JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Erişkin farelerden gelen akut dilimlerde tek kortikostatal glutamaterjik sinapslarda glutamat salınımı ile açıklık arasındaki dengeyi değerlendirmek için bir protokol sıyoruz. Bu protokol glutamat tespiti için floresan sensör iGluu, sinyal alımı için bir sCMOS kamera ve odak lazer aydınlatma için bir cihaz kullanır.

Özet

Sinapslar, birbirleri üzerinde bağımsız olarak çalışan son derece bölümlere ayrılmış fonksiyonel birimlerdir. Huntington hastalığı (HD) ve diğer nörodejeneratif bozukluklar, bu bağımsızlık yetersiz glutamat temizliği ve ortaya çıkan dökülme ve dökülme etkileri nedeniyle tehlikeye olabilir. Presinaptik terminallerin ve/veya dendritik dikenlerin değiştirilmiş astrositik kapsamı nın yanı sıra glutamat salınım bölgelerindeki glutamat taşıyıcı kümelerinin küçültülmesi dis-/hiperkinezi semptomlarına yol gösteren hastalıkların patogenezinde de yer almıştır. Ancak HD'de glutamaterjik sinapsların disfonksiyonuna yol açan mekanizmalar iyi anlaşılamamıştır. Sinaps görüntülemenin iyileştirilmesi ve uygulanması, hareketlerin başlatılmasını engelleyen mekanizmalara yeni Bir ışık yayan veriler elde ettik. Burada, yeni genetik olarak kodlanmış ultra hızlı glutamat sensörü iGluu,geniş alan optik, bilimsel CMOS (sCMOS) kamera, 473 nm lazer ve lazer konumlandırma sistemi kullanarak tek sinaps çözünürlüğü elde etmek için nispeten ucuz bir yaklaşımın temel unsurları nı açıklıyoruz. Glutamat geçici leri, perisynaptic [Glu]'nun çürüme (TauD) zaman sabitinde yansıtıldığı gibi, aktif bölge ve ii) glutamat alımının yanındaki glutamat konsantrasyonunun maksimal yüksekliğine (Glu] dayalı olarak, tek veya birden fazla pikselden i) glutamat salınımı tahminlerini elde etmek için oluşturulmuştur. Dinlendirme bouton boyutundaki farklılıklar ve kısa süreli plastisitenin zıt desenleri, kortikotonsefalik (BT) veya piramidal yol (PT) yoluna ait olarak kortikokostatal terminallerin tanımlanmasında ölçüt görevi görür. Bu yöntemleri kullanarak, pt tipi kortikozorsial sinapsların ~%40'ında semptomatik HD farelerde yetersiz glutamat açıklığı sergilenerek bu sinapsların eksitotoksik hasar riski altında olabileceğini keşfettik. Sonuçlar, hipokinetik fenotipli Huntington farelerinde işlevsiz sinapsların biyomarkeri olarak TauD'un yararlılığının altını çizer.

Giriş

Bir "üniter bağlantı" ait her sinaptik terminalin göreceli etkisi (yani, 2 sinir hücreleri arasındaki bağlantı) genellikle postsinaptik nöron ilk segmenti üzerindeki etkisi ile değerlendirilir1,2. Postsinaptik nöronlardan somatik ve / veya dendritik kayıtları en yaygın temsil ve, şimdiye kadar, aynı zamanda en verimli bir yukarıdan aşağıya veya dikey perspektif 3 altında bilgi işleme açıklığa kavuşturmak için anlamına gelir3,4,5. Ancak, kendi ayrık ve (kemirgenler) örtüşen olmayan toprakları ile astrositlerin varlığı sinyal değişimi, entegrasyon ve sinaptik sitelerde senkronizasyon yerel mekanizmalar dayalı yatay bir perspektif katkıda bulunabilir6,7,8,9,10.

