מעקב GPCR-β-arrestin1/2 אינטראקציות בזמן אמת מערכות חיים כדי להאיץ את גילוי הסמים

Summary

GPCR-β-מפיגור אינטראקציות הם שדה המתעוררים בגילוי סמים GPCR. מדויק, מדויק וקל להגדיר שיטות נחוצים כדי לפקח על אינטראקציות כאלה במערכות החיים. אנו מראים שיטת compleמנטציה מבנית לניטור GPCR-β-בפיגור בתאי החיים בזמן אמת, וזה יכול להיות מורחב לכל GPCR.

Abstract

אינטראקציות בין חלבון G מצמידים קולטנים (GPCRs) ו-β-הפיגור הם תהליכים חיוניים עם השלכות פיזיולוגיות של חשיבות רבה. כיום, האפיון של תרופות הרומן כלפי האינטראקציות שלהם עם β-מפיגור וחלבונים אחרים ציטוסולוריג הוא בעל ערך רב בתחום של גילוי תרופות GPCR במיוחד במהלך המחקר של GPCR מוטה האגניזם. כאן, אנו מראים את היישום של הרומן מבנה מבנית הספר כדי לפקח במדויק על β-מפיגור של אינטראקציות במערכות החיים בזמן אמת. שיטה זו היא פשוטה, מדויקת יכול להיות מורחב בקלות לכל GPCR של עניין וגם יש לו את היתרון כי הוא מתגבר על אינטראקציות לא ספציפיות עקב נוכחות של מקדם ביטוי נמוך נוכח בכל מערכת וקטורים. זה מבנה קומפלמנטציה מספקת תכונות מפתח המאפשרות ניטור מדויק ומדויק של קולטן-הβ-מפיגור האינטראקציות, מה שהופך אותו מתאים במחקר של אגוניזם מוטה של כל מערכת GPCR, כמו גם הסוף GPCR c-הטרמינוס ' זירחון קודים שנכתבו על ידי GPCR שונים (GRKs) ו פוסט-טרנסלtional שינויים של הפיגור הייצוב או יציבות הקולטן-β-מורכב.

Introduction

GPCRs מייצגים את היעד של כמעט 35% התרופות הנוכחיות בשוק^1,2 והבנה ברורה של פרמקולוגיה שלהם הוא חיוני בפיתוח תרופות טיפוליות הרומן³. אחד ההיבטים המרכזיים בגילוי הסמים GPCR, במיוחד במהלך התפתחות של אגוניסטים מוטה הוא האפיון של ליגונים הרומן לקראת קולטן-β-מפיגור של אינטראקציות⁴ ו-β-מפיגור עם חלבונים אחרים ציטוסולונים כגון כקלרין⁵

זה תועד כי β-מפיגור איתות משחק תפקיד מפתח בהפרעות נוירולוגיות כגון הפרעה דו-קוטבית, דיכאון חמור, ו סכיזופרניה⁶ וגם תופעות לוואי חמורות בתרופות מסוימות כגון מורפיום⁷.

השיטות הנוכחיות המשמשות לניטור האינטראקציות הללו בדרך כלל לא מייצגים רמות אנדוגניים בפועל של החלבונים במחקר, במקרים מסוימים הם מראים אות חלשה, photobleaching לבנת ובהתאם GPCR זה יכול להיות מאתגרת טכנית להגדיר⁸. זה מבנה הרומן מבנית משתמש וקטורים ביטוי נמוך מקדם כדי לחקות רמות פיזיולוגיות אנדודוגני ומספק רגישות גבוהה לעומת שיטות נוכחיות⁹. באמצעות גישה זו, ניתן היה לאפיין בקלות את הקולטן Galanin-β-arrestin1/2 וגם β-arrestin2-clathrin רין אינטראקציות¹⁰. מתודולוגיה זו יכולה לשמש רבות לכל GPCR של עניין מסוים שבו β-הפיגור לשחק פונקציה פיזיולוגית מפתח או האיתות שלהם רלוונטי מחלות מסוימות.

