор-я-arrestin1'2, а также -arrestin2-клатрин взаимодействий¹⁰. Эта методология может быть широко использована для любого GPCR, представляющих особый интерес, где q-arrestins играют ключевую физиологическую функцию или их сигнализация имеет отношение к некоторым заболеваниям.

протокол

1. Стратегия дизайна Primer

1. Дизайн праймеров для внедрения генов, представляющих интерес в pBiT1.1-C (TK/LgBiT), pBiT2.1-C (TK/SmBiT), pBiT1.1-N (TK/LgBiT) и pBiT2.1-N (TK/SmBiT) Векторы.
2. Выберите по крайней мере один из этих трех сайтов в качестве одного из двух уникальных ферментов ограничения, необходимых для клонирования направления из-за наличия в кадре стоп-кодон, который делит многоклонный сайт, как показано на рисунке 1¹¹.
3. Включите нуклеотидную последовательность в грунтовки, как показано в таблице 1, чтобы кодировать остатки связующих, показанные красным цветом в таблице 2^11.
4. Для векторов pBiT1.1-C (TK/LgBiT) и pBiT2.1-C (TK/SmBiT) убедитесь, что 5-й грунт содержит кодон ATG и мощную последовательность консенсуса Козака (GCCGCCACC).
5. Для векторов pBiT1.1-N «TK/LgBiT» и pBiT2.1-N «TK/SmBiT» убедитесь, что 3-й праймер содержит стоп-кодон.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый вектор содержит hSV-TK промоутер, чтобы свести к минимуму неспецифические ассоциации и уменьшить экспериментальные артефакты, также каждый вектор имеет экспресс-кассету для устойчивости ампициллина в бактериях.

2. ПЦР

1. Настройка и запуск ПЦР реакции для усиления вставки ДНК гена интерес с помощью грунтовки разработан с шагом 1. Важно использовать высокоточные ПОЛимеразы ДНК для минимизации мутаций.
2. Используйте именно следующий порядок, чтобы подготовить 50 ЗЛ реакции ПЦР. Добавьте 35,5 л дистиллированной воды, 5 л 10-ти буфера полимеразы, 5 л смеси dNTP (2,5 мМ каждый), 1 л плазмидного шаблона (200 нг/л), 1,25 л вперед и обратного грунтовки (10 мкм) и 1 л высокой фидерной полимеразы (5 Л).
3. С помощью термоциклоза настроили следующую программу усиления ДНК.
   1. Денатурная при 95 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
   2. Повторите 25 раз следующий тепловой цикл: 95 градусов по Цельсию на 30 с, 60 градусов по Цельсию в течение 1 мин, 72 градусов по Цельсию в течение 2 мин на 1 кбитт, чтобы быть усиленным.
   3. Выполнить окончательное расширение при 72 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
   4. Держите образцы при 4 градусах по Цельсию в термоциклере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется использовать полимеразы высокой точности, чтобы свести к минимуму точечные мутации, особенно те, которые происходят во время усиления длинных последовательностей. По мере того как усилитель становится длиннее, степень точности в репликации ДНК уменьшается. Для реакции ПЦР выберите температуру, основанную на температуре плавления региона, где олиго непосредственно гибридизируются с шаблоном ДНК, а не со всей последовательностью грунтовки.
4. Очистка пЦР
   1. Изолировать продукт ПЦР от остальной части реакции ПЦР с помощью комплекта от производителя предпочтений¹². Продукт PCR теперь готов для пищеварения ограничения.

3. Пищеварение ДНК

1. Для пищеварения пЦР готовят 50 кл реакции пищеварения следующим образом.
   1. Используя трубку 1,5 мл, добавьте 12 л дистиллированной воды.
   2. Добавьте 5 кл 10-х буфера с наилучшей совместимостью с обоими ферментами ограничения.
   3. Со ступени 2.4 добавить 30 л пЦР продукта
   4. Наконец, добавьте 1,5 л каждого фермента ограничения.
   5. Кратко перемешать вихрем и инкубировать при 37,5 градуса х на ночь.
2. Для реципиента плазмидного пищеварения приготовьте 50 кл реакции пищеварения следующим образом:
   1. Используя трубку 1,5 мл, добавьте 23 л дистиллированной воды.
   2. Добавьте 5 кл 10-х буфера с наилучшей совместимостью с обоими ферментами ограничения.
   3. Добавьте 15 зЛ плазмид-получателя (200 нг/Л).
   4. Добавьте 1,5 зл и л каждого фермента ограничения.
   5. Кратко перемешать вихрем и инкубировать при 37,5 градуса х на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать 3 мкг мкг мецита плазмида для того, чтобы получить достаточный материал после очистки геля агарозы ДНК. Также уместно оставить дигевания ДНК на ночь с помощью обоих ферментов для получения высокой эффективности клонирования.