Astroglia oyun olduğu bilinmektedir çünkü, genel olarak, nörodejeneratif hastalık patogenezinde önemli bir rol11,12 ve, özellikle, bakım ve glutamaterjik sinapsların plastisite bir rol13,14,15,16, bu sinaptik performans değişiklikleri çeşitli lif ile aksesuar lif ortak hedef alanında astrosit durumuna uygun olarak gelişmeye düşünülebilir. Sağlık ve hastalıkta hedef/astroglia kaynaklı yerel düzenleyici mekanizmaları daha fazla araştırmak için, bireysel sinapsların değerlendirilmesi gerekmektedir. Mevcut yaklaşım, fonksiyonel glutamat salınımı ve açıklık göstergelerinin aralığını tahmin etmek ve hareket başlatmaile en yakından ilişkili beyin bölgelerindeki işlevsiz (veya iyileşmiş) sinapsları tanımlamak için kullanılabilecek kriterleri tanımlamak için çalışılmıştır (yani, her şeyden önce motor korteks ve dorsal striatumda).

Striatum içsel glutamaterjik nöronlar yoksun. Bu nedenle, ekstrastriatal kökenli glutamaterjik afferents belirlemek nispeten kolaydır. İkincisi çoğunlukla medial talamus ve serebral korteks kökenli(bkz. 17,18,19,20 daha fazlası için). Kortikotoriatal sinapslar kortikal tabakalarda lokalize piramidal nöronların aksonlar tarafından oluşur 2/3 ve 5. İlgili aksonlar, piramidal yolu (PT) oluşturan bir lif sistemi aracılığıyla ikili intra-telensefalik (IT) bağlantıları veya ipsilateral bağlantılar oluştururlar. Ayrıca BT ve PT tipi terminallerin sürüm özellikleri ve boyutu21,22farklı olduğu ileri sürülmüştür. Bu veriler göz önüne alındığında, bir de glutamat kullanımı bazı farklılıklar bekleyebilirsiniz.

Striatum Huntington hastalığı en çok etkilenen beyin alanıdır (HD)5. İnsan HD ciddi bir genetik kalıtsal nörodejeneratif bozukluktur. Q175 fare modeli HD hipokinetik-sert formu hücresel temelini araştırmak için bir fırsat sunuyor, parkinsonizm ile çok ortak bir devlet. Yaklaşık 1 yaşında başlayan, homozigot Q175 fareler (HOM) hipokinezya belirtileri sergiler, açık bir alanda hareket olmadan harcanan zaman ölçerek ortaya23. Heterozigot Q175 fareler (HET) ile mevcut deneyler HOM gözlenen önceki motor açıkları doğruladı ve ek olarak, gözlenen motor açıkları astrositik eksitatif amino asit taşıyıcı 2 protein (EAAT2) kortikostrital sinaptik terminalleri yakın çevresinde azaltılmış bir düzeyde eşlik ettiğini gösterdi24. Bu nedenle astrositik glutamat alımı bir açığı disfonksiyon ya da ilgili sinapsların bile kaybına yol açabilir hipotez olmuştur25,26.

Burada, serbest nörotransmitter miktarına göre tek sinaps glutamat açıklık değerlendirmek için izin veren yeni bir yaklaşım açıklar. Yeni glutamat sensörü iGluu kortikostal piramidal nöronlarda ifade edildi. Katalin Török27 tarafından geliştirilen ve daha önce tanıtılan yüksek yakınlık ama yavaş glutamat sensörü iGluSnFR28bir değişiklik temsil eder. Her iki sensör de gelişmiş yeşil floresan proteinin (EGFP) türevleridir. Spektral ve kinetik özellikler için helassa ve ark.27'yebakınız. Kısaca, iGluu hızlı de-aktivasyon kinetik ile düşük afinite sensörü ve bu nedenle özellikle iyi glutamat serbest sinaptik terminallerde glutamat açıklık çalışmak için uygundur. iGluu'nun dissosilasyon süresi sabiti, 20 °C'de tau'yu 2,1 ms, 34 °C27sıcaklıkta tahmin edildiğinde 0,68 ms'lik bir değere sahip bir durmuş akış cihazında belirlenmiştir.off 2-foton mikroskop altında organotipik hipokampal kültürlerin CA1 bölgesinde spiral lazer taraması ile 34 °C'de incelenen tek Schaffer teminat terminalleri, ortalama 2,7 ms'lik bir çürüme süresi sergiledi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm çalışmalar hayvan deneyleri için 2010/63/EU AB Direktifi uyarınca yürütülmüş ve Berlin Sağlık Koruma ve Teknik Güvenlik Ofisi'ne (G0233/14 ve G0218/17) kaydedilmiştir.

