İzleme GPCR-β-arrestin1/2 etkileşimleri gerçek zamanlı yaşam sistemleri Ilaç Discovery hızlandırmak için

Özet

GPCR-β-tutucu etkileşimleri GPCR uyuşturucu keşfi 'nde ortaya çıkan bir alandır. Canlı sistemlerde bu tür etkileşimleri izlemek için doğru, hassas ve kolay ayarlanabilir Yöntemler gereklidir. Biz gerçek zamanlı yaşam hücrelerinde GPCR-β-tutucu etkileşimleri izlemek için yapısal bir uluslara tahlil göstermek, ve herhangi bir GPCR uzatılabilir.

Özet

G-protein bağlantılı reseptörler (GPCRs) ve β-tutucu arasındaki etkileşimler, büyük öneme sahip fizyolojik etkileri olan hayati süreçlerden ibaret. Şu anda, yeni ilaçların β-tutucu ve diğer sitosolik proteinleri ile etkileşimlerine yönelik karakterizasyonu, özellikle GPCR önyargılı agonizmin incelenmesi sırasında GPCR uyuşturucu keşfi alanında son derece değerlidir. Burada, biz gerçek zamanlı yaşam sistemlerinde reseptör-β-tutucu etkileşimleri doğru izlemek için bir roman yapısal uluslara tahlil uygulama gösterir. Bu yöntem, basit, doğru ve kolayca herhangi bir GPCR faiz uzatılabilir ve aynı zamanda her vektör sisteminde mevcut bir düşük ifade Organizatör varlığı nedeniyle spesifik olmayan etkileşimlerin üstesinden avantajı vardır. Bu yapısal uluslara tahlil reseptör-β-tutucu etkileşimlerin doğru ve hassas bir şekilde izlenmesi izin temel özellikleri sağlar, herhangi bir GPCR sistemi yanı sıra GPCR c-Terminus ' fosforilasyon önyargılı agonizm çalışmada uygun hale farklı GPCR-kinazlar (GRKs) ve reseptör-β-tutucu kompleksini stabilize eden veya istikrarsızlaştıracak olan tutucu sonrası translasyonel değişikliklerle yazılmış kodlar.

Giriş

GPCRs piyasada mevcut ilaçların yaklaşık% 35 hedef temsil^1,2 ve onların farmakolojisinin net bir anlayış yeni terapötik ilaçların gelişimi için çok önemlidir³. Özellikle önyargılı agonistlerin gelişimi sırasında GPCR uyuşturucu keşfinin önemli yönlerinden biri, yeni ligizlerin reseptör-β-tutucu etkileşimleri⁴ ve β-tutucu diğer sitosolik proteinlerle etkileşimlerine doğru karakterize edilmedir. Clathrin⁵olarak.

Β-tutucu bağımlı sinyalizasyon, bipolar bozukluk, büyük depresyon ve şizofreni⁶ gibi nörolojik hastalıklarda önemli bir rol oynadığını ve morfin⁷gibi bazı ilaçlarda da ciddi yan etkileri olduğunu belgelenmiş.

Bu etkileşimleri izlemek için kullanılan geçerli yöntemler genellikle çalışma proteinlerinin gerçek endojen düzeylerini temsil etmez, bazı durumlarda zayıf sinyal, photobleaching ve GPCR bağlı olarak teknik olarak⁸kurmak zor olabilir gösterir. Bu roman yapısal uluslara tahlil endojen fizyolojik seviyeleri taklit etmek için düşük ifade Organizatör vektörler kullanır ve mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında yüksek hassasiyet sağlar⁹. Bu yaklaşımı kullanarak, kolayca galanin reseptör-β-arrestin1/2 ve β-arrestin2-Clathrin etkileşimleri karakterize etmek mümkün oldu¹⁰. Bu metodoloji, β-tutucunun önemli bir fizyolojik fonksiyon çalabileceği veya sinyallerinin bazı hastalıklarda ilgili olduğu belirli bir ilgi alanı için yaygın olarak kullanılabilir.