Protocol

1. פריימר אסטרטגיית עיצוב

1. עיצוב התחל להציג גנים של עניין לתוך pBiT 1.1-C [TK/LgBiT], pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ו pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] וקטורים.
2. בחר לפחות אחד משלושת האתרים האלה כאחד משני אנזימי ההגבלה הייחודיים הדרושים לשכפול כיוונים בשל נוכחותם של מסגרת עצירה במסגרת שמפרידה את האתר הרב כמוצג באיור¹¹.
3. שילוב רצף נוקלאוטיד לתוך התחל כפי שמוצג בטבלה 1 כדי לקודד את שאריות המקשר המוצגים באדום בטבלה 2¹¹.
4. עבור pbit 1.1-c [tk/lgbit] ו-pbit 2.1-c [tk/smbit] וקטורים, ודא כי 5 התחל מכיל atg קודון רצף הסכמה חזקה של קוזק (gccgccacc).
5. עבור pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ו-pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] וקטורים, להבטיח כי 3 התחל מכיל לעצור codon.
   הערה: כל וקטור מכיל את היזם HSV-TK כדי למזער שיוך לא ספציפי ולהפחית את הממצאים הניסיוניים, גם לכל וקטור יש קלטת ביטוי עבור עמידות אמפיצילין בחיידקים.

2. PCR

1. להגדיר ולהפעיל את התגובות PCR כדי להגביר את ה-DNA להוסיף את הגן של העניין באמצעות התחל מעוצב משלב 1. חשוב להשתמש באמינות גבוהה DNA פולימראז כדי למזער מוטציות.
2. השתמש בדיוק בסדר הבא כדי להכין 50 μL של תגובת ה-PCR. להוסיף 35.5 μL של מים מזוקקים, 5 μL של 10x פולימראז מאגר, 5 μL של התערובת dNTP (2.5 mM כל אחד), 1 μL של תבנית פלאמיד (200 ng/μL), 1.25 μL של קדימה והפוך תחל (10 μM) ו-1 μL של באיכות גבוהה פולימראז (5 U/
3. שימוש בציקלטרזה הגדיר את תוכנית הגברה הבאה של הדנ א
   1. הספרות 95 ° c עבור 5 דקות.
   2. חזור על 25 פעמים את המחזור התרמי הבא: 95 ° צ' עבור 30 s, 60 ° c עבור 1 דקות, 72 ° צ' עבור 2 דקות לכל 1 kbp להיות הוגדל.
   3. הפעל הארכה אחרונה ב 72 ° c עבור 10 דקות.
   4. החזיקו את הדגימות ב -4 ° c בתוך הציקלטרנר התרמוטראני.
      הערה: מומלץ מאוד להשתמש פולימראז באיכות גבוהה כדי למזער את מוטציות הנקודה במיוחד אלה המתרחשים במהלך הגברה של רצפים ארוכים. כמו אמפליקון הופך ארוך יותר, מידת הדיוק של השכפול של ה-DNA פוחתת. עבור תגובת ה-PCR, בחר את טמפרטורת הריפוי המבוססת על טמפרטורת ההיתוך של האזור שבו האוליגוס ישירות מhybridize עם תבנית ה-DNA ולא עם כל הרצף של המפתח.
4. מוצרים לטיהור
   1. בודד את מוצר ה-PCR משאר תגובת ה-PCR באמצעות ערכה מיצרן של העדפה¹². מוצר ה-PCR מוכן כעת לעיכול הגבלה.

3. העיכול

1. עבור העיכול המוצר PCR להכין 50 μL של תגובת העיכול כדלקמן.
   1. באמצעות שפופרת 1.5 mL, להוסיף 12 μL של מים מזוקקים.
   2. הוסף 5 μL של מאגר 10x עם התאימות הטובה ביותר עם אנזימי הגבלה.
   3. משלב 2.4 להוסיף 30 μL של המוצר PCR
   4. לבסוף, הוסף 1.5 μL של כל אנזים הגבלה.
   5. לערבב בקצרה על ידי מערבולת ו-מודטה ב 37.5 ° c בלילה.
2. עבור העיכול של המטופל הפלמיד להכין 50 μL של תגובת העיכול כדלקמן:
   1. באמצעות שפופרת 1.5 mL, להוסיף 23 μL של מים מזוקקים.
   2. הוסף 5 μL של מאגר 10x עם התאימות הטובה ביותר עם אנזימי הגבלה.
   3. להוסיף 15 μL של הנמען פלמיד (200 ng/μL).
   4. הוסף 1.5 μL של כל אנזים הגבלה.
   5. לערבב בקצרה על ידי מערבולת ו-מודטה ב 37.5 ° c בלילה.
      הערה: חשוב להשתמש 3 μg של מרכז הניקוי של הנמען על מנת להשיג חומר מספיק לאחר בדיקת ה-DNA ג'ל טיהור. זה גם רלוונטי לעזוב את העיכול DNA לילה באמצעות שתי האנזימים כדי להשיג יעילות שיבוט גבוהה.