NOT: Q175 wild tipi (WT) ve heterozigot (HET) kayıtları her yaşta ve cinsiyette yapılabilir. Burada 51-76 haftalık kendleri ve erkekleri inceledik.

1. Corticostriatal Aksonların Ekspresyonu için Glutamat Sensörü iGluu Enjeksiyonu

  1. Virüsün enjeksiyonu için borosilikat cam pipetler hazırlamak için pipet çekmece (bir adım modu) kullanın. Çektikten sonra, 30-50 μm. Otoklav pipet ve cerrahi aletleri, kafatası açmak için matkap da dahil olmak üzere bir uç çapı elde etmek için manuel pipet kırın.
  2. Virüs AAV9-CaMKIIa.iGluusaklayın. WPRE-hGH (7.5 x 1013gc/mL) -80 °C'de 10 μL aliquots. Enjeksiyonlar virüs üretiminden kısa bir süre sonra (6 ay içinde) yapılırsa, 5 °C'de tutun. Ameliyattan önce, şişe çıkarmak ve oda sıcaklığında korumak.
  3. Cam pipet doldurun ve herhangi bir kabarcıklar kaldırın.
  4. 87.5 mg/kg ketamin ve 12.5 mg/kg ksilazin içeren bir çözeltiintraperitoneal enjeksiyon ile hayvan anestezi. Subkutan ek ağrı kesici için% 0.25 bupivacain (8 mg / kg) enjekte. Kas tonusu izleyerek ve ağrıya bağlı reflekslerin yokluğunu gözlemleyerek anestezinin derinliğini kontrol edin.
  5. Kafada deri tıraş ve% 70 alkol ile sterilize. Fareyi stereotaksik çerçeveye sığdırın.
  6. Motoru korteks üzerinde kemik 1.2 mm delik yapmak için deri ve yüksek hızlı (38.000 rpm) matkap kaldırmak için bir neşter kullanın.
  7. Şırıngayı hassas bir manipülatörün tutucuya bağlı enjeksiyon pipetiyle monte edin. Dikey olarak yönlendirilmiş pipeti 4 farklı noktada kortekse takın. Enjeksiyon koordinatları bregma (mm): anterior 1.5, lateral 1.56, 1.8, 2.04, 2.28 ile ilgilidir. Dura mater ile ilgili derinlik (mm): 1.5-1.7' dir.
  8. Enjeksiyon sistemini kullanarak, seyreltilmemiş virüs çözeltisinin her yerine 0,05 μL/dk hız ile 0,3 μL enjekte edin. Her enjeksiyondan sonra pipeti yavaşça (1 mm/dak) çekmeden önce 1 dk bekletin.
  9. Bir naylon dikiş ile cerrahi yara kapatarak bitirin.
  10. Fareyi orijinal kafesine geri vermeden önce temiz bir kafesteki Bir ısıtma yastığında 0,5 ila 1 saat bekletin.
  11. Akut beyin dilimleri nin hazırlanmasından önce 6 ila 8 hafta boyunca 12 saat gündüz-gece döngüsünde fareyi koruyun.
    NOT: Hücre hasarı ve sinaps kaybına yol açacak bağışıklık reaksiyonlarını önlemek için, birden fazla viral yapının enjeksiyonu aynı anda veya primer enjeksiyondan 2-3 saat sonra yapılmalıdır. Paxinos ve Franklin29 beyin atlasına göre iGluu enjeksiyonun koordinatları seçilmiştir. M1 motor korteksine karşılık gelir. Enjekte edilen beyinlerin immünostaining ipsi çok sayıda ama çoğunlukla iyi izole akson ve akson varisleri görselleştirilmiş- ve kontralateral striatum ve kontralateral M1 ve S1 kortekslerde.

