JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكولا لتقييم التوازن بين الإفراج عن الغلوتامات وإزالة في المشابك الجلوتامات القشرية واحدة في شرائح حادة من الفئران البالغة. يستخدم هذا البروتوكول مستشعر الفلورسنت iGluu للكشف عن الغلوتامات ، وكاميرا sCMOS للحصول على الإشارة وجهاز لإضاءة الليزر البؤري.

Abstract

نقاط الاشتباك العصبي هي وحدات وظيفية مجزأة للغاية تعمل بشكل مستقل على بعضها البعض. في مرض هنتنغتون (HD) وغيرها من الاضطرابات العصبية التنكسية، قد يتعرض هذا الاستقلال للخطر بسبب عدم كفاية إزالة الغلوتامات وما ينتج عن ذلك من آثار الانسكاب والتسرب. وقد تورطت التغطية الفلكية المتغيرة للمحطات الطرفية presynaptic و / أو العمود الفقري التشجرات ، فضلا عن انخفاض حجم مجموعات نقل الغلوتامات في مواقع الإفراج الغلوتامات في الإمراض من الأمراض مما أدى إلى أعراض dys -/hyperkinesia. ومع ذلك ، فإن الآليات التي تؤدي إلى خلل في نقاط الاشتباك العصبي الجلوتامات في HD ليست مفهومة جيدا. تحسين وتطبيق التصوير المشبك حصلنا على بيانات تسليط ضوء جديد على الآليات التي تعوق بدء الحركات. هنا، ونحن نصف العناصر الرئيسية لنهج غير مكلفة نسبيا لتحقيق قرار واحد المشبك باستخدام جديدة مشفرة وراثيا ultrafast الغلوتامات الاستشعار iGluش،البصريات واسعة المجال، وCMOS العلمية (sCMOS) الكاميرا، ليزر 473 نانومتر ونظام تحديد المواقع بالليزر لتقييم حالة المشابك القشرية في شرائح حادة من العمر مناسبة الفئران صحية أو المريضة. تم بناء العابرين الغلوتامات من بكسل واحد أو متعددة للحصول على تقديرات ط) الإفراج الغلوتامات على أساس الارتفاع الأقصى لتركيز الغلوتامات [غلو] بجانب المنطقة النشطة وii) الغلوتامات المنعكسة في الوقت الثابت من الاضمحلال (TauD) من perisynaptic [Glu]. الاختلافات في حجم النوبة يستريح وأنماط متناقضة من اللدونة على المدى القصير بمثابة معايير لتحديد المحطات القشرية على أنها تنتمي إلى داخل telencephalic (IT) أو مسار المسار الهرمي (PT). باستخدام هذه الأساليب، اكتشفنا أن في الفئران HD أعراض ~ 40٪ من نقاط الاشتباك العصبي الكورتيكوستريا من نوع PT أظهرت إزالة الغلوتامات غير كافية، مما يشير إلى أن هذه نقاط الاشتباك العصبي قد تكون في خطر للضرر excitotoxic. النتائج تؤكد فائدة TauD كعلامة بيولوجية من نقاط الاشتباك العصبي المختلة في الفئران هنتنغتون مع النمط الظاهري نقص الحركة.

Introduction

عادة ما يتم تقييم التأثير النسبي لكل محطة متشابكة تنتمي إلى "اتصال وحدوي" (أي الاتصال بين الخلايا العصبية 2) من خلال تأثيرها على الجزء الأولي من الخلايا العصبية postynaptic1،2. التسجيلات الجسدية و / أو التشجرتيك من الخلايا العصبية postynaptic تمثل الأكثر شيوعا، وحتى الآن، أيضا الوسائل الأكثر إنتاجية لتوضيح معالجة المعلومات تحت منظور من أعلى إلى أسفل أو عمودي3،4،5. ومع ذلك ، فإن وجود الخلايا الفلكية مع مناطقها المنفصلة و (في القوارض) غير المتداخلة قد تساهم في منظور أفقي يستند إلى الآليات المحلية لتبادل الإشارات والتكامل والتزامن في المواقع المتشابكة6،7،8،9،10.

لأنه من المعروف أن astroglia تلعب، بشكل عام، دورا رئيسيا في الإمراض من الأمراض العصبية التنكسية11،12 ، وعلى وجه الخصوص ، دورا في صيانة واللدونة من الغلوتامات العصبية13،14،15،16، فمن المتصور أن التعديلات في أداء متشابك تتطور وفقا لحالة الخلايا الفلكية في المنطقة المستهدفة المشتركة من الألياف المتنوعة مع الأصل ولمواصلة استكشاف الآليات التنظيمية المحلية المستمدة من الأهداف/الأستروغليا في مجال الصحة والمرض، من الضروري تقييم نقاط الاشتباك العصبي الفردية. وقد تم وضع هذا النهج لتقدير نطاق الإفراج الوظيفي الغلوتامات ومؤشرات إزالة وتحديد المعايير التي يمكن استخدامها لتحديد نقاط الاشتباك العصبي المختلة (أو المستردة) في مناطق الدماغ الأكثر ارتباطا ببدء الحركة (أي، أولا وقبل كل شيء في قشرة المحرك والمسح الظهري).