Protokol

1. Primer tasarım stratejisi

1. Pbit 1.1-c [TK/lgbit], pbit 2.1-c [TK/smbit], pbit 1.1-n [TK/lgbit] ve pbit 2.1-n [TK/smbit] vektörler içine ilgi genler tanıtmak için tasarım astarlar.
2. Şekil 1¹¹' de gösterildiği gibi multicloning siteyi böler bir çerçeve içi stop kodon varlığı nedeniyle yönlü klonlama için gereken iki benzersiz kısıtlama enzimleri biri olarak bu üç siteden en az birini seçin.
3. Tablo 2¹¹' de kırmızı renkte gösterilen bağlayıcı kalıntıları kodlamak için Tablo 1 ' de gösterildiği gibi astar içine nükreotid dizisini birleştirin.
4. Pbit 1.1-c [TK/lgbit] ve pbit 2.1-c [TK/smbit] vektörler için, 5 ' astar bir ATG kodon ve güçlü bir kozak görüş sırası (gccgccacc) içerdiğinden emin olun.
5. PBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ve pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vektörler için 3 ́ astar bir stop Codon içerdiğinden emin olun.
   Not: her vektörünün nonspesifik ilişkiyi en aza indirmek ve deneysel eserler azaltmak için HSV-TK promotör içerir, Ayrıca her vektör bakterilerde ampisilin direnci için bir ifade kaseti vardır.

2. PCR

1. Adım 1 ' den tasarlanan astar kullanarak, faiz geninin eklemek DNA 'sını yükseltmek için PCR reaksiyonları ayarlayın ve çalıştırın. Mutasyonları en aza indirmek için yüksek sadakat DNA polimeraz kullanmak önemlidir.
2. 50 μL PCR reaksiyonu hazırlamak için tam olarak aşağıdaki sırayı kullanın. Ekle 35,5 μL distile su, 5 μL 10X polimeraz tampon, 5 μL dNTP karışımı (2,5 mM her), 1 μL Plasmid şablonu (200 ng/μL), 1,25 μL ileri ve ters astar (10 μM) ve 1 μL yüksek sadakat polimeraz (5 U/μL).
3. Bir termocycler kullanarak aşağıdaki DNA amplifikasyon programı kurmak.
   1. 95 Ila 5 dk. arasında denature
   2. Aşağıdaki termal döngüsü 25 kez tekrarlayın: 95 °C için 30 s, 60 °C 1 dk, 72 °C için 1 KBP başına 2 dk amplifikatördür.
   3. 72 °C ' de 10 dakika boyunca son bir uzatma çalıştırın.
   4. Numuneleri 4 °C ' de thermocycler içinde tutun.
      Not: özellikle uzun sıraları amplifikasyon sırasında meydana gelen nokta mutasyonları en aza indirmek için yüksek sadakat polimeraz kullanmak için tavsiye edilir. Amplikon uzunlaştığında, DNA 'nın çoğaltmasında doğruluk derecesi azalır. PCR reaksiyon için, oligos doğrudan DNA şablonu ile melezleşme ve astar tüm dizisi ile değil bölgenin erime sıcaklığına dayalı tavlama sıcaklığını seçin.
4. PCR ürün arıtma
   1. PCR ürününü,¹²' si bir üreticiden bir kit kullanarak PCR reaksiyonunun geri kalanından ayırın. PCR ürün şimdi kısıtlama sindirim için hazırdır.

3. DNA sindirim

1. PCR ürün sindirim hazırlamak için 50 μL sindirim reaksiyonu aşağıdaki gibi.
   1. 1,5 mL 'Lik bir tüp kullanarak 12 μL distile su ekleyin.
   2. Her iki kısıtlama enzimiyle en iyi uyumluluğa sahip 5 μL 10X tampon ekleyin.
   3. 2,4 adımda 30 μL PCR ürün ekleyin
   4. Son olarak, her kısıtlama enzim 1,5 μL ekleyin.
   5. Girdap ile kısaca karıştırın ve 37,5 °C ' de bir gecede inküye yapın.
2. Alıcı Plasmid sindirim için hazırlamak 50 μL sindirim reaksiyonu aşağıdaki gibi:
   1. 1,5 mL 'Lik bir tüp kullanarak 23 μL distile su ekleyin.
   2. Her iki kısıtlama enzimiyle en iyi uyumluluğa sahip 5 μL 10X tampon ekleyin.
   3. 15 μL alıcı Plasmid (200 ng/μL) ekleyin.
   4. Her kısıtlama enziminin 1,5 μL değerini ekleyin.
   5. Girdap ile kısaca karıştırın ve 37,5 °C ' de bir gecede inküye yapın.
      Not: DNA agaroz jel arıtma sonrası yeterli malzeme elde etmek için 3 μg alıcı plazmid kullanmak önemlidir. Ayrıca, yüksek klonlama verimliliği elde etmek için her iki enzimi kullanarak bir gecede DNA sindirimleri bırakmak ilgilidir.