2. Glutamat Sensör iGlu u Ifade Glutamaterjik Terminaller için aramau

  1. Kalibrasyon modu
    1. Aşağıdaki ayarlarla sCMOS kamerayı ve kamera kontrol yazılımını hazırlayın. Okuma sayfasında belirlediği Piksel okuma oranı: 560 MHz (= en hızlı okuma), Hassasiyet/Dinamik Aralık: bit, Sahte Gürültü Filtresi: Evet, Çakışan Okuma: Evet. Binning/ROI sayfasında Tam ekran'ı seçin.
    2. Bir kapak fişinin altında 5 mg/mL Lucifer Sarı (LY) damlası içeren cam bir kaydırak hazırlayın.
    3. LY slaytını 63x hedefinin altına yerleştirin, lazer deklanşörü açın ve aşağıdaki ayarları kullanarak seri kazanım gerçekleştirin: Piksel Binning: 1x1, Tetik modu: Dahili, Pozlama süresi: Minimal (belirlenecek).
    4. Lazer gücünü 4 μm çapında bir floresan noktası oluşturmak için ayarlayın (görüntü doymuş piksel içermemelidir).
    5. Lazer konumlandırma sisteminin kalibrasyonunu gerçekleştirmek için lazer konumlandırma yazılımında aşağıdaki ayarları seçin: Spot boyutu çapı: 10, Tarama hızı: 43.200 kHz. Sağ paneldeki Görüntü Edinme Başlat düğmesini tıklatın. Çalıştır:0, Gecikmeyi Çalıştır: 0'ı ayarlayın ve Sıra sayfasındaTTL seçeneğini belirleyin. Kalibrasyon sayfasındaki Kalibrasyon düğmesini tıklayın ve lazer kontrol yazılımını satın alma ekranının sol üst köşesinde gösterilen talimatlara göre kalibre edin.
    6. Kurulum kamera ve lazer kontrolü için bağımsız yazılım kullanıyorsa, kamera satın alma penceresinden ekran görüntüleri edinin ve XY koordinatlarının yeniden hesaplanması için lazer kontrol yazılımına gönderin. Yazılım farklı bilgisayarlarda yüklüyse, görüntüyü lazer kontrol yazılımına aktarmak için bir video tutucu kullanın. Lazer kontrol yazılımı XY ölçekleme faktörleri ve uzaklıklar hakkında bilgi gerekir. Bu amaçla, lazer kontrol programının edinme penceresi içinde görüntünün sol üst, alt-sol ve alt-sağ köşelerinin koordinatlarını belirleyin. Ölçekleme faktörlerini aşağıdaki denklemlere göre hesaplayın: X factor = (X alt-sağ – X alt-sol)/2048, X ofset = X alt-sol, Y faktörü = (Y üst-sol – Y alt-sol)/2048, Y ofset = Y alt-sol.
    7. Kalibrasyon yordamının sonunda, 267x460 piksellik dikdörtgen bir ilgi alanı (ROI) oluşturun, ekranın ortasına taşıyın ve Başlat dizisi düğmesini tıklatın.
    8. Aşağıdaki kamera kontrol yazılımı ayarlarına geri dön: Binning: 2x2, Tetik modu: Dış pozlama, Pozlama süresi: Minimal (belirlenecek).
  2. Otomatik floresan düzeltme modu
    NOT: Aktif sinaptik terminallerin ortamında [Glu] dinlenme seviyesi genellikle 100 nM14,30,31,32,33,34'ünaltındadır. Buna göre, glutamat herhangi bir sensör, özellikle iGluu gibi düşük bir yakınlık sensörü sinaptik glutamat salınımı yokluğunda oldukça loş olacaktır. Yine de, bazı iGluu floresan bile istirahat tespit edilebilir, ancak doku otofloresan ayırt edilmelidir. 473 nm aydınlatma hem iGluu floresan ve otofloresans ortaya çıkarır (Şekil 1A-C). IGluu floresan480-580 nm (maksimum 510 nm ile) ile sınırlı iken ikinci dalga boyları geniş bir yelpazede kaplar. Otomatik floresan için düzeltme, farklı yüksek geçişli filtrelere sahip iki görüntünün edinimi üzerine kuruludur.
    1. Başka bir yerde açıklandığı gibi önceden beyin dilimleri hazırlayın35. Kepekli dilimleri hazır tutun.
    2. Dilimleri kayıt odasına aktarın, 125 mM NaCl içeren oksijenli yapay beyin omurilik sıvısına (ACSF) batırın, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4,25 mM NaHCO3,2 mM CaCl2,1 mM MgCl2,10 mM glukoz (pH 7.3, 303 mOsm/L), 0.5 mM sodyum piruvat, 2.8 mM sodyum ascorbate ve 0.005 mM glutathione ile desteklenir. 1-2 mL/dk akış hızı kullanın. Banyo sıcaklığını 28-30 °C'de tutun.
    3. 20x su daldırma hedefi altında dorsal striatum bulun. Doku hareketini en aza indirmek için bir platin arp üzerinde bir naylon ızgara ile dilimleri düzeltin. 63x /NA 1.0 su daldırma hedefine geçin. 473 nm (dikroik ayna) ve dalga boylarında geçen ışığı yansıtan filtreleri seçin >510 nm (emisyon filtresi).