وstriatum يفتقر الخلايا العصبية غلواماترارجي الجوهرية. ولذلك، فمن السهل نسبيا لتحديد afferents الجلوتامات من أصل extrastriatal. هذا الأخير تنشأ في الغالب في المهاد الهيلي وفي قشرة الدماغ (انظر17،18،19،20 لأكثر). تتشكل نقاط الاشتباك العصبي القشرية من محاور عصبية هرمية مترجمة في طبقات القشرية 2/3 و 5. تشكل المحاور ذات الصلة اتصالات ثنائية داخل telencephalic (IT) أو اتصالات ipsilateral عبر نظام الألياف الذي يشكل أكثر caudally الجهاز الهرمي (PT). وقد اقترح كذلك أن تكنولوجيا المعلومات وPT-نوع المحطات الطرفية تختلف في خصائص الإفراج عنها وحجم21،,22. في ضوء هذه البيانات، يمكن للمرء أيضا أن نتوقع بعض الاختلافات في التعامل مع الغلوتامات.

وstriatum هو منطقة الدماغ الأكثر تضررا في مرض هنتنغتون (HD)5. HD الإنسان هو اضطراب التنكس العصبي ة الوراثية الشديدة. نموذج الماوس Q175 يوفر فرصة للتحقيق في الأساس الخلوي للشكل البُدَلي للحرارة من HD، وهي حالة لديها الكثير من القواسم المشتركة مع الشلل الرعاش. ابتداء من سن حوالي 1 سنة، homozygote Q175 الفئران (HOM) تظهر علامات نقص الكينيزيا، كما كشفت عن قياس الوقت الذي يقضيه دون حركة في حقل مفتوح23. أكدت التجارب الحالية مع فئران Heterozygote Q175 (HET) العجز الحركي السابق الذي لوحظ في HOM ، بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت أن العجز الحركي الملحوظ كان مصحوبًا بمستوى مخفض من ناقل الأحماض الأمينية الارتسية الارتسية 2 البروتين (EAAT2) في المنطقة المجاورة مباشرة للمحطات المتشابكة القشرية24. ولذلك فقد افترض أن العجز في الغلوتامات الفلكية يمكن أن يؤدي إلى خلل وظيفي أو حتى فقدان نقاط الاشتباك العصبي على حدة25،26.

هنا، ونحن وصف نهج جديد يسمح للمرء أن تقييم إزالة الغلوتامات المشبك واحد بالنسبة لكمية الناقل العصبي صدر. تم التعبير عن مستشعر الغلوتامات الجديد iGluu في الخلايا العصبية الهرمية القشرية. تم تطويره من قبل كاتالين Török27 ويمثل تعديلا للإدخال سابقا عالية تقارب ولكن بطيئة الغلوتامات استشعار iGluSnFR28. كلا المجسات هي مشتقات بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (EGFP). للاطلاع على الخصائص الطيفية والحركية، انظر Helassa et al.27. لفترة وجيزة، iGluu هو جهاز استشعار منخفضة التقارب مع الحركية التنشيط السريع، وبالتالي مناسبة بشكل خاص لدراسة إزالة الغلوتامات في المحطات متشابك الغلوتامات الإفراج. تم تحديد ثابت وقت التفكك من iGluu في جهاز توقف التدفق ، مما جعل Tauقبالة قيمة 2.1 مللي ثانية عند 20 درجة مئوية ، ولكن 0.68 مللي ثانية عند استقراء درجة حرارة 34 درجة مئوية27. المحطات الجانبية Schaffer واحد بحث في 34 درجة مئوية مع ليزر ليزر حلزوني في منطقة CA1 من ثقافات فرس النهر organotypic تحت المجهر 2-فوتون أظهرت متوسط الوقت ثابت من الاضمحلال من 2.7 مللي ثانية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد نُفذت جميع الأعمال وفقاً لتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/EU للتجارب على الحيوانات، وتم تسجيلها في مكتب برلين لحماية الصحة والسلامة التقنية (G0233/14 وG0218/17).

ملاحظة: يمكن إجراء تسجيلات من Q175 من النوع البري (WT) والهيتيراجوت (HETs) في أي عمر وجنس. هنا درسنا الذكور والإناث في سن 51 إلى 76 أسبوعا.