4. ОЧИЩЕНие и клонирование днк агарозного геля

1. Подготовка 1% агарозный гель для запуска переваренной плазмиды ДНК и вставки и приступить к сократить соответствующие полосы. После того, как соответствующий вектор и вставить полосы были очищены12, определить концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра.
2. Выполните перевязку ДНК, чтобы сплавить вставку к получателю плазмида.
3. Подготовка реакции перевязки около 100 нг общей ДНК, включая 50 нг плазмидного вектора.
4. Настройка коэффициента плазмид-вставки получателя примерно 1:3; он может быть рассчитан с помощью векторно-вставки калькулятор¹³.
5. Настройка отрицательного элемента управления параллельно. Например, перевязка получателя плазмид НОЙ ДНК без какой-либо вставки предоставит информацию о том, сколько фон непереваренных или самостоятельной получателя плазмида присутствует.

5. Преобразование клонов

1. Поместите трубку компетентных клеток DH5 из морозильной камеры при -80 градусов по Цельсию и немедленно перенесите ее на лед в течение 20 минут.
2. После этого времени, принять 55 л компетентных клеток DH5 и добавить 4 л реакции перевязки и перемешать, щелкнув трубку и хранить на льду в течение 45 минут.
3. Поместите трубку в водяную ванну, предварительно разогретую при 42 градусах по Цельсию ровно 48 с, и немедленно верните трубки на лед еще на 3 мин.
4. Добавьте 600 кЛ средней суммы Luria Broth (LB), предварительно разогретой при 37,5 градуса цельсия, и насижи с встряхиванием в течение 1 часа при 200 об/мин.
5. Передача 200 л в агарпластинку, содержащую ампициллин 100 мкг/мл и аккуратно распределить по поверхности с жидкостью в основном поглощается.
6. Инкубировать пластины на ночь, чтобы увидеть колонии на следующее утро. Получатель плазмида на пластине вставки должны иметь значительно больше колоний, чем получатель плазмид только пластины.

6. Изоляция готовой плазмиды

1. Выберите 3-10 отдельных бактериальных колоний и перенесите в 1 мл среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и инкубировать в течение 6 ч.
2. Возьмите 200 кЛ бактериальной суспензии и перенесите на 5 мл среды LB, содержащей ту же концентрацию ампициллина, что и в шаге 6.1, и инкубировать на ночь при 37,5 градуса х с тряской при 200 об/мин.
3. Использование miniprep ДНК комплект очистки, выполнять miniprep ДНК очистки с помощью 5 мл LB выросли на ночь после инструкции производителя¹⁴.
4. Для выявления успешных перевязок установите реакции ПЦР так же, как и в разделе 2 с использованием ДНК, полученной из шага 6.3 в качестве шаблона с теми же грунтовками, что и в разделе 2 во время первого ПЦР. Положительные клоны будут производить продукты ПЦР соответствующего размера.
5. После большой подготовки ДНК очистки положительных клонов, провести диагностическое ограничение пищеварения 500 нг очищенной ДНК с ферментами, используемыми во время клонирования шаг и запустить переваренных продуктов на 1% агарозный гель. Должна быть две полосы: одна размер вектора и одна размер новой вставки.
6. Проверить последовательность конструкции, секвенируя с помощью следующих грунтовок: Вперед 5'- aaggtgacgcgtcgtggcctcgaac-3' и обратный 5'-gcatttttttcactctttt-3'.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда ДНК реплицируется с помощью ПЦР, всегда есть возможность ошибок во время усиления даже при использовании полимеразы высокой точности, поэтому очень важно секвенировать окончательные конструкции.

7. Трансфекция и экспрессия белка

1. В ранее поли-L-лизин покрытием белой пластины 96 хорошо, выполнять посев клеток за один день до трансфекции на 2,5 х 10⁴ клетки на хорошо с помощью Dulbecco в модифицированных Eagle в среднем дополнены 10% плода сыворотки крупного рогатого скота, 100 U/mL пенициллин G, и 100 мкг / мЛ стрептомицин.
2. Используйте только 60 внутренних скважин, чтобы свести к минимуму потенциал тепловых градиентов по всей пластине и края эффекты от испарения. Добавьте 200 л стерильной дистиллированной воды в 36 внешних скважин и 150 л в пространствах между колодцами иинкубировать на ночь при 37,5 градуса х и 5% CO 2.
3. На следующее утро выполнять трансфекции с использованием 100 нг общей ДНК (50 нг каждой конструкции).
4. Назначь четыре различных плазмидных комбинаций (рецептор: я-арестин) в соответствии с рисунком 2b.
5. Для каждой плазмидной комбинации используйте 20 зл модифицированных орловских минимальных основных средств массовой информации буферизированных с HEPES с использованием 0,3 злиалли с помощью липидных трансфекционных реагента на скважину.
6. Добавьте 20 зл липовой смеси трансфекционного реагента-ДНК к каждому колодцу и смешайте тарелку по кругу по 10 с.
7. Изменение свежей среде после 6 hr инкубации на 37,5 C и 5% CO₂.
8. Инкубировать тарелку на 24 ч при 37,5 градуса х и 5% CO₂.