    4. İlgili kontrol yazılımı ile bir AD/DA panosu kullanarak aydınlatma, uyarım ve görüntü edinimi senkronize edin. 180 ms lazer pozlama süresi ve 160 ms bir görüntü edinme süresi ile edinme kontrol etmek için tetik programı ayarlayın. Scanning velocity Spot size
    5. 510 nm ("sarı görüntü") yüksek geçiş filtresi kullanarak hem otofloresans hem de iGluu-pozitifyapıların görüntüsünü edinin.
    6. 600 nm 'de ("kırmızı görüntü") yüksek geçişli filtre kullanarak tek başına otomatik floresan içeren bir görüntü elde edin.
    7. Aralığı tanımlamak için en parlak 10 ve en koyu 10 pikselin ortalama yoğunluklarını kullanarak kırmızı ve sarı görüntüleri ölçeklendirin. "Sarı eksi kırmızı görüntü" çıkarma gerçekleştirin ve çıkarbouton uygun görselleştirme için standart bir 8-bit tif dosyası oluşturmak için çıkarılan görüntü yeniden ölçeklendirme (Şekil 1D). IGluu-pozitifyapılardan parlak pikseller, arka plandan gri pikseller ve otofloresanlı yapılardan koyu pikseller içerir.
      NOT: Verilen ekipmanla ortalama dinlenme floresan (F) 700 A.U.'nun altında olacaktır.
  3. Bouton arama modu
    NOT: iGluu-pozitifpikseller aksonal ağacın işlevsel olarak farklı elemanlarına ait olabilir, farklı sırayla akson dalları gibi, çatallanma siteleri, vezikül tükenmesi veya tamamen aktif varisler sonra varisler. Ancak, fonksiyonel sinaptik terminalleri sadece görsel inceleme ile tanımlamak neredeyse imkansızdır. Bu nedenle, her glutamaterjik sinaptik terminal elektrikde depolarizasyona yanıt verme ile tanımlanması gerekir. Uyarıma yanıt vermeyen sitelerin atılması gerekir. Kortikotonial aksonlardan glutamat salınımını tetiklemenin fizyolojik yolu bir eylem potansiyeli ortaya çıkarmaktır. Bu ya uygun spektral özellikleri bir kanal rodopsin kullanılarak ya da iGluu kendisi tarafından görselleştirilmiş bir akson elektriksel stimülasyon ile elde edilebilir. Kazara opsin aktivasyonu önlemek için, ikinci approastep tercih
    1. Borosilikat cam kılcal damarlardan stimülasyon pipetleri üretmek için mikropipet çekmecesini (dört aşamalı modda) kullanın. İç uç çapı yaklaşık 1 μm olmalıdır. ACSF ile doldurulduğunda elektrot direnci yaklaşık 10 MΩ olmalıdır.
    2. Aynı akson bağlı sinaptik boutons bir dizi glutamat eylem potansiyel bağımlı serbest indüklemek için, 63x büyütme, 510 nm emisyon filtresi ve çıkarılmış görüntü bir floresan varis yanında bir cam stimülasyon elektrot yerleştirmek için kullanın . Ek aksonların yakınlığından kaçının.
    3. Stimülasyon pipetine depolarize akım darbeleri sunmak için uyarıcıyı açın. 2 μA (en fazla 10 μA) civarında akım yoğunlukları kullanın.
    4. Bir kanalın standart banyo solüsyonu, diğer kanalların ise iyon kanalları, taşıyıcılar veya membran reseptörlerinin gerekli blokerlerini sunduğu çok kanallı banyo uygulama sistemini açın. Kayıt yerindeki akışı kontrol edin ve tetrodotoksin (TTX) kanalına (banyo çözeltisi artı 1 μM TTX) geçin. 2-3 dakika sonra, tekrar ilgi bouton teşvik, ama şimdi eylem potansiyel nesil yokluğunda. Serbest doğrudan voltaj bağlı kalsiyum kanalları aracılığıyla kalsiyum akını kaynaklanmaktadır.
    5. Uyarıcının yoğunluk anahtarını çevirerek, uyarım akımını ayarlayarak eylem potansiyelleri yoluyla ortaya çıkanlara benzer yanıtlar elde edin. Tipik olarak, stimülasyon akımı 0.5 ms depolarizasyon için 6 μA civarında olacaktır.
    6. Hazırlık temel test için, 0,5 mM CdCl2uygulayın. Bu kalsiyum kanal blokerinin glutamat salınımının varlığı sinaptik glutamat salınımını tamamen önler ve böylece doğrudan uyarılmış glutamat sinyalinin kalsiyum bağımlılığını doğrular.
      NOT: Aşağıdaki genel öneri, striatumdaki tek sinaps deneylerinin başarı oranını artırmaya yardımcı olabilir. Bozulmamış salınım makineleri ile glutamaterjik sinaptik terminalleri seçmek için, bir varis olmalıdır: (i) Pürüzsüz bir mil benzeri bir şekle sahip; (ii) Bir akson çatallanma ile ilişkili değil; (iii) "Sarı görüntü" üzerindeki diğer yapılara göre daha parlak olun; (iv) Lif yollarında değil, striatal nöropilde ikamet; (v) Çok ince bir akson dalı üzerinde ikamet; (vi) Dilimin daha derin kısımlarında ikamet etmez.