4. DNA agaroz jel arıtma ve klonlama

1. Sindirilmiş DNA plazmid ve ekler çalıştırmak için% 1 agaroz jel hazırlayın ve ilgili bantları kesmek için devam. Karşılık gelen vektör ve kesici uç bantları purified12 olduktan sonra, spektrofotometreyi kullanarak DNA konsantrasyonunu belirleyin.
2. Alıcı Plasmid için eklemek sigorta DNA ligasyon gerçekleştirin.
3. Yaklaşık 100 ng, plazmid vektörü 50 ng dahil toplam DNA 'nın ligasyon reaksiyonları hazırlayın.
4. Yaklaşık 1:3 alıcı Plasmid-kesici uç oranını ayarlayın; bir Vector-INSERT Calculator¹³kullanılarak hesaplanabilir.
5. Negatif denetimler paralel olarak ayarlayın. Örneğin, herhangi bir Ekle olmadan alıcı plazmid DNA bir ligasyon sindirilmemiş veya self-ligating alıcı Plasmid ne kadar arka plan mevcut hakkında bilgi verecektir.

5. klonlar dönüşümü

1. -80 °C ' de dondurucudan DH5α yetkili hücrelerin bir tüp yerleştirin ve hemen 20 dakika buz üzerine aktarın.
2. O zamandan sonra, 55 μL DH5α yetkili hücre alın ve 4 μL ligasyon reaksiyonu ekleyin ve tüp Flicking ve 45 dakika boyunca buz üzerinde mağaza karıştırın.
3. Daha önce tam 48 s için 42 °C ısıtılmış bir su banyosuna tüp yerleştirin ve hemen başka bir 3 dakika için buz üzerinde geri tüpler almak.
4. 37,5 °C ' de daha önce ısınmış Luria broth (LB) orta 600 μL ekleyin ve 200 devirde 1 saat boyunca sallayarak inküye yapın.
5. 200 μL 'yi ampisilin 100 μg/mL içeren bir agar plakasına aktarın ve yüzeyden hafifçe yayılır ve sıvıyla çoğunlukla absorbe edilir.
6. Ertesi sabah kolonileri görmek için plakaları bir gecede kulbe etmek. Ekle plakasının alıcı plazmid alıcı Plasmid tek başına plaka daha önemli ölçüde daha fazla koloniler olmalıdır.

6. bitmiş Plasmid izolasyonu

1. Seçin 3-10 bireysel bakteriyel koloniler ve 1 mL LB orta içeren ampisilin (100 μg/mL) içine transfer ve 6 h için inkük.
2. 200 μL bakteriyel süspansiyon alın ve 6,1 adımda olduğu gibi aynı ampisilin konsantrasyonu içeren 5 mL LB orta transfer ve 37,5 ° c 'de bir gecede, 200 rpm 'de sallayarak ile inküye.
3. Bir Sage DNA kiti arıtma kullanarak, 5 ml lb kullanarak Sage DNA saflaştırmaları gerçekleştirmek bir gecede üretici talimatlar¹⁴aşağıdaki büyüdü.
4. Başarılı ligasyonları belirlemek için, ilk PCR sırasında Bölüm 2 ' de olduğu gibi aynı astar ile bir şablon olarak adım 6,3 elde edilen DNA 'Yı kullanarak bölüm 2 ' de aynı şekilde PCR reaksiyonları ayarlayın. Pozitif klonlar ilgili boyutta PCR ürünleri üretecektir.
5. Pozitif klonlar büyük hazırlık DNA arıtma sonra, klonlama aşamasında kullanılan enzimler ile 500 ng bir tanı kısıtlama sindirim davranış ve% 1 agaroz jel sindirilmiş ürünleri çalıştırın. İki bant olmalıdır: bir vektör boyutu ve bir yeni ekleme boyutu.
6. Aşağıdaki Primers kullanarak sıralama tarafından yapı sırasını doğrulayın: Forward 5 '-aaggtgacgcgtgtggcctcgaac-3 ' ve Reverse 5 '-gcatttttttcactgcattctagtt-3 '.
   Not: DNA, PCR kullanılarak çoğaltıldığında, yüksek sadakat polimeraz kullanırken bile amplifikasyon sırasında her zaman hata olasılığı vardır, bu nedenle son yapıları sıralamak çok önemlidir.