4. דנ א ג'ל לטיהור ושיבוט

1. הכן 1% agarose ג'ל להפעיל את ה-DNA מתעכל באמצע ומוסיף ולהמשיך לחתוך את הלהקות המתאימות. לאחר להקות וקטור המקביל להוסיף כבר purified12, לקבוע את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרוסקופיה.
2. בצע הארכה ל-DNA כדי להחדיר את ההכנסה לפלאמיד הנמען.
3. להכין תגובות הנוגע בסביבות 100 ng של דנ א סה כ כולל 50 ng וקטור פלמיד.
4. כוונן את היחס הבין-פלסטי לנמען של כ-1:3; ניתן לחשב אותו באמצעות מחשבון מוסף וקטורי¹³.
5. כוונן פקדים שליליים במקביל. לדוגמה, הארכה של ה-DNA של הנמען ללא כל הוספה תספק מידע לגבי מידת הרקע של האדם הבלתי מתעכל או הליגמיד של הנמען.

5. טרנספורמציה של שיבוטים

1. מניחים שפופרת של תאים DH5α המוסמכת מהמקפיא ב-80 ° c ומיד להעביר אותו על הקרח 20 דקות.
2. לאחר מכן, לקחת 55 μL של DH5α תאים מוכשרים ולהוסיף 4 μL של תגובה לאחר ולערבב על ידי מצליף הצינור ולאחסן על קרח עבור 45 דקות.
3. מניחים את הצינור באמבט מים שחומם בעבר ב 42 ° צ' עבור בדיוק 48 s ומיד לקבל את הצינורות חזרה על הקרח עבור 3 דקות נוספות.
4. הוסף 600 μL של לוריא ציר (LB) בינוני שחומם בעבר 37.5 ° צ' ו דגירה עם רעד עבור 1 שעה ב 200 rpm.
5. העבר 200 μL לצלחת אגר המכיל אמפיצילין 100 μg/mL ולהתפשט בעדינות על פני השטח עם הנוזל הוא נספג בעיקר.
6. כדי לראות את המושבות. בבוקר הבא הנמען הפלמיד על לוחית ההכנסה צריך להיות באופן משמעותי יותר מושבות מאשר הנמען לבדו פלמיד לבד.

6. בידוד פלמיד המוגמר

1. לבחור 3-10 מושבות חיידקי בודדים להעביר לתוך 1 מ ל של LB בינונית המכילה אמפיצילין (100 μg/mL) ו-דגירה עבור 6 h.
2. קח 200 μL של השעיה בקטריאלי והעברה 5 מ ל ליברות בינונית המכילה את אותו ריכוז של אמפיצילין כמו בשלב 6.1 ו דגירה לילה ב 37.5 ° צ' עם טלטול ב 200 rpm.
3. באמצעות מיני הכנה לטיהור ערכת ה-dna, לבצע מיני הכנה DNA משתמש באמצעות 5 מ ל של LB גדל לילה לאחר הוראות היצרן¹⁴.
4. כדי לזהות הטיות מוצלחות, הגדר את תגובות ה-PCR באותו אופן כמו בסעיף 2 באמצעות ה-DNA המתקבל משלב 6.3 כתבנית עם אותו התחל כמו בסעיף 2 במהלך ה-PCR הראשון. שיבוטים חיוביים יפיק מוצרים PCR עם הגודל המתאים.
5. לאחר טיהור גדול ה-DNA להכנה של שיבוטים חיוביים, התנהלות הגבלת העיכול של 500 ng של דנ א מטוהרים עם אנזימים המשמשים בשלב השיבוט ולהפעיל את המוצרים מתעכל על 1% agarose ג'ל. צריך להיות שתי להקות: אחד בגודל של הווקטור ואחד בגודל של הכנס החדש.
6. בדוק את רצף הבנייה לפי רצף באמצעות התחל הבאה: קדימה 5 '-aaggtgacgcgaac-3 ' והפוך 5 '-gcatttttttcttagtt-3 '.
   הערה: כאשר ה-DNA משוכפל באמצעות ה-PCR, תמיד יש את האפשרות של שגיאות במהלך הגברה גם כאשר באמצעות פולימאז באיכות גבוהה, ולכן חשוב מאוד לרצף את המבנים הסופיים.