3. Glutamat Salınımı ve Temizliğinin Görselleştirilmesi

  1. Kayıt modu
    NOT: Otomatik floresan çıkarma (adım 2.2) ve ilgi bouton (Adım 2.3) yanıt verme için birkaç ilk testler çıkarma sonra, veri toplama başlayabilir. Tek akson terminallerinden glutamat salınımının elektriksel aktivasyonuna verilen yanıtlar, daha fazla analiz aracı uygulanmadan doğrudan görüntüde(Şekil 2)görülebilir. Ancak, sinaps performansının bazı temel göstergelerini hemen ayıklamak çok uygun oldu(Şekil 3). Bu bilgiler, belirli terminal türlerinin seçimi, HD ile ilgili değişikliklerin hızlı değerlendirilmesi, süperfüzyon sistemi ile uygulanacak denemelerin veya ilaçların sayısı ve sıklığı gibi denemenin sonraki seyri hakkında kararlar almak için gereklidir. Ayrıca sonunda görünen eserler ile uğraşmak için gerekli olabilir. İlk olarak, veri kaydı için standart ayarlar açıklanmıştır.
    1. Mikroskop XY sürücüleri kullanarak, test edilmiş iGluu-pozitifbouton'u görüş alanı merkezine yakın bir yere yerleştirin. Abort edinme düğmesi yle görüntü edinimidurdurun. Elde edilen son resimde, sol fare düğmesiyle üzerine tıklayarak dinlenme merkezinin XY konumunu belirleyin. Ayarlanan imlecin XY koordinatları, edinme penceresinin alt durum panelinde gösterilir.
    2. Kalibrasyon verilerini (adım 2.1.6) kullanarak, iGluu floresan uyarma için lazer ışınının gönderilmesi gereken sitenin koordinatlarını hesaplayın. Aşağıdaki denklemleri kullanın: X lazer = X kamera * X faktörü + X ofset, Y lazer = Y ofset – Y kamera * Y faktörü. Bu yeniden hesaplamayı yaparken, kameranın dikey veya yatay çevirme ayarlarına dikkat edin.
    3. Hesaplanan koordinatları kullanarak lazer kontrol yazılımında bir noktalı bir sıra oluşturun. Bunun için, lazer kontrol yazılımının Sıra sayfasındaekle kutusuna Ekle'yi seçin. Gecikmenin başlangıç lı tetiklemi için 10 μ sve ve lazer darbe süresi için 180 ms'i seçin. Fareyi hesaplanan koordinatlara taşıyın ve sol düğmesini tıklatın.
    4. Lazer kontrol yazılımında aşağıdaki ayarları seçin: Çalışır: 0, Run delay: 0, Sıra: TTL çalıştırın. Ardından Başlat dizisinitıklatın.
    5. Kamera kontrol yazılımında, aşağıdaki ayarları seçin: Binning/ROI sayfasında, Resim Alanıayarla : Özel, Piksel Binning: 2x2, Yükseklik: 20, Genişlik: 20, Sol: X-din koordinasyonu iGluu-pozitif nokta eksi 10 px, Alt: Y-koordinat istirahat iGluu-pozitif nokta eksi 10 px, Edinme Modu: Kinetik Serisi, Kinetik Uzunluk Serisi: 400, Zaman : Pozlama 0.0003744s (minimum değer). Bu ayarlarla, satın alma oranı 2,48 kHz olacaktır.