7. transfeksiyon ve protein ifadesi

1. Daha önce poli-L-lizin-kaplamalı beyaz 96 iyi plaka, bir gün transfeksiyon önce 2,5 x 10⁴ hücrelerde Iyi Dulbecco değiştirilmiş Eagle 'Nın orta fetal Sığır serum% 10 ile tamamlayıcı kullanarak hücre yapmak, 100 U/ml penisilin G, ve 100 μg/ mL streptomisin.
2. Sadece 60 iç kuyuları kullanarak, plaka ve buharlaşma kenar efektleri boyunca termal degradelerin potansiyelini en aza indirmek için. 36 dış kuyularına ve 150 μL 'ye 200 μL steril damıtılmış su ekleyin ve gece boyunca 37,5 °C ve CO₂' nin% 5 ' inde kulyur.
3. Ertesi sabah kullanarak transfeksiyon gerçekleştirmek 100 toplam DNA NG (50 ng her yapı).
4. Şekil 2B'ye göre dört farklı Plasmid kombinasyonu (reseptör: β-tutucu) ayarlayın.
5. Her bir Plasmid kombinasyonu için, iyi başına 0,3 μL lipidik transfeksiyon reakajını kullanarak HEPES ile tamponlu 20 μL modifiye kartal minimum Essential medya kullanılır.
6. Her bir kuyu için 20 μL lipidik transfeksiyon reagent-DNA karışımı ekleyin ve plakayı 10 s için çevrelerde karıştırın.
7. 37,5 °C ve% 5 CO₂' de 6 saat İnkübasyon sonrasında taze ortamı değiştirin.
8. 37,5 °C ve% 5 CO₂' de 24 saat boyunca plakayı kulbe etme.

8. HEK293 hücrelerde reseptör-β-arrestin1/2 etkileşimlerini izleme

1. Aspirate orta ve eklemek 100 μL değiştirilmiş Eagle 's asgari Essential Media her iyi HEPES ile tamponlu ve plaka RT 10 dakika stabilize izin.
2. 100 x substrat 1 hacminin LCS seyreltme tamponu 19 hacimleri ile birleştirerek furimazin substrat hazırlayın (20 kat seyreltme)¹¹, hücre kültürü orta ile karıştırmak için 5x stok oluşturma.
3. Her bir kuyu için 25 μL 5x furimazin ekleyin ve 10 s için çevrelerde hafifçe karıştırın.
4. RT 'de sinyal stabilizasyonu için 10 dakika boyunca Luminesans ölçmek.
   Not: her iyi tepkisi normalleştirmek için bu taban çizgisi sinyali kullanarak, aynı zamanda transfeksiyon verimliliği, vb farklılıkların hücre sayısı farklılıklar neden farklılıkları azaltmak için yardımcı olacaktır. Hesaplanan bir kez, belirli bir ilaç tedavisi için çoğaltmak kuyuları normalleştirilmiş yanıt ortalama.
5. Modifiye kartal asgari Essential medya HEPES ile tamponlu 13.5 x ligand solüsyonu hazırlayın.
6. 10 μL 13.5 x ligand ilavesi ile Oda sıcaklığında deneyler için, enjektörler veya çok kanallı pipet kullanarak bileşikleri ekleyin ve plakayı elle veya orbital Shaker (200 rpm 'de 20 s) kullanarak karıştırın.
7. 10 μL 13.5 x ligand ilavesi ile 37,5 °C ' de deneyler için, cihaz orbital Shaker kullanarak bileşikleri ve karışımı dağıtmak için enjektörler kullanın. Enjektörleri kullanmıyorsanız, plakayı luminometreden çıkarın, ligleri ekleyin ve plakayı elle veya orbital Shaker (200 rpm 'de 20 s) kullanarak karıştırın.
   Not: armataktaki plakayı kaldırarak ilgili sıcaklık dalgalanmalarını en aza indirmek için tespit aleti içinde Enjektörler ve bir shaker kullanın. Bu tahlil için standart standtop Luminometreler kullanılabilir. 0.25 – 2 s entegre süresini kullanın.