8. Мониторинг взаимодействия рецепторов-к-arrestin1/2 в клетках HEK293

1. Аспирировать среды и добавить 100 злицитов Eagle Минимальный основной медиа буфером с HEPES к каждой скважине и пусть пластина стабилизироваться на RT в течение 10 минут.
2. Подготовка furimazine субстрата путем объединения 1 том 100x субстрата с 19 томов LCS разбавления буфера (20-раз разбавления)¹¹, создавая 5x запас для смешивания с средой клеточной культуры.
3. Добавьте 25 зл 5 x furimazine к каждому колодцу и аккуратно перемешайте кругами по 10 с.
4. Измерьте люминесценцию в течение 10 минут для стабилизации сигнала на RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью этого исходного сигнала для нормализации реакции каждого колодца это поможет уменьшить изменчивость, вызванную различиями в количестве клеток, покрынных в скважине, также различия в эффективности трансфекции и т.д. После расчета, в среднем нормализованная реакция от репликации скважин для данного лечения наркотиков.
5. Подготовка 13,5x лиганд решение в модифицированных Eagle Минимальный основной медиа буфером с HEPES.
6. Для экспериментов при комнатной температуре с 10 л 13,5-x лиганда, добавить соединения с помощью инжекторов или многоканальной пипетки и смешать пластину вручную или с помощью орбитального шейкера (20 с при 200 об/мин).
7. Для экспериментов при 37,5 градусов по Цельсию с добавлением 10 qL 13,5x ligand, используйте инжекторы для распределения соединений и смешивания с помощью инструмента орбитального шейкера. В случае неиспользования инжекторов, удалить пластину из люминометра, добавить лиганды и смешать пластину вручную или с помощью орбитального шейкера (20 с при 200 об/мин).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте инжекторы и шейкер в приборе обнаружения, чтобы свести к минимуму колебания температуры, связанные с удалением пластины из светилометра. Стандартные светильники скамейки могут быть использованы для этого асссе. Используйте время интеграции 0,25-2 с.

Результаты

Используя представленную здесь процедуру, отслеживались взаимодействия между прототипом GPCR и двумя изоформами з-арестина. Глюкагон, как пептидный рецептор (GLP-1r) конструкции были сделаны с использованием грунтовки, содержащие NheI и EcoRI фермента ограничения сайтов и клонированы в вектор...

Обсуждение

Используя представленный здесь метод, взаимодействие между любым GPCR и q-arrestin1/2 можно контролировать в системах жизни в реальном времени, используя этот анализ структурного дополнения GPCR-я-arrestin. В этой связи, мы смогли наблюдать дифференциальный набор и арестин между двумя изообразами gl...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotics penicillin streptomycin	Welgene	LS202-02	Penicillin/Streptomycin
Bacterial Incubator	JEIO Tech	IB-05G	Incubator (Air-Jacket), Basic
Cell culture medium	Welgene	LM 001-05	DMEM Cell culture medium
Cell culture transfection medium	Gibco	31985-070	Optimem 1X cell culture medium
CO2 Incubator	NUAIRE	NU5720	Direct Heat CO2 Incubator
Digital water bath	Lab Tech	LWB-122D	Digital water bath lab tech
DNA Polymerase proof reading	ELPIS Biotech	EBT-1011	PfU DNA polymerase
DNA purification kit	Cosmogenetech	CMP0112	miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini
DNA Taq Polymerase	Enzynomics	P750	nTaq DNA polymerase
Enzyme restriction BglII	New England Biolabs	R0144L	BglII
Enzyme restriction buffer	New England Biolabs	B72045	CutSmart 10X Buffer
Enzyme restriction EcoRI	New England Biolabs	R3101L	EcoRI-HF
Enzyme restriction NheI	New England Biolabs	R01315	NheI
Enzyme restriction XhoI	New England Biolabs	R0146L	XhoI
Fetal Bovine Serum	Gibco Canada	12483020	Fetal Bovine Serum
Gel/PCR DNA MiniKit	Real Biotech Corporation	KH23108	HiYield Gel/PCR DNA MiniKit
Ligase	ELPIS Biotech	EBT-1025	T4 DNA Ligase
Light microscope	Olympus	CKX53SF	CKX53 Microscope Olympus
lipid transfection reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000
Luminometer	Biotek/Fisher Scientific	12504386	Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers
NanoBiT System	Promega	N2014	NanoBiT PPI MCS Starter System
Nanoluciferase substrate	Promega	N2012	Nano-Glo Live Cell assay system
PCR Thermal cycler	Eppendorf	6336000015	Master cycler Nexus SX1
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P4707-50ML	Poly-L-lysine solution
Trypsin EDTA	Gibco	25200-056	Trysin EDTA 10X
White Cell culture 96 well plates	Corning	3917	Assay Plate 96 well plate