    6. Tetikleme modunuseçin : Harici. Kamera kontrol yazılımında sinyali al'ı tıklatın. Tetikleme aygıtı için belirlenen deneysel protokolü başlatın.
    7. Aşağıdaki zaman çizgisi ile deneysel protokol Deneme uygulayın: 0 ms – deneme başlatmak, 1 ms – lazer aydınlatma başlatmak, 20 ms – kamera ile görüntü edinimi başlatmak, 70 ms – elektrik stimülasyon 1, 120 başlatmak – elektrikstimülasyon başlatmak 2, 181 ms – son deneme (lazer ve kamera kapalı). Böylece, bir deneme sırasında kamera 2.48 kHz frekansı ile 400 kare satın aldı. 2.3.3 ve 2.3.5 adımlarını görün. elektriksel stimülasyon hakkında ayrıntılı bilgi için.
    8. Presinaptik vezikül havuzlarının yeterli şekilde geri kazanılmasına izin vermek için, protokol Denemesini 0,1 Hz veya daha düşük bir tekrarlama sıklığıyla uygulayın.
  2. Patopların geçici ve hızlı değerlendirilmesi ve patolojik sinapsların tanımlanması için glutamat salınımı ve temizliğinin off-line konstrüksiyonu
    1. Değerlendirme rutinlerini açın. Burada SynBout v. 3.2'yi şirket içi yazılı bir yazılım kullanıyoruz. (yazar: Anton Dvorzhak). Şekil 2'ninvideosunda olduğu gibi yüksek iGluu floresanlı piksellerden δF/F geçici bir δf/f geçici oluşturmak için aşağıdaki adımlar gereklidir.
    2. Bouton boyutunu belirlemek için, uyarım başlamadan önce, istirahat (F) roi floresan yoğunluğunun ortalama ve standart sapma (SD) hesaplamak. F>ortalama + 3 SD(Şekil 3A)ile piksellerin kapsanan alanını belirleyin ve kutulayın. Supra eşik alanının dairesel bir biçimini varsayarak sanal çapı (μm olarak) belirleyin.
    3. ΔF'yi en yüksek yoğunluk değeri arasındaki fark olarak belirleyin ve F. Uyarıcı akımı ve ΔF/F'yi zamana göre çizin (Şekil 3B). ΔF/F'nin SD'sini istirahatte (stimülasyon başlamadan önce) ve "Pik genlik" olarak hesaplayın. En yüksek genliğe sahip pikseli kullanarak 3 SD ΔF/F'den daha yüksek olan pikseli kullanarak zirveden çürümeye monoosoneal uyum gerçekleştirin. ΔF/F'nin çürüme TauD zaman sabitini belirleyin.
    4. Belirli bir sinapstaki "Maksimal genlik"i tahmin etmek için en yüksek ΔF/F değerine sahip pikseli seçin. Genellikle dinlenme bouton iGluu floresan sınırları içinde veya yanında yer alır. "Maksimal genlik" tek bir sinaps temizleme makinesi sunulan glutamat yükünün en iyi göstergesi olacaktır.
    5. iGluu sinyalinin uzamsal