7. מעבר וביטוי חלבונים

1. ב בעבר פולי-L-ליזין מצופה לבן 96 היטב צלחת, לבצע זריעת תאים יום אחד לפני היפוך ב 2.5 x 10⁴ תאים לכל טוב באמצעות בינונית שונה של הנשר של דולבקו שיושלם עם 10% סרום שור עוברי, 100 U/ML פניצילין G, and 100 μg/ סטרפטומיצין mL.
2. השתמש רק 60 הבארות הפנימיות כדי למזער את הפוטנציאל עבור מעברי חום על פני הצלחת ואפקטים הקצה מן האידוי. הוסף 200 μL של מים מזוקקים סטרילי כדי 36 בארות מחוץ ו 150 μL ב החללים בין בארות ו-דגירה הלילה ב 37.5 ° צ' ו 5% של CO₂.
3. למחרת בבוקר לבצע החצייה באמצעות 100 ng של דנ א מוחלט (50 ng כל בניית).
4. כוונן ארבע שילובים שונים פלביניים (קולטן: β-בפיגור) לפי איור 2b.
5. עבור כל להשתמש בשילוב פלסטלינה 20 μL של שונה מדיה חיוניים מינימלי של הנשר באגירה עם HEPES באמצעות 0.3 μL של מגיב התקשורת הליפידית לטובה.
6. הוסף 20 μL של העברה למעלה מגיב-DNA לתערובת היטב ולערבב את הצלחת במעגלים עבור 10 s.
7. שינוי מדיום טרי לאחר 6 שעות דגירה ב 37.5 ° צ' ו 5% CO₂.
8. מודקת את הצלחת 24 שעות ב 37.5 ° צ' ו 5% CO₂.

8. קולטן ניטור-β-arrestin1/2 אינטראקציות ב HEK293 תאים

1. המדיום להוסיף ומוסיפים 100 μL של שינוי מדיה חיוניים מינימלי של הנשר באגירה עם HEPES לכל באר ולתת את הצלחת לייצב ב RT עבור 10 דקות.
2. להכין את המצע הזועם על ידי שילוב 1 נפח של מצע 100x עם 19 כרכים של מאגר דילול LCS (דילול 20-קיפול)¹¹, יצירת מלאי 5x לערבב עם מדיום תרבות התאים.
3. הוסף 25 μL של 5x הזועם כל טוב ולערבב בעדינות עיגולים עבור 10 s.
4. מדידת האור עבור 10 דקות עבור ייצוב אותות ב RT.
   הערה: על-ידי שימוש באות בסיסית זו כדי לנרמל את התגובה של כל באר, היא תסייע להפחית את השונות שנגרמת כתוצאה מהבדלים במספר התאים המצופה בטוב, גם הבדלים ביעילות הדרך ועוד. לאחר חישוב, ממוצע התגובה המנורמלת משכפול בארות עבור טיפול תרופתי מסוים.
5. הכינו 13.5 x ליגנד פתרון ב שינוי מינימלי של הנשר מדיה חיוניים באגירה עם hepes.
6. עבור ניסויים בטמפרטורת החדר עם 10 μl של 13.5 x ליגנד בנוסף, להוסיף את תרכובות באמצעות מרססים או פיפטה רב-ערוצי ולערבב את הצלחת ביד או באמצעות שייקר מסלולית (20 s ב 200 rpm).
7. לניסויים ב 37.5 ° c עם 10 μl של 13.5 x ליגנד בנוסף, מרססים להשתמש כדי לחלק תרכובות ולערבב באמצעות מכשיר מסלולית שייקר. במקרה של לא שימוש מרססים, להסיר את הצלחת מן הלומטר, להוסיף את הליטרים ולערבב את הצלחת ביד או באמצעות שייקר מסלולית (20 s ב 200 rpm).
   הערה: השימוש מרססים ו שייקר בתוך כלי הזיהוי כדי למזער תנודות בטמפרטורה הקשורים להסרת הצלחת מתוך לומימטר. ניתן להשתמש באפשרות זו באמצעות מדידת שחקן רגיל לשימוש עבור שיטת הפעולה. השתמש בזמן שילוב של 0.25 – 2 s.