1. حقن الغلوتامات الاستشعار iGluش للتعبير في Axons القشرية

  1. استخدام السُحب ماصة (وضع خطوة واحدة) لإعداد ماصات الزجاج borosilicate لحقن الفيروس. بعد سحب، كسر ماصة يدويا للحصول على قطر تلميح من 30-50 ميكرومتر. أوتوكلاف الماصة والأدوات الجراحية، بما في ذلك الحفر لفتح الجمجمة.
  2. تخزين الفيروس AAV9-CaMKIIa.iGluش. WPRE-hGH (7.5 × 1013gc/mL) عند -80 درجة مئوية في 10 ميكروات ميكرولتر. إذا تم إجراء الحقن بعد وقت قصير من إنتاج الفيروس (في غضون 6 أشهر)، والحفاظ على 5 درجة مئوية. قبل الجراحة، أخرج القارورة وحافظ عليها في درجة حرارة الغرفة.
  3. ملء ماصة الزجاج وإزالة أي فقاعات.
  4. تحقن الحيوان بحقن داخل البلح يحتوي على 87.5 ملغم/كغ من الكيتامين و12.5 ملغم/كغ زيلازين. حقن تحت الجلد 0.25٪ بوبيفاكين (8 ملغ / كجم) لتخفيف الألم إضافية. تحقق من عمق التخدير من خلال مراقبة العضلات ومراقبة عدم وجود ردود الفعل الناجمة عن الألم.
  5. اُزل الجلد على الرأس وتعقيمه بالكحول بنسبة 70%. تناسب الماوس في الإطار stereotaxic.
  6. استخدم مشرط لإزالة الجلد وسرعة عالية (38،000 دورة في الدقيقة) حفر لجعل ثقب 1.2 ملم في العظام فوق قشرة المحرك.
  7. قم بتركيب الحقنة بأداة الحقن المرفقة في حامل المتلاعب الدقيق. أدخل ماصة رأسيا في القشرة في 4 مواقع مختلفة. إحداثيات الحقن هي، فيما يتعلق bregma (في مم): الأمامي 1.5، الجانبي 1.56، 1.8، 2.04، 2.28. العمق فيما يتعلق دورا ماتر هو (في مم): 1.5-1.7.
  8. باستخدام نظام الحقن، قم بحقن 0.3 ميكرولتر لكل موقع من محلول الفيروس غير المخفف بسرعة 0.05 ميكرولتر/دقيقة. بعد كل حقنة، اترك الماصة في مكانها لمدة دقيقة واحدة قبل سحبه ببطء (1 مم/دقيقة).
  9. الانتهاء من إغلاق الجرح الجراحي مع خياطة النايلون.
  10. اترك الماوس لمدة 0.5 إلى 1 ساعة على وسادة تدفئة في قفص نظيف قبل إعادته إلى قفصه الأصلي.
  11. الحفاظ على الماوس على دورة 12 ساعة ليلا لمدة 6 إلى 8 أسابيع قبل إعداد شرائح الدماغ الحادة.
    ملاحظة: لتجنب ردود الفعل المناعية التي تؤدي إلى تلف الخلايا وفقدان المشبك، يجب إجراء حقن البنى الفيروسية المتعددة في وقت واحد أو في غضون 2-3 ساعات بعد الحقن الأولي. تم اختيار إحداثيات حقن iGluu وفقًا لأطلس الدماغ Paxinos و Franklin29. أنها تتوافق مع القشرة الحركية M1. تصور تلطّح المناعة للأدمغة المحقونة العديد من محاور عصبية المحاور ودوالي المحاور المحورية المعزولة بشكل جيد في الترايتوم ipsi وcontralateral وفي القشريات M1 و S1 المنضدية.

2. البحث عن محطات الجلوتاماتالحساس التعبير عن جغ الجلوتامات iGluش

  1. وضع المعايرة
    1. قم بإعداد كاميرا sCMOS وبرنامج التحكم في الكاميرا مع الإعدادات التالية. على صفحة القراءة تعيين معدل قراءات بكسل: 560 ميغاهرتز (= أسرع قراءات)، حساسية / النطاق الديناميكي: بت، مرشح الضوضاء زائفة: نعم، تداخل القراءة: نعم. في صفحة Binning/ROI، حدد ملء الشاشة.
    2. إعداد شريحة زجاجية تحتوي على قطرة من 5 ملغ / مل لوسيفر الأصفر (LY) تحت زلة غطاء.
    3. ضع شريحة LY تحت هدف 63x ، افتح مصراع الليزر وقم بإجراء عملية استحواذ تسلسلية باستخدام الإعدادات التالية: Pixel Binning: 1x1 ، وضع الزناد: داخلي ، وقت التعرض: الحد الأدنى (سيتم تحديده).
    4. ضبط قوة الليزر لإنتاج بقعة فلورية قطرها 4 ميكرومتر (يجب ألا تحتوي الصورة على بكسل مشبع).
    5. لإجراء معايرة نظام تحديد المواقع بالليزر، حدد الإعدادات التالية في برنامج تحديد المواقع بالليزر: قطر بحجم البقعة:10، سرعة المسح الضوئي:43.200 كيلو هرتز. انقر على زر بدء الحصول على الصورة على اللوحة اليمنى. تعيين أشواط: 0، تشغيل تأخير: 0، وحدد الخيار تشغيل في TTL على صفحة التسلسل. انقر على زر المعايرة في صفحة المعايرة ومعايرة برنامج التحكم بالليزر وفقًا للتعليمات الموضحة في الزاوية العلوية اليسرى من شاشة الاستحواذ.
    6. إذا كان الإعداد يستخدم برامج مستقلة للتحكم في الكاميرا والليزر، فاحصل على لقطات شاشة من نافذة اقتناء الكاميرا وأرسلها إلى برنامج التحكم بالليزر لإعادة حساب إحداثيات XY. إذا تم تثبيت البرنامج على أجهزة كمبيوتر مختلفة، ثم استخدم المختطف الفيديو لاستيراد الصورة إلى برنامج التحكم بالليزر. سيحتاج برنامج التحكم بالليزر إلى معلومات حول عوامل قياس XY وتعويضاتها. لهذا الغرض، حدد إحداثيات الزوايا العلوية اليسرى والسفلية اليسرى والسفلية اليمنى للصورة داخل نافذة الاستحواذ الخاصة ببرنامج التحكم بالليزر. احسب عوامل التحجيم وفقًا للمعادلات التالية: عامل X = (X أسفل اليمين - X أسفل اليسار) / 2048 ، X offset = X أسفل اليسار ، عامل Y = (Y أعلى اليسار - Y أسفل اليسار) / 2048 ، Y offset = Y أسفل اليسار.
    7. في نهاية إجراء المعايرة، قم بإنشاء منطقة مستطيلة ذات أهمية (ROI) من 267x460 بكسل، ونقلها إلى وسط الشاشة وانقر على زر تسلسل البدء.
    8. العودة إلى إعدادات برنامج التحكم في الكاميرا التالية: Binning:2x2، وضع الزناد:التعرض الخارجي، وقت التعرض:الحد الأدنى (سيتم تحديده).
  2. وضع تصحيح الفلورسينس التلقائي
    ملاحظة: مستوى الراحة من [Glu] في بيئة المحطات المتشابكة النشطة عادة ما يكون أقل من 100 nM14،30،31،32،33،34. وفقا لذلك، فإن أي جهاز استشعار من الغلوتامات، وخاصة استشعار تقارب منخفضة مثل iGluش تكون قاتمة بدلا في غياب الإفراج عن الغلوتامات متشابك. ومع ذلك، يمكن الكشف عن بعض iGluش الفلورسينس حتى في بقية، ولكن يجب أن تكون متميزة عن autofluorescence الأنسجة. الإضاءة 473 نانومتر يثير كل من iGluش الفلورسينس وautofluorescence(الشكل 1A-C). هذا الأخير يحتل مجموعة واسعة من الأطوال الموجية، في حين يقتصر iGluu fluorescence إلى 480-580 نانومتر (بحد أقصى في 510 نانومتر). ويستند التصحيح للautofluorescence على الحصول على صورتين مع مرشحات مختلفة عالية تمرير.
    1. إعداد شرائح الدماغ مقدما كما هو موضح في مكان آخر35. حافظ على شرائح النخالة جاهزة.
    2. نقل شرائح في غرفة التسجيل، وغمرها في السائل النخاعي الاصطناعي المؤكّد (ACSF) التي تحتوي على 125 mM NaCl، 3 mKCl، 1.25 mM NaH2PO4،25 mM NaHCO3،2 mM CaCl2،1 mM MgCl2،10 mM الجلوكوز (درجة الحموضة 7.3، 303 mOsm/L)، تكملها 0.5 مم بيروفات الصوديوم، 2.8 m m اسكوربات الصوديوم و 0.005 m الجلوتثيون. استخدم معدل تدفق 1-2 مل/دقيقة. حافظ على درجة حرارة الحمام عند 28-30 درجة مئوية.
    3. حدد موقع السترياتوم الظهري تحت هدف غمر الماء 20x. إصلاح شرائح مع شبكة النايلون على القيثارة البلاتين للحد من حركة الأنسجة. انتقل إلى هدف غمر الماء 63x /NA 1.0. حدد الفلاتر التي تعكس الضوء عند 473 نانومتر (مرآة ديكلرويك) والضوء العابر مع الأطوال الموجية > 510 نانومتر (مرشح الانبعاثات).
    4. مزامنة الإضاءة والتحفيز واكتساب الصور باستخدام لوحة AD /DA مع برنامج التحكم المعني. تعيين برنامج الزناد للسيطرة على اقتناء مع وقت التعرض بالليزر من 180 مللي ثانية ووقت الحصول على صورة من 160 مللي ثانية استخدم جهاز تحديد المواقع بالليزر لإرسال شعاع الليزر إلى عدد محدد مسبقا من النقاط وتحديد إعدادات لسرعة المسح الضوئي وحجم البقعة.
    5. الحصول على صورة كل من autofluorescence وiGluu-positive هياكل باستخدام مرشح تمرير عالية في 510 نانومتر ("صورة صفراء").
    6. الحصول على صورة مع autofluescence وحدها باستخدام مرشح تمرير عالية في 600 نانومتر ("صورة حمراء").
    7. قم بتحجيم الصور الحمراء والصفراء، باستخدام متوسط كثافة الـ 10 البيكسلات الأكثر سطوعًا و10 وحدات بكسل الداكنة لتحديد النطاق. تنفيذ الطرح "الأصفر ناقص صورة حمراء" وإعادة تحجيم الصورة المطروحة لتوليد معيار 8 بت ملف tif لتصور مريحة من نوبة الفائدة(الشكل 1D). أنه يحتوي على بكسل مشرقuمن هياكل iGlu u-positive، بكسل رمادي من الخلفية وبكسل الظلام من الهياكل مع autofluorescence.
      ملاحظة: مع المعدات المعطاة فإن متوسط الفلورسينس الراحة (F) سيكون أقل من 700 A.U.
  3. وضع بحث بوتون
    ملاحظة: قد تنتمي وحدات البكسل الإيجابيةiGluإلى عناصر مختلفة وظيفيًا من شجرة المحور، مثل فروع محور عصبي من ترتيب مختلف، ومواقع التشعب، والدوالي بعد استنفاد الحويصلات أو الدوالي النشطة تمامًا. ومع ذلك ، يكاد يكون من المستحيل تحديد المحطات المتشابكالوظيفية فقط عن طريق الفحص البصري. لذلك ، يحتاج كل محطة متشابكة غلوتامياتيكي ة إلى تحديد من خلال استجابتها لنزع الاستقطاب الكهربائي. يجب التخلص من المواقع التي لا تستجيب للتحفيز. الوسائل الفسيولوجية للحث على إطلاق الغلوتامات من محاور عصبية كورتيكوستيراتلي هو الحصول على عمل محتمل. ويمكن تحقيق ذلك إما باستخدام قناة رودوبسين من الخصائص الطيفية المناسبة أو عن طريق التحفيز الكهربائي للمحور العصبي تصور من قبل iGluش نفسها. لتجنب تنشيط opsin العرضي ، فضلنا هذا approastep الأخير
    1. استخدام السُحب ميكروبيبيت (في وضع من أربع خطوات) لإنتاج ماصة التحفيز من الشعيرات الزجاجية borosilicate. يجب أن يكون قطر الطرف الداخلي حوالي 1 ميكرومتر. عندما تمتلئ مع ACSF، يجب أن تكون مقاومة القطب حوالي 10 MΟ.
    2. للحث على العمل الإفراج المحتملة التي تعتمد على الغلوتامات من مجموعة من نوبات متشابك تعلق على محور عصبي نفسه، واستخدام التكبير 63x، ومرشح الانبعاثات 510 نانومتر والصورة المطروحة لوضع القطب التحفيز الزجاج بجانب الدوالي الفلورية . تجنب القرب من محاور إضافية.
    3. بدوره على محفز لتقديم النبضات الحالية depolarizing إلى ماصة التحفيز. استخدام الكثافات الحالية حول 2 μA (لا يزيد عن 10 μA).
    4. قم بتشغيل نظام تطبيق الحمام متعدد القنوات حيث توفر قناة واحدة حل الحمام القياسي والقنوات الأخرى التي توفر حاصرات الأيون أو الناقلات أو مستقبلات الأغشية. التحكم في التدفق في موقع التسجيل ومن ثم التبديل إلى قناة التيترودوتوكسين (TTX) (محلول الحمام بالإضافة إلى 1 μM TTX). بعد 2-3 دقيقة، وتحفيز bouton من الفائدة مرة أخرى، ولكن الآن في غياب جيل العمل المحتملة. الافراج عن مباشرة بسبب تدفق الكالسيوم من خلال قنوات الكالسيوم التي تعتمد على الجهد.
    5. من خلال تحويل مفتاح الكثافة على المحفز ، قم بضبط تيار التحفيز للحصول على استجابات مشابهة لتلك التي تم الحصول عليها عبر إمكانات العمل. عادة، سيكون تيار التحفيز حوالي 6 μA ل0.5 مللي ثانية من إزالة الاستقطاب.
    6. للاختبار الأساسي للإعداد، وتطبيق 0.5 mM CdCl2. وجود هذا الغلوتامات قناة الكالسيوم مانع الإفراج تماما يمنع الإفراج الغلوتامات متشابك وبالتالي التحقق من الاعتماد على الكالسيوم من إشارة الغلوتامات أثار مباشرة.
      ملاحظة: قد تساعد التوصية العامة التالية على زيادة معدل نجاح تجارب المشبك الواحد في striatum. لتحديد محطات متشابك الجلوتامات مع آلات الإفراج سليمة، وينبغي أن دوالي الخصية: (1) يكون لها شكل سلس مثل المغزل؛ '2' عدم الارتباط بتشعب محور عصبي؛ '3' أن تكون أكثر إشراقا من الهياكل الأخرى على "الصورة الصفراء"؛ '4' الإقامة في العصب ة التريكية وليس في المسالك الليفية؛ '5' الإقامة على فرع محور عصبي رقيق جدا؛ '6' لا يقيم داخل الأجزاء الأعمق من الشريحة.

3. تصور الإفراج الغلوتامات وإزالة

  1. وضع التسجيل
    ملاحظة: بعد طرح الفلورسة التلقائية (الخطوة 2.2) وعدد قليل من الاختبارات الأولية لاستجابة نوبة الاهتمام (الخطوة 2.3)، يمكن أن يبدأ الحصول على البيانات. يمكن ملاحظة الاستجابات للتنشيط الكهربائي لإطلاق الغلوتامات من محطات المحور المحوري الواحد في الصورة مباشرة(الشكل 2)، دون تطبيق المزيد من أدوات التحليل. ومع ذلك ، ثبت أن تكون مريحة جدا لاستخراج على الفور بعض المؤشرات الأساسية لأداء المشبك(الشكل 3). وهذه المعلومات ضرورية لاتخاذ قرارات بشأن مسار التجربة اللاحق، مثل اختيار أنواع طرفية معينة، والتقييم السريع للتعديلات المتصلة بتقنية HD، وعدد وتواتر التجارب أو العقاقير التي يتعين تطبيقها مع نظام الإنصهر الفائق. قد يكون من الضروري أيضا للتعامل مع القطع الأثرية التي تظهر في نهاية المطاف. أولاً، يتم وصف الإعدادات القياسية لتسجيل البيانات.
    1. باستخدام محركات XY المجهر، ضعuiGlu u-bouted bouton على مقربة من مركز viewfield. إيقاف اكتساب الصورة باستخدام زر إلغاء الامتلاك. في آخر صورة تم الحصول عليها ، حدد موضع XY لمركز bouton الاستراحة عن طريق النقر عليه بزر الماوس الأيسر. سيتم عرض إحداثيات XY لمؤشر المجموعة على لوحة الحالة السفلية لنافذة الاكتساب.
    2. باستخدام بيانات المعايرة (الخطوة 2.1.6) ، قم بحساب إحداثيات الموقع الذي يجب إرسال شعاع الليزر فيه لإثارة iGluu fluorescence. استخدام المعادلات التالية: X ليزر = X الكاميرا * X عامل + X أوعوض، Y الليزر = Y أوعوض - Y الكاميرا * عامل Y. أثناء إجراء عملية إعادة الحساب هذه، انتبه إلى إعدادات الوجه الرأسيأو الأفقي للكاميرا.
    3. إنشاء تسلسل نقطة واحدة في برنامج التحكم بالليزر باستخدام الإحداثيات المحسوبة. لهذا الغرض، حدد نقطة في مربع إضافة إلى التسلسل في صفحة تسلسل برنامج التحكم بالليزر. حدد 10 μs للتأخير لبدء بدء و 180 مللي ثانية لوقت نبض الليزر. نقل الماوس إلى الإحداثيات المحسوبة وانقر على الزر الأيسر.
    4. حدد الإعدادات التالية في برنامج التحكم بالليزر: تشغيل:0، تشغيل تأخير:0، تسلسل:تشغيل في TTL. ثم انقر فوق تسلسل البدء.
    5. في برنامج التحكم في الكاميرا، حدد الإعدادات التالية: في صفحة Binning/ROI، قم بتعيين منطقة الصورة:مخصص، بكسل بينينغ:2x2، الارتفاع:20، العرض: 20، اليسار:X-تنسيق ية للراحة iGluu-positivespot ناقص 10 بكسل، أسفل: Y-تنسيق من يستريح iGluu-إيجابيةبقعة ناقص 10 بكسل، وضع الاستحواذ: سلسلة حركية، طول سلسلة:400، وقت التعرض: 0.0003744s (الحد الأدنى من القيمة). مع مثل هذه الإعدادات، سيكون معدل الاستحواذ 2.48 كيلو هرتز.
    6. حدد وضع المشغل:خارجي. انقر فوق أخذ إشارة في برنامج التحكم في الكاميرا. بدء البروتوكول التجريبي الموضوع لجهاز الزناد.
    7. تنفيذ محاكمة البروتوكول التجريبي مع الخط الزمني التالي: 0 مللي ثانية – بدء التجربة, 1 مللي ثانية – بدء إضاءة الليزر, 20 مللي ثانية – بدء الحصول على صورة مع الكاميرا, 70 مللي ثانية – بدء التحفيز الكهربائي 1, 120 – بدء التحفيز الكهربائي 2, 181 مللي ثانية – نهاية المحاكمة (الليزر والكاميرا قبالة). وهكذا، خلال تجربة واحدة، تحصل الكاميرا على 400 إطار بتردد 2.48 كيلو هرتز. انظر الخطوات 2.3.3 و 2.3.5. للحصول على تفاصيل حول التحفيز الكهربائي.
    8. للسماح باسترداد كاف لبرك الحويصلات السابقة، قم بتطبيق بروتوكول Trial بتردد تكرار 0.1 هرتز أو أقل.
  2. البناء خارج الخط من الغلوتامات تقييم عابر وسريع للإفراج الغلوتامات وإزالة لتحديد نقاط الاشتباك العصبي المرضية
    1. تشغيل إجراءات التقييم. هنا ، نستخدم برنامج ًا مكتوبًا داخليًا SynBout v. 3.2. (المؤلف: أنطون دفورزكا). هناك حاجة إلى الخطوات التالية لبناء عابر من بكسل مع بكسل مرتفعة iGluش الفلورسينس كما هو الحال في الفيديو من الشكل 2.
    2. لتحديد حجم النوبة، احسب متوسط الانحراف المعياري (SD) لكثافة الفلورسين اتافيرو ROI في الراحة (F)، قبل بداية التحفيز. تحديد ومربع المنطقة التي تشغلها بكسل مع F>متوسط + 3 SD(الشكل 3A). تحديد القطر الظاهري (في μm) مع افتراض شكل دائري من منطقة فوق عتبة.
    3. تحديد ΟF كفرق بين قيمة كثافة الذروة وF. رسم التيار المحفز وΟF / F مع الزمن(الشكل 3B). حساب SD من ΟF / F في بقية (قبل بداية التحفيز) و "ذروة السعة". استخدم البكسل مع سعة الذروة أكثر من 3 SD من ΟF / F لإجراء تركيب أحادي الأسي للاضمحلال من الذروة. تحديد ثابت الوقت من الاضمحلال TauD من ΟF / F.
    4. لتقدير "السعة القصوى" في مشبك معين، حدد البكسل بأعلى قيمة /F. ويقع عادة داخل أو بجوار حدود الاستراحة bouton iGluu fluorescence. "السعة القصوى" سيكون أفضل مؤشر على حمولة الغلوتامات المقدمة إلى آلات إزالة مشبك واحد.
    5. لتقدير الامتداد المكاني للإشارة iGluu، حدد قطر مساحة جميع وحدات البكسل فوق العتبة مجتمعة لتشكيل دائرة افتراضية. ويسمى القطر المعني "انتشار". يشير مصطلح "ذروة الانتشار" ثم إلى القيمة القصوى للانتشار المتوسط العابر(الشكل 3C، الفرق بين الخطوط الحمراء المنقط).
  3. تصحيحات للقطع الأثرية المحتملة
    ملاحظة: يرتبط نزع الاستقطاب الكهربائي بتدفق خارجي للمحلول داخل الماصة. وهذا قد يؤدي إلى تشريد الأنسجة الصغيرة. للتمييز بين التغييرات الناجمة عن التحفيز من iGluu والتحولات خارج التركيز من الصورة ، يمكن للمرء استخدام النهج التالي لتحديد والقضاء على التحف التشريد(الشكل 4).
    1. تحليل الخصائص المكانية للبيكسلات فوق العتبة المشتقة من عائد الاستثمار مع علامات الإزاحة(الشكل 4F-H).
    2. العثور على بكسل خارج الحدود المحددة في البداية من bouton في بقية(الشكل 4F-H، محاصر باللون الأحمر).
    3. تحديد قيم كثافة البكسل السالبة الموجودة في نهاية المطاف(الشكل 4I, J). أي ΟF / F في الاتجاه السلبي مع سعة أكبر من متوسط ما قبل التحفيز ± 3 SD ينبغي أن ينظر إلى القطع الأثرية، وينبغي التخلص من السجل.
    4. لتجنب القطع الأثرية خارج التركيز، ضع قطب التحفيز على الجانب الجانبي الأنتيرو من النوبة متشابك، واستخدام التحفيز الكهربائي ثنائي الطور وتقليل كثافة التحفيز / المدة.
      ملاحظة: يمكن أيضًا اشتقاق القطع الأثرية خارج التركيز من الكاميرا. إذا لم يتم تثبيت هذا الأخير على النحو الأمثل إلى المجهر يمكن أن تنتج التذبذبات، على الأرجح بسبب الاهتزازات الصغيرة لنظام تبريد الكاميرا. مثل هذه الاهتزازات خلق نمط "يين ويانغ" في الصور ΟF / F الدورية مع تردد 50 هرتز. يمكن طرح الاهتزازات رياضيا من إشارة الفلورسينس، ولكن الجودة النهائية للقياسات تعتمد بعد ذلك بشكل حاسم على وقت التسجيل.
    5. إصلاح الكاميرا إلى المجهر بحيث الاهتزازات غائبة. إذا بقي هذا الأخير، ضع طوقاً مطاطياً بين الكاميرا ومحول المجهر.
      ملاحظة: لا يمكن للمرء أن يهمل إمكانية أن neuropil striatal حول المشبك من الفائدة يحتوي على الدوالي glutamatergic التي لا تعبر عن iGluش وبالتالي تبقى غير مرئية. وفي حالة التنشيط المشترك (على الأرجح في غياب TTX) قد يتأثر العابرون الذين يتم الحصول عليها من النوبة ذات الاهتمام بالانتشار. وينطبق الشيء نفسه على iGluu-التعبير عن المحطات التي كانت خارج التركيز. ومن الظواهر المميزة في هذه الحالة أن العابرين الفلوريين ينشأون من منطقة أوسع بكثير. كما يتم القضاء على هذه الاستجابة من قبل TTX، يمكن للمرء أن يفسر على أنها استجابة غير محددة الناجمة عن التنشيط الألياف المتعددة لا مبرر لها.
    6. لتصحيح هذه الاستجابة متعددة الألياف غير محددة، اتبع الإجراء المبين في الشكل 5. استخدم إشارة الفلورية للبيكسلات عند حدود حقل العرض. لتقليل استجابة الخلفية، قلل من شدة التحفيز والمدة أو استخدم TTX.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تحديد نوعين من الدوالي الجلوتاميتراتي القشرية
تنشأ تكنولوجيا المعلومات وPT afferents في الطبقة 2/3 و 5 ، على التوالي ، وتظهر تشعبات تفاضلية وأنماط إنهاء في مخطط ipsilateral وcontralateral (محطات تكنولوجيا المعلومات فقط). لا يزال لا يعرف سوى القليل عن خصائص الإفراج عن الغلوتامات وإزالة في ظل ظروف ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تتعلق التجارب بمسألة ذات أهمية عامة — عدم الاستقلالية المشبكية وفقدانها المحتمل في سياق التنكس العصبي، ونحن نصف نهجًا جديدًا لتحديد نقاط الاشتباك العصبي المصابة في شرائح الدماغ الحادة من الفئران المسنة (>1 سنة). الاستفادة من الخصائص الحركية المحسنة للاستشعار الغلوتامات أدخلت مؤخرا iGlu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل CHDI (A-12467) ، ومؤسسة البحوث الألمانية (Exc 257/1 و DFG Project-ID 327654276 - SFB 1315) وصناديق الأبحاث داخل الجدارة التابعة للمؤسسة الخيرية. نشكر ك. توروك، سانت جورج، جامعة لندن، ون هيلاسا، جامعة ليفربول، على iGluu plasmid والعديد من المناقشات المفيدة. وقدم د. بيتانس وأ. شونهير مساعدة تقنية ممتازة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Stereo microsopeWPIPZMIIIPrecision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frameStoelting51500DDigital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipmentStoelting514439VForedom K1070 cromoter Kit
Injection systemStoelting53311Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µlHamilton8793075RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning systemRapp OptoElectronicUGA-40UGA-40
Blue laser for iGluu excitationRapp OptoElectronicDL-473-020-S473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nmRapp OptoElectronicROE TB-355-405-473Dichroic
1P upright microscopeCarl Zeiss000000-1066-600Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0Carl Zeiss421480-9900W Plan-Apochromat
4x objectiveCarl Zeiss44-00-20Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluuOmega opticalXF2030
Emission filter for iGluuOmega opticalXF3086
Dichroic mirrorOmega opticalQMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr.Omega opticalQMAX EM600-650
sCMOS cameraAndorZYLA4.2PCL10ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition softwareAndor4.30.30034.0Solis
AD/DA converterHEKA Elektronik895035InstruTECH LIH8+8
Aquisition softwareHEKA Elektronik895153TIDA5.25
Electrode positioning systemSutter InstrumentMPC-200Micromanipulator
Electrical stimulatorCharite workshopsSTIM-26
SlicerLeicaVT1200 SVibrotome
Brown/Flaming-type pullerSutter InstrSU-P1000P-1000
Glass tubes for injection pipettesWPI1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettesWPIR100-F3
TetrodotoxinAbcamab120054TTX
iGluu plasmidAddgene106122pCI-syn-iGluu
Q175 miceJackson Lab27410Z-Q175-KI

References

  1. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
  2. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
  3. Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56(2018).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
  5. Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington's disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
  6. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
  7. Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
  8. Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554(2018).
  9. Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
  10. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239(2018).
  11. Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
  12. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
  13. Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
  14. Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451(2018).
  15. Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
  16. Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
  17. Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington's disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
  18. Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington's disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
  19. Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson's disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
  20. Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
  21. Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
  22. Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons - dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142(2010).
  23. Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. Neuroscience. 311, 519-538 (2015).
  24. Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
  25. Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington's disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
  26. Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
  27. Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
  28. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
  29. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier. (2003).
  30. Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
  31. Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
  32. Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154(2017).
  33. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
  34. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  35. Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
  36. Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
  37. Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
  38. Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
  39. Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
  40. Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
  41. Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
  42. Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, aO., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
  43. Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
  44. Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19(2019).
  45. Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
  46. Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington's disease mice. Scientific Reports. 9, 6634(2019).
  47. Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414(2019).
  48. Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
  49. Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157 presynaptic astrocyte optogenetics iGluu sCMOS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved