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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Bewertung des Gleichgewichts zwischen Glutamatfreisetzung und Clearance bei einzelnen kortikostriatalen glutamatergen Synapsen in akuten Scheiben von erwachsenen Mäusen. Dieses Protokoll verwendet den Fluoreszenzsensor iGluu zur Glutamaterkennung, eine sCMOS-Kamera zur Signalerfassung und ein Gerät zur fokalen Laserbeleuchtung.

Zusammenfassung

Synapsen sind hochteilige Funktionseinheiten, die unabhängig voneinander arbeiten. Bei der Huntington-Krankheit (HD) und anderen neurodegenerativen Erkrankungen könnte diese Unabhängigkeit aufgrund unzureichender Glutamat-Clearance und der daraus resultierenden Spill-in- und Spill-out-Effekte beeinträchtigt werden. Veränderte astrozytische Abdeckung der präsynaptischen Terminals und/oder dendritischen Stacheln sowie eine reduzierte Größe von Glutamat-Transporter-Clustern an Glutamat-Freisetzungsstellen wurden in die Pathogenese von Krankheiten verwickelt, die zu Symptomen von Dys-/Hyperkinesie führen. Jedoch, die Mechanismen, die zur Dysfunktion der glutamatergen Synapsen bei der Huntington-Krankheit führen, sind nicht gut verstanden. Um die Synapsenbildgebung zu verbessern und anzuwenden, haben wir Daten erhalten, die ein neues Licht auf die Mechanismen werfen, die die Einleitung von Bewegungen behindern. Hier beschreiben wir die Grundelemente eines relativ kostengünstigen Ansatzes zur Erzielung einer einheitlichen Synapsenauflösung mit dem neuen genetisch kodierten Ultraschnellglutamatsensor iGluu, Weitfeldoptik, einer wissenschaftlichen CMOS (sCMOS) Kamera, einem 473 nm Laser und einem Laser-Positionierungssystem zur Bewertung des Zustands von korticostriatalen Synapsen in akuten Scheiben ab altersgerechter Gesundheit oder krankheitserregenden Mäusen. Glutamattransienten wurden aus einzelnen oder mehreren Pixeln konstruiert, um Schätzungen von i) Glutamatfreisetzung basierend auf der maximalen Erhöhung der Glutamatkonzentration [Glu] neben der aktiven Zone und ii) Glutamataufnahme zu erhalten, wie sie in der Zeitkonstante des Zerfalls (TauD) des perisynaptischen [Glu] widergespiegelt wird. Unterschiede in der Ruhender Boutongröße und den kontrastierenden Mustern der kurzfristigen Plastizität dienten als Kriterien für die Identifizierung korticostriataler Terminals als Zugehörigkeit zum intratelenzephalen (IT) oder dem Pyramidal Trakt (PT) Pfad. Mit diesen Methoden entdeckten wir, dass bei symptomatischen Huntington-Mäusen 40 % der korticostriatalen Synapsen des PT-Typs eine unzureichende Glutamatclearance aufwiesen, was darauf hindeutet, dass diese Synapsen einem Risiko für exzitotoxische Schäden ausgesetzt sein könnten. Die Ergebnisse unterstreichen die Nützlichkeit von TauD als Biomarker für dysfunktionale Synapsen bei Huntington-Mäusen mit einem hypoeintischen Phänotyp.

Einleitung

Die relative Wirkung jedes synaptischen Terminals, das zu einer "einheitlichen Verbindung" (d.h. der Verbindung zwischen 2 Nervenzellen) gehört, wird typischerweise durch seinen Einfluss auf das Anfangssegment des postsynaptischen Neurons1,2beurteilt. Somatische und/oder dendritische Aufnahmen von postsynaptischen Neuronen stellen die häufigsten und bis jetzt auch produktivsten Mittel zur Klärung der Informationsverarbeitung unter einer Top-down- oder vertikalen Perspektive3,4,5dar. Die Anwesenheit von Astrozyten mit ihren diskreten und (in Nagetieren) nicht überlappenden Gebieten kann jedoch zu einer horizontalen Perspektive beitragen, die auf lokalen Mechanismen des Signalaustauschs, der Integration und der Synchronisation an synaptischen Standorten6,7,8,9,10basiert.

Da bekannt ist, dass Astroglia im Allgemeinen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der neurodegenerativen Krankheit11,12 spielt und insbesondere eine Rolle bei der Aufrechterhaltung und Plastizität von glutamatergen Synapsen13,14,15,16, ist es denkbar, dass sich Veränderungen der synaptischen Leistung in Übereinstimmung mit dem Zustand der Astrozyten im gemeinsamen Zielbereich von afferent Fasern mit unterschiedlichem Ursprung entwickeln. Um die von den Ziel- und Astroglia-abgeleiteten lokalen Regulierungsmechanismen bei Gesundheit und Krankheit weiter zu erforschen, ist es notwendig, einzelne Synapsen zu bewerten. Der vorliegende Ansatz wurde ausgearbeitet, um den Bereich der funktionellen Glutamatfreisetzungs- und Clearance-Indikatoren zu schätzen und Kriterien zu definieren, die verwendet werden können, um dysfunktionale (oder wiedergewonnene) Synapsen in Hirnbereichen zu identifizieren, die am engsten mit der Bewegungsinitiierung zusammenhängen (d. h. zunächst im motorischen Kortex und dorsal striatum).

Dem Striatum fehlen intrinsische glutamaterge Neuronen. Daher ist es relativ einfach, glutamaterge Afferenten außerstriatalen Ursprungs zu identifizieren. Letztere stammen meist aus dem medialen Thalamus und in der Großhirnrinde (siehe17,18,19,20 für mehr). Corticostriatal Synapsen werden durch die Axone von pyramidenförmigen Neuronen in kortikalen Schichten 2/3 und 5 lokalisiert gebildet. Die jeweiligen Axone bilden bilaterale intratelenzephale (IT) Verbindungen oder ipsilaterale Verbindungen über ein Fasersystem, das den Pyramidentrakt (PT) eher kauarisch bildet. Es wurde ferner vorgeschlagen, dass sich IT- und PT-Terminals in ihren Freigabeeigenschaften und Größe21,22unterscheiden. Angesichts dieser Daten könnte man auch einige Unterschiede im Umgang mit Glutamat erwarten.

Das Striatum ist der am stärksten betroffene Hirnbereich bei der Huntington-Krankheit (HD)5. Die menschliche Huntington-Krankheit ist eine schwere genetisch vererbte neurodegenerative Erkrankung. Das Q175-Mausmodell bietet die Möglichkeit, die zelluläre Basis der hypoeinetisch-starren Form der Huntington-Krankheit zu untersuchen, einem Zustand, der viel mit Parkinsonismus gemein hat. Ab einem Alter von etwa 1 Jahr zeigen homozygote Q175-Mäuse (HOM) Anzeichen von Hypokinesie, wie sich aus der Messung der Zeit ohne Bewegung in einem offenen Feld zeigt23. Die vorliegenden Experimente mit heterozygoten Q175-Mäusen (HET) bestätigten die zuvor beobachteten motorischen Defizite in HOM und zeigten darüber hinaus, dass die beobachteten motorischen Defizite von einem reduzierten Niveau des astrozytären exzitatorischen Aminosäuretransporters 2 Protein (EAAT2) in unmittelbarer Nähe der kortikostktalen synaptischen Klemmen24begleitet wurden. Es wurde daher vermutet, dass ein Defizit in der astrozytischen Glutamataufnahme zu Dysfunktion oder sogar zum Verlust der jeweiligen Synapsen führen könnte25,26.

Hier beschreiben wir einen neuen Ansatz, der es erlaubt, einzelne Synapseglutamat-Clearance relativ zur Menge des freigesetzten Neurotransmitters zu bewerten. Der neue Glutamatsensor iGluu wurde in kortikostktalen Pyramidenneuronen exprimiert. Es wurde von Katalin Török27 entwickelt und stellt eine Modifikation des zuvor eingeführten hochaffinen, aber langsamen Glutamatsensors iGluSnFR28dar. Beide Sensoren sind Derivate des verbesserten grünen Fluoreszenzproteins (EGFP). Für spektrale und kinetische Eigenschaften siehe Helassa et al.27. Kurz gesagt, iGluu ist ein Sensor mit geringer Affinität mit schneller Deaktivierungskinetik und daher besonders gut geeignet, um die Glutamatclearance an Glutamat-releasing synaptischen Klemmen zu untersuchen. Die Dissoziationszeitkonstante von iGluu wurde in einer Stoppstromvorrichtung ermittelt, die einenTau-Ab-Wert von 2,1 ms bei 20 °C, aber 0,68 ms bei hochgerechneter Temperatur von 34 °C27ergab. Einzelne Schaffer-Kollateralklemmen, die bei 34 °C mit Spirallaserscanning im CA1-Bereich organotypischer Hippocampuskulturen unter einem 2-Photonenmikroskop untersucht wurden, wiesen eine mittlere Zerfallskonstante von 2,7 ms auf.

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Protokoll

Alle Arbeiten wurden gemäß der EU-Richtlinie 2010/63/EU für Tierversuche durchgeführt und beim Berliner Amt für Gesundheitsschutz und technische Sicherheit (G0233/14 und G0218/17) registriert.

HINWEIS: Aufnahmen von Q175 Wildtyp (WT) und Heterozygoten (HETs) können in jedem Alter und Geschlecht durchgeführt werden. Hier haben wir Männchen und Weibchen im Alter von 51 bis 76 Wochen untersucht.

1. Injektion des Glutamat-Sensors iGluu für Expression in corticostriatalen Axonen

  1. Verwenden Sie den Pipettenzieher (Ein-Schritt-Modus), um Borosilikatglaspipetten für die Injektion des Virus vorzubereiten. Nach dem Ziehen brechen Sie die Pipette manuell, um einen Spitzendurchmesser von 30–50 m zu erhalten. Autoklavieren Sie die Pipette und chirurgische Instrumente, einschließlich des Bohrers zum Öffnen des Schädels.
  2. Speichern Sie den Virus AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 1013gc/ml) bei -80 °C in 10 l Aliquots. Wenn Injektionen kurz nach der Virusproduktion (innerhalb von 6 Monaten) durchgeführt werden, bei 5 °C aufbewahren. Vor der Operation die Durchstechflasche herausnehmen und bei Raumtemperatur aufbewahren.
  3. Füllen Sie die Glaspipette und entfernen Sie alle Blasen.
  4. Anästhesisieren Sie das Tier mit einer intraperitonealen Injektion einer Lösung, die 87,5 mg/kg Ketamin und 12,5 mg/kg Xylazin enthält. Subkutan 0,25% Bupivacain (8 mg/kg) zur zusätzlichen Schmerzlinderung injizieren. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Muskeltonus überwachen und das Fehlen schmerzinduzierter Reflexe beobachten.
  5. Rasieren Sie die Haut auf dem Kopf und sterilisieren Sie sie mit 70% Alkohol. Passen Sie die Maus in den stereotaxic Rahmen.
  6. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Haut zu entfernen und eine hohe Geschwindigkeit (38.000 Rpm) Bohrer, um ein 1,2 mm Loch im Knochen über dem Motorkortex zu machen.
  7. Montieren Sie die Spritze mit der angeschlossenen Injektionspipette im Halter eines Präzisionsmanipulators. Setzen Sie die vertikal ausgerichtete Pipette an 4 verschiedenen Stellen in den Kortex ein. Die Injektionskoordinaten sind in Bezug auf Bregma (in mm): vorder1,5, seitlich 1,56, 1,8, 2,04, 2,28. Die Tiefe in Bezug auf dura mater beträgt (in mm): 1,5–1,7.
  8. Injizieren Sie mit dem Injektionssystem 0,3 l pro Stelle der unverdünnten Viruslösung mit einer Geschwindigkeit von 0,05 l/min. Nach jeder Injektion die Pipette 1 min an Ort und Stelle lassen, bevor Sie sie langsam zurückziehen (1 mm/min).
  9. Beenden Sie die chirurgische Wunde mit einer Nylonnaht.
  10. Lassen Sie die Maus für 0,5 bis 1 h auf einem Heizkissen in einem sauberen Käfig, bevor Sie sie in ihren ursprünglichen Käfig zurück.
  11. Halten Sie die Maus auf einem 12 h Tag-Nacht-Zyklus für 6 bis 8 Wochen vor der Vorbereitung von akuten Gehirnscheiben.
    HINWEIS: Um Immunreaktionen zu vermeiden, die zu Zellschäden und Synapsenverlust führen, muss die Injektion mehrerer viraler Konstrukte gleichzeitig oder innerhalb von 2 bis 3 Stunden nach der primärinjektion durchgeführt werden. Die Koordinaten für die iGluu Injektion wurden nach dem Paxinos und Franklin29 Gehirnatlas ausgewählt. Sie entsprechen dem Motorkortex M1. Die Immunostainierung der injizierten Gehirne visualisierte zahlreiche, aber meist gut isolierte Axone und Axonvarikositäten im ipsi- und kontralateralen Striatum und in den kontralateralen M1- und S1-Kortiken.

2. Suche nach Glutamaterge Terminals Ausdrücken des Glutamat-Sensors iGluu

  1. Kalibrierungsmodus
    1. Bereiten Sie die sCMOS-Kamera und die Kamerasteuerungssoftware mit den folgenden Einstellungen vor. Auf der Ausleseseite Pixel-Ausleserateeingestellt: 560 MHz (= schnellstes Auslesen), Empfindlichkeit/Dynamikbereich: Bit, Spurious Noise Filter: Ja, Überlappen-Auslesung: Ja. Wählen Sie auf der Seite Binning/ROI den Vollbildmodus aus.
    2. Bereiten Sie eine Glasrutsche mit einem Tropfen von 5 mg/ml Lucifer Yellow (LY) unter einem Deckblatt vor.
    3. Platzieren Sie das LY-Dia unter einem 63-fachen Objektiv, öffnen Sie den Laserverschluss und führen Sie eine serielle Erfassung mit den folgenden Einstellungen durch: Pixel Binning: 1x1, Trigger-Modus: Intern, Belichtungszeit: Minimal (zu bestimmen).
    4. Passen Sie die Laserleistung an, um einen Fluoreszenzfleck von 4 m Durchmesser zu erzeugen (das Bild sollte keine gesättigten Pixel enthalten).
    5. Um eine Kalibrierung des Laser-Positionierungssystems durchzuführen, wählen Sie die folgenden Einstellungen in der Laser-Positionierungssoftware: Spot-Größe Durchmesser: 10, Scangeschwindigkeit: 43.200 kHz. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bildaufnahme starten auf dem rechten Bereich. Set Runs: 0, Run delay: 0, und wähle die Option Bei TTL ausführen auf der Seite Sequenz. Klicken Sie auf der Seite Kalibrierung auf die Schaltfläche Kalibrieren und kalibrieren Sie die Lasersteuerungssoftware gemäß den Anweisungen in der oberen linken Ecke des Erfassungsbildschirms.
    6. Wenn das Setup eine unabhängige Software für die Kamera- und Lasersteuerung verwendet, erfassen Sie Screenshots aus dem Kameraerfassungsfenster und senden Sie sie zur Neuberechnung der XY-Koordinaten an die Lasersteuerungssoftware. Wenn die Software auf verschiedenen Computern installiert ist, verwenden Sie einen Video-Grabber, um das Bild in die Lasersteuerungssoftware zu importieren. Die Lasersteuerungssoftware benötigt die Informationen zu den XY-Skalierungsfaktoren und -offsets. Bestimmen Sie zu diesem Zweck die Koordinaten der oberen linken, unteren linken und unteren rechten Ecken des Bildes im Erfassungsfenster des Lasersteuerungsprogramms. Berechnen Sie die Skalierungsfaktoren nach den folgenden Gleichungen: X-Faktor = (X unten rechts – X unten links)/2048, X-Offset = X unten-links, Y-Faktor = (Y oben-links – Y unten links)/2048, Y-Offset = Y unten-links.
    7. Erstellen Sie am Ende des Kalibrierungsvorgangs einen rechteckigen Bereich von 267x460 Pixeln, verschieben Sie ihn in die Mitte des Bildschirms, und klicken Sie auf die Schaltfläche Sequenz starten.
    8. Zurück zu den folgenden Kamerasteuerungs-Softwareeinstellungen: Binning: 2x2, Trigger-Modus: Externe Belichtung, Belichtungszeit: Minimal (noch zu bestimmen).
  2. Autofluoreszenzkorrekturmodus
    ANMERKUNG: Der Ruhegrad von [Glu] in der Umgebung aktiver synaptischer Klemmen liegt typischerweise unter 100 nM14,30,31,32,33,34. Dementsprechend wird jeder Sensor von Glutamat, insbesondere ein Sensor mit geringer Affinität wie iGluu, in Ermangelung einer synaptischen Glutamatfreisetzung eher schwach sein. Dennoch kann eine gewisse iGluu Fluoreszenz sogar im Ruhezustand nachgewiesen werden, muss aber von der Gewebe-Autofluoreszenz unterschieden werden. Die 473 nm Beleuchtung entlockt sowohl iGluu Fluoreszenz als auch Autofluoreszenz (Abbildung 1A-C). Letzteres nimmt einen weiten Wellenlängenbereich ein, während die iGluu Fluoreszenz auf 480–580 nm begrenzt ist (maximal 510 nm). Die Korrektur der Autofluoreszenz basiert auf der Erfassung von zwei Bildern mit unterschiedlichen Hochpassfiltern.
    1. Bereiten Sie Gehirnscheiben im Voraus vor, wie an anderer Stelle beschrieben35. Kleiescheiben bereit halten.
    2. Übertragen Sie die Scheiben in die Aufnahmekammer und tauchen Sie sie in sauerstoffisiertes künstliches Zerebrospinalfluid (ACSF) mit 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM Glucose (pH 7,3, 303 mOsm/L), ergänzt mit 0,5 mM Natriumpyruvat, 2,8 mM Natriumascorbat und 0,005 mM Glutathion. Verwenden Sie eine Durchflussmenge von 1–2 ml/min. Halten Sie die Badtemperatur bei 28–30 °C.
    3. Suchen Sie das dorsale Striatum unter einem 20-fachen Wasser-Immersionsobjektiv. Befestigen Sie die Scheiben mit einem Nylongitter auf einer Platinharfe, um die Gewebebewegung zu minimieren. Wechseln Sie zum 63x /NA 1.0 Wasserimmertionsziel. Wählen Sie Filter, die Licht bei 473 nm (dichroitischer Spiegel) reflektieren und Licht mit Wellenlängen >510 nm (Emissionsfilter) übergeben.
    4. Synchronisieren Sie Beleuchtung, Stimulation und Bildaufnahme mit einer AD/DA-Platine mit der jeweiligen Steuerungssoftware. Stellen Sie das Triggerprogramm ein, um die Erfassung mit einer Laserbelichtungszeit von 180 ms und einer Bildaufnahmezeit von 160 ms zu steuern. Verwenden Sie das Laserpositioniergerät, um den Laserstrahl an eine vorgegebene Anzahl von Punkten zu senden und die Einstellungen für Scangeschwindigkeit und Spotgrößezu definieren.
    5. Erfassen Sie ein Bild von Autofluoreszenz und iGluu-positivenStrukturen mit einem Hochpassfilter bei 510 nm ("gelbes Bild").
    6. Erfassen Sie ein Bild mit Autofluoreszenz allein mit einem Hochpassfilter bei 600 nm ("rotes Bild").
    7. Skalieren Sie die roten und gelben Bilder, indem Sie die mittleren Intensitäten der 10 hellsten und der 10 dunkelsten Pixel verwenden, um den Bereich zu definieren. Führen Sie eine Subtraktion "gelb minus rotes Bild" durch und skalieren Sie das subtrahierte Bild neu, um eine standardmäßige 8-Bit-Tif-Datei für eine bequeme Visualisierung des Interessensszufalls zu generieren (Abbildung 1D). Es enthält die hellen Pixel aus den iGluu-positivenStrukturen, graue Pixel aus dem Hintergrund und dunkle Pixel aus Strukturen mit Autofluoreszenz.
      HINWEIS: Bei der gegebenen Ausrüstung liegt die mittlere ruhende Fluoreszenz (F) unter 700 a.U.
  3. Bouton-Suchmodus
    HINWEIS: iGluu-positivePixel können zu funktional unterschiedlichen Elementen des Axonbaums gehören, wie Axonzweige unterschiedlicher Reihenfolge, Vermehrungsstellen, Krampfadern nach Vesikelabbau oder vollständig aktive Varikositäten. Es ist jedoch fast unmöglich, funktionale synaptische Terminals nur durch visuelle Inspektion zu identifizieren. Daher muss jedes glutamaterge synaptische Terminal durch seine Reaktionsfähigkeit auf elektrische Depolarisation identifiziert werden. Seiten, die nicht auf Stimulation reagieren, müssen verworfen werden. Das physiologische Mittel, um Dieglutamatfreisetzung aus kortikostriatalen Axonen zu induzieren, ist es, ein Aktionspotenzial auszulösen. Dies kann entweder durch verwendung eines Kanalrhodopsins mit entsprechenden spektralen Eigenschaften oder durch elektrische Stimulation eines Axons erreicht werden, das von iGluu selbst visualisiert wird. Um eine versehentliche Opsin-Aktivierung zu vermeiden, bevorzugten wir die letztere Approastep
    1. Verwenden Sie den Micropipette-Puller (im Vier-Stufen-Modus), um Stimulationspipetten aus Borosilikatglaskapillaren herzustellen. Der Innenspitzendurchmesser sollte ca. 1 m betragen. Wenn der Elektrodenwiderstand mit ACSF gefüllt ist, sollte er etwa 10 Mio. € betragen.
    2. Um die wirkungspotentialabhängige Freisetzung von Glutamat aus einer Reihe synaptischer Boutons zu induzieren, die an demselben Axon befestigt sind, verwenden Sie 63-fache Vergrößerung, den 510 nm-Emissionsfilter und das subtrahierte Bild, um eine Glasstimulationselektrode neben eine fluoreszierende Varikosität zu platzieren. . Vermeiden Sie die Nähe von zusätzlichen Axonen.
    3. Schalten Sie den Stimulator ein, um depolarisierende Stromimpulse an die Stimulationspipette zu liefern. Verwenden Sie die Stromintensitäten um 2 A (nicht mehr als 10 A).
    4. Schalten Sie das Mehrkanal-Bad-Anwendungssystem ein, bei dem ein Kanal die Standard-Badlösung liefert und die anderen Kanäle die notwendigen Blocker von Ionenkanälen, Transportern oder Membranrezeptoren liefern. Steuern Sie den Durchfluss an der Aufnahmestelle und wechseln Sie dann auf den Tetrodotoxinkanal (TTX) (Badlösung plus 1 M TTX). Nach 2:3 min, stimulieren Sie den Kampf des Interesses wieder, aber jetzt in Ermangelung von Aktion potenzielle Generation. Die Freisetzung erfolgt direkt durch Kalziumzufluss durch spannungsabhängige Kalziumkanäle.
    5. Durch Drehen der Intensitätstaste auf dem Stimulator, passen Sie den Stimulationsstrom an, um Reaktionen zu erhalten, die denen ähnlich sind, die über Aktionspotentiale ausgelöst werden. Typischerweise würde der Stimulationsstrom bei einer Depolarisation um 0,5 ms etwa 6 A betragen.
    6. Für die Grundprüfung der Zubereitung 0,5 mM CdCl2anwenden. Das Vorhandensein dieser Calciumkanalblocker-Glutamatfreisetzung verhindert vollständig die synaptische Glutamatfreisetzung und validiert so die Kalziumabhängigkeit des direkt evozierten Glutamatsignals.
      HINWEIS: Die folgende allgemeine Empfehlung kann dazu beitragen, die Erfolgsrate einzelner Synapsenexperimente im Striatum zu erhöhen. Um glutamaterge synaptische Klemmen mit intakten Trennmaschinen auszuwählen, sollte eine Varikosität: (i) eine glatte spindelartige Form haben; ii) nicht mit einer Axon-Bifurkation in Verbindung gebracht werden; iii) heller sein als andere Strukturen auf dem "gelben Bild"; iv) Wohnen sie im striatalen Neuropil und nicht in den Fasertrakten; v) Wohnen auf einem sehr dünnen Axonzweig; vi) nicht in den tieferen Teilen der Scheibe befinden.

3. Visualisierung von Glutamat Release und Clearance

  1. Aufnahmemodus
    HINWEIS: Nach der Subtraktion der Autofluoreszenz (Schritt 2.2) und einigen ersten Tests zur Reaktionsfähigkeit des Interessenss (Schritt 2.3) kann die Datenerfassung beginnen. Die Reaktionen auf die elektrische Aktivierung der Glutamatfreisetzung von einzelnen Axonklemmen können im Bild direkt beobachtet werden (Abbildung 2), ohne weitere Analysewerkzeuge anzuwenden. Es erwies sich jedoch als sehr praktisch, sofort einige grundlegende Indikatoren der Synapsenleistung zu extrahieren (Abbildung 3). Diese Informationen werden benötigt, um Entscheidungen über den späteren Verlauf des Experiments zu treffen, wie die Auswahl bestimmter Terminaltypen, die schnelle Bewertung von HK-bedingten Veränderungen, die Anzahl und Häufigkeit von Versuchen oder Medikamenten, die mit dem Superfusionssystem angewendet werden sollen. Es könnte auch notwendig sein, sich mit eventuell erscheinenden Artefakten zu beschäftigen. Zunächst werden die Standardeinstellungen für die Datenaufzeichnung beschrieben.
    1. Platzieren Sie den getesteten iGluu-positivenBouton mit Hilfe des Mikroskops XY-Antriebe in der Nähe des Aussichtsfeldzentrums. Beenden Sie die Bildaufnahme mit der Schaltfläche "Erfassung abbrechen". Bestimmen Sie auf dem zuletzt aufgenommenen Bild die XY-Position des ruhenden Bouton-Centers, indem Sie mit der linken Maustaste darauf klicken. Die XY-Koordinaten des eingestellten Cursors werden im unteren Statusbereich des Erfassungsfensters angezeigt.
    2. Berechnen Sie anhand der Kalibrierdaten (Schritt 2.1.6) die Koordinaten des Ortes, an dem der Laserstrahl zur Anregung der iGluu Fluoreszenz gesendet werden soll. Verwenden Sie die folgenden Gleichungen: X Laser = X Kamera * X-Faktor + X-Offset, Y-Laser = Y-Offset – Y-Kamera * Y-Faktor. Achten Sie bei dieser Neuberechnung auf die vertikalen oder horizontalen Flip-Einstellungen der Kamera.
    3. Erstellen Sie eine Ein-Punkt-Sequenz in der Lasersteuerungssoftware mit den berechneten Koordinaten. Wählen Sie zu diesem Zweck Punkt im Feld Zur Sequenz hinzufügen auf der Sequenzseite der Lasersteuerungssoftware aus. Wählen Sie 10 s für die Verzögerung zum Auslösen des Beginns und 180 ms für die Laserpulszeit aus. Bewegen Sie die Maus zu den berechneten Koordinaten und klicken Sie auf die linke Schaltfläche.
    4. Wählen Sie die folgenden Einstellungen in der Lasersteuerungssoftware: Läuft: 0, Ausführungsverzögerung: 0, Sequenz: Ausführen bei TTL. Klicken Sie dann auf Sequenz starten.
    5. Wählen Sie in der Kamerasteuerungssoftware die folgenden Einstellungen aus: Auf der Seite Binning/ROI, setzen Sie Bildbereich: Custom, Pixel Binning: 2x2, Höhe: 20, Breite: 20, Links: X-Koordinate des ruhenden iGluu-positiven Punkts minus 10 px, Unten: Y-Koordinate des ruhenden iGluu-positiven Spots minus 10 px, Erfassungsmodus: Kinetic Series Länge: 400, Belichtungszeit: 0.0003744s (Minimalwert). Bei solchen Einstellungen beträgt die Erfassungsrate 2,48 kHz.
    6. Wählen Sie Trigger-Modus: Extern. Klicken Sie auf Signal in der Kamerasteuerungssoftware aufnehmen. Initiieren Sie das für das Triggergerät festgelegte Versuchsprotokoll.
    7. Implementieren Sie das Experimentelle Protokoll Trial mit folgender Zeitlinie: 0 ms – Versuch starten, 1 ms – Laserbeleuchtung starten, 20 ms – Bildaufnahme mit Kamera starten, 70 ms – elektrische Stimulation 1, 120 starten – elektrische Stimulation 2, 181 ms starten – Endversuch (Laser und Kamera aus). So erfasst die Kamera während eines Versuchs 400 Bilder mit einer Frequenz von 2,48 kHz. Siehe Schritte 2.3.3 und 2.3.5. für Details zur elektrischen Stimulation.
    8. Um eine ausreichende Wiederherstellung von präsynaptischen Vesikelbecken zu ermöglichen, wenden Sie das Protokoll Trial mit einer Wiederholungsfrequenz von 0,1 Hz oder niedriger an.
  2. Off-Line-Konstruktion des Glutamattransienten und schnelles Abschätzen der Glutamatfreisetzung und -freigabe zur Identifizierung pathologischer Synapsen
    1. Schalten Sie die Auswertungsroutinen ein. Hier verwenden wir eine hauseigene Software SynBout v. 3.2. (Autor: Anton Dvorzhak). Die folgenden Schritte sind erforderlich, um aus den Pixeln mit erhöhter iGlu u Fluoreszenz wie im Video von Abbildung 2einen Transienten mit erhöhter iGluu Fluoreszenz zu konstruieren.
    2. Um die Bouton-Größe zu bestimmen, berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung (SD) der ROI-Fluoreszenzintensität im Ruhezustand (F) vor Beginn der Stimulation. Bestimmen und boxen Sie den von Pixeln belegten Bereich mit F>mean + 3 SD (Abbildung 3A). Bestimmen Sie einen virtuellen Durchmesser (in m) unter der Annahme einer kreisförmigen Form des überschwelligen Bereichs.
    3. Bestimmen Sie die Differenz zwischen dem Spitzenintensitätswert und F. Zeichnen Sie den stimulierenden Strom und f/F mit der Zeit (Abbildung 3B). Berechnen Sie die SD von F/F im Ruhezustand (vor Beginn der Stimulation) und die "Peak Amplitude". Verwenden Sie Pixel mit Spitzenamplitude mehr als 3 SD von F/F, um monoexponentielle Anpassung für den Zerfall von Peak durchzuführen. Bestimmen Sie die Zeitkonstante des Zerfalls TauD von F/F.
    4. Um die "Maximale Amplitude" an einer bestimmten Synapse zu schätzen, wählen Sie das Pixel mit dem höchsten F/F-Wert aus. Es befindet sich in der Regel innerhalb oder neben den Grenzen des ruhenden Bouton iGluu Fluoreszenz. Die "Maximale Amplitude" wäre der beste Indikator für die Glutamatlast, die der Räummaschine einer einzigen Synapse präsentiert wird.
    5. Um die räumliche Ausdehnung des iGluu-Signals zu schätzen, bestimmen Sie den Durchmesser der Fläche aller überschwelligen Pixel, die zu einem virtuellen Kreis kombiniert werden. Der jeweilige Durchmesser wird "Spread" genannt. Der Begriff "Peak spread" bezieht sich dann auf den Spitzenwert des gemittelten Spreadtransienten(Abbildung 3C, Differenz zwischen gepunkteten roten Linien).
  3. Korrekturen für mögliche Artefakte
    HINWEIS: Die elektrische Depolarisation ist mit einem Abfluss der Intrapipettenlösung verbunden. Dies kann zu einer kleinen Gewebeverschiebung führen. Um zwischen stimulationsinduzierten Veränderungen von iGluu und A-Fokus-Verschiebungen des Bildes zu unterscheiden, könnte man den folgenden Ansatz verwenden, um Verschiebungsartefakte zu identifizieren und zu beseitigen (Abbildung 4).
    1. Analysieren Sie die räumlichen Eigenschaften der suprathreshold-Pixel, die von einem ROI mit Verschiebungszeichen abgeleitet werden (Abbildung 4F–H).
    2. Suchen Sie Pixel außerhalb der ursprünglich festgelegten Grenzen des Boutons im Ruhezustand(Abbildung 4F-H, rot geschachtelt).
    3. Identifizieren Sie eventuell vorhandene negative Pixelintensitätswerte (Abbildung 4I, J). Als Artefakt sollte jede F/F in negativer Richtung mit einer Amplitude betrachtet werden, die größer ist als der Vorstimulationsmittel wert 3 SD, und der Datensatz sollte verworfen werden.
    4. Um nicht fokussierte Artefakte zu vermeiden, legen Sie die Stimulationselektrode auf die antero-laterale Seite des synaptischen Boutons, verwenden Sie biphasische elektrische Stimulation und minimieren Sie die Stimulationsintensität/-dauer.
      HINWEIS: Out-of-Fokus-Artefakte können auch von der Kamera abgeleitet werden. Wenn letzteres nicht optimal am Mikroskop befestigt ist, kann es Schwingungen erzeugen, wahrscheinlich aufgrund kleiner Vibrationen des Kamerakühlsystems. Solche Schwingungen erzeugen ein "Yin- und Yang"-Muster in den Mitbildern von F/F, die sich mit einer Frequenz von 50 Hz drehen. Die Schwingungen können mathematisch vom Fluoreszenzsignal abgezogen werden, aber die endgültige Qualität der Messungen würde dann entscheidend von der Aufnahmezeit abhängen.
    5. Befestigen Sie die Kamera am Mikroskop, so dass Vibrationen fehlen. Wenn letztere übrig bleiben, legen Sie eine Gummidichtung zwischen die Kamera und den Mikroskopadapter.
      HINWEIS: Man darf nicht die Möglichkeit vernachlässigen, dass das striatale Neuropil um die Synapse von Interesse glutamaterische Varikositäten enthält, die iGluu nicht ausdrücken und daher unsichtbar bleiben. Im Falle ihrer Koaktivierung (wahrscheinlicher in Abwesenheit von TTX) könnten die Transienten, die aus den Interessenshohnen gewonnen werden, durch Spill-over beeinflusst werden. Dasselbe gilt füruiGlu u-Ausdrucksterminals, die nicht in den Fokus gerückt waren. Ein charakteristisches Phänomen wäre in diesem Fall, dass Fluoreszenztransienten aus einem viel größeren Gebiet stammen. Da diese Reaktion durch TTX eliminiert wird, kann man sie als unspezifische Reaktion interpretieren, die durch ungerechtfertigte Multifaseraktivierung induziert wird.
    6. Um diese unspezifische Multifaserantwort zu korrigieren, befolgen Sie das in Abbildung 5beschriebene Verfahren . Verwenden Sie das Fluoreszenzsignal von Pixeln an den Ansichtsfeldgrenzen. Um die Hintergrundreaktion zu minimieren, minimieren Sie Stimulationsintensität und -dauer oder verwenden Sie TTX.

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Ergebnisse

Identifizierung von zwei Arten von korticostriatalen glutamatergen Enkotheken
IT- und PT-Afferenten stammen aus den Schichten 2/3 bzw. 5 und weisen unterschiedliche Verzweigungs- und Abschlussmuster im ipsilateralen und kontralateralen (nur IT-Terminals) Striatum auf. Über die Eigenschaften der Glutamatfreisetzung und -freigabe unter sich wiederholenden Aktivierungsbedingungen, wie sie bei der Einleitung von Bewegungen beobachtet wurden, ist noch wenig bekannt, aber es ist gut dokumentiert, dass sich...

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Diskussion

Die Experimente betreffen eine Frage von allgemeinem Interesse – Synapsenunabhängigkeit und deren möglicher Verlust im Verlauf der Neurodegeneration, und wir beschreiben einen neuen Ansatz zur Identifizierung betroffener Synapsen in akuten Hirnscheiben von gealterten (>1 Jahr) Mäusen. Unter Ausnutzung der verbesserten kinetischen Eigenschaften des kürzlich eingeführten Glutamatsensors iGluu beleuchten die Experimente die Beziehung zwischen synaptischer Glutamatfreisetzung und Aufnahme auf eine Weise, di...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von CHDI (A-12467), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Exc 257/1 und DFG-Projekt-ID 327654276 – SFB 1315) und den intramuraischen Forschungsfonds der Charité unterstützt. Wir danken K. Török, St. George es, University of London, und N. Helassa, University of Liverpool, für das iGluu Plasmid und viele hilfreiche Diskussionen. D. Betances und A. Schönherr leisteten hervorragende technische Unterstützung.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Stereo microsopeWPIPZMIIIPrecision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frameStoelting51500DDigital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipmentStoelting514439VForedom K1070 cromoter Kit
Injection systemStoelting53311Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µlHamilton8793075RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning systemRapp OptoElectronicUGA-40UGA-40
Blue laser for iGluu excitationRapp OptoElectronicDL-473-020-S473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nmRapp OptoElectronicROE TB-355-405-473Dichroic
1P upright microscopeCarl Zeiss000000-1066-600Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0Carl Zeiss421480-9900W Plan-Apochromat
4x objectiveCarl Zeiss44-00-20Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluuOmega opticalXF2030
Emission filter for iGluuOmega opticalXF3086
Dichroic mirrorOmega opticalQMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr.Omega opticalQMAX EM600-650
sCMOS cameraAndorZYLA4.2PCL10ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition softwareAndor4.30.30034.0Solis
AD/DA converterHEKA Elektronik895035InstruTECH LIH8+8
Aquisition softwareHEKA Elektronik895153TIDA5.25
Electrode positioning systemSutter InstrumentMPC-200Micromanipulator
Electrical stimulatorCharite workshopsSTIM-26
SlicerLeicaVT1200 SVibrotome
Brown/Flaming-type pullerSutter InstrSU-P1000P-1000
Glass tubes for injection pipettesWPI1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettesWPIR100-F3
TetrodotoxinAbcamab120054TTX
iGluu plasmidAddgene106122pCI-syn-iGluu
Q175 miceJackson Lab27410Z-Q175-KI

Referenzen

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