תוצאות

באמצעות ההליך המוצג כאן, אינטראקציות בין הפרוטוקול GPCR ושני β בפיגור היו מנוטרים. Glucagon כמו קולטן פפטיד (GLP-1r) בנייה נעשו באמצעות התחל המכיל NheI ו EcoRI אתרי הגבלת אנזימים משוכפל לתוך וקטורים pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] ו-pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] תוך במקרה של β-הפיגור, שני וקטורים נוספים היו השתמשו ב-pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ו-pBiT 2.1-N [TK/SmBiT]...

Discussion

באמצעות השיטה המוצגת כאן, אינטראקציות בין כל GPCR ו β-arrestin1/2 יכול להיות מנוטרים בזמן אמת מערכות החיים באמצעות זה GPCR-β-בפיגור מבניים שיטת השלמת. בהקשר זה, היינו מסוגלים לצפות הβ הדיפרנציאלי מפיגור הגיוס בין שני β-מפיגור של שניים על ידי GLP-1r (מחלקה פרוטו אופיינית B GPCR), ראינו גם דיסוציאציה של הקומ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotics penicillin streptomycin	Welgene	LS202-02	Penicillin/Streptomycin
Bacterial Incubator	JEIO Tech	IB-05G	Incubator (Air-Jacket), Basic
Cell culture medium	Welgene	LM 001-05	DMEM Cell culture medium
Cell culture transfection medium	Gibco	31985-070	Optimem 1X cell culture medium
CO2 Incubator	NUAIRE	NU5720	Direct Heat CO2 Incubator
Digital water bath	Lab Tech	LWB-122D	Digital water bath lab tech
DNA Polymerase proof reading	ELPIS Biotech	EBT-1011	PfU DNA polymerase
DNA purification kit	Cosmogenetech	CMP0112	miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini
DNA Taq Polymerase	Enzynomics	P750	nTaq DNA polymerase
Enzyme restriction BglII	New England Biolabs	R0144L	BglII
Enzyme restriction buffer	New England Biolabs	B72045	CutSmart 10X Buffer
Enzyme restriction EcoRI	New England Biolabs	R3101L	EcoRI-HF
Enzyme restriction NheI	New England Biolabs	R01315	NheI
Enzyme restriction XhoI	New England Biolabs	R0146L	XhoI
Fetal Bovine Serum	Gibco Canada	12483020	Fetal Bovine Serum
Gel/PCR DNA MiniKit	Real Biotech Corporation	KH23108	HiYield Gel/PCR DNA MiniKit
Ligase	ELPIS Biotech	EBT-1025	T4 DNA Ligase
Light microscope	Olympus	CKX53SF	CKX53 Microscope Olympus
lipid transfection reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000
Luminometer	Biotek/Fisher Scientific	12504386	Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers
NanoBiT System	Promega	N2014	NanoBiT PPI MCS Starter System
Nanoluciferase substrate	Promega	N2012	Nano-Glo Live Cell assay system
PCR Thermal cycler	Eppendorf	6336000015	Master cycler Nexus SX1
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P4707-50ML	Poly-L-lysine solution
Trypsin EDTA	Gibco	25200-056	Trysin EDTA 10X
White Cell culture 96 well plates	Corning	3917	Assay Plate 96 well plate