Sonuçlar

Burada sunulan prosedürü kullanarak, prototip GPCR ile iki β-tutucu isoform arasındaki etkileşimler izleniyor. Peptid reseptör (GLP-1R) gibi glukagon yapıları NheI ve EcoRI enzim kısıtlama siteleri içeren astar kullanılarak yapılmıştır ve vektörler pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] ve pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] içine klonlanmış β-tutucu durumunda, iki ek vektörler β-arrestin1 durumunda β-arrestin2 ve NheI ve XhoI durumunda pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ve pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] kullanarak enzim kısıtlama siteleri Bgiıı...

Tartışmalar

Burada sunulan yöntemi kullanarak, herhangi bir GPCR ve β-arrestin1/2 arasındaki etkileşimler bu GPCR-β-tutucu yapısal tamamlayıcı tahlil kullanarak gerçek zamanlı yaşam sistemlerinde izlenebilir. Bu bağlamda, GLP-1R (prototip Sınıf B GPCR) tarafından iki β-tutucu isoform arasında diferansiyel β-tutucu işe alma izlenmesini başardık, biz de maksimum ulaştıktan sonra birkaç dakika reseptör-β-tutucu kompleksi bir ayrışma gözlenen Işıksaçan sinyal.

Yapısal tamamlay...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotics penicillin streptomycin	Welgene	LS202-02	Penicillin/Streptomycin
Bacterial Incubator	JEIO Tech	IB-05G	Incubator (Air-Jacket), Basic
Cell culture medium	Welgene	LM 001-05	DMEM Cell culture medium
Cell culture transfection medium	Gibco	31985-070	Optimem 1X cell culture medium
CO2 Incubator	NUAIRE	NU5720	Direct Heat CO2 Incubator
Digital water bath	Lab Tech	LWB-122D	Digital water bath lab tech
DNA Polymerase proof reading	ELPIS Biotech	EBT-1011	PfU DNA polymerase
DNA purification kit	Cosmogenetech	CMP0112	miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini
DNA Taq Polymerase	Enzynomics	P750	nTaq DNA polymerase
Enzyme restriction BglII	New England Biolabs	R0144L	BglII
Enzyme restriction buffer	New England Biolabs	B72045	CutSmart 10X Buffer
Enzyme restriction EcoRI	New England Biolabs	R3101L	EcoRI-HF
Enzyme restriction NheI	New England Biolabs	R01315	NheI
Enzyme restriction XhoI	New England Biolabs	R0146L	XhoI
Fetal Bovine Serum	Gibco Canada	12483020	Fetal Bovine Serum
Gel/PCR DNA MiniKit	Real Biotech Corporation	KH23108	HiYield Gel/PCR DNA MiniKit
Ligase	ELPIS Biotech	EBT-1025	T4 DNA Ligase
Light microscope	Olympus	CKX53SF	CKX53 Microscope Olympus
lipid transfection reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000
Luminometer	Biotek/Fisher Scientific	12504386	Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers
NanoBiT System	Promega	N2014	NanoBiT PPI MCS Starter System
Nanoluciferase substrate	Promega	N2012	Nano-Glo Live Cell assay system
PCR Thermal cycler	Eppendorf	6336000015	Master cycler Nexus SX1
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P4707-50ML	Poly-L-lysine solution
Trypsin EDTA	Gibco	25200-056	Trysin EDTA 10X
White Cell culture 96 well plates	Corning	3917	Assay Plate 96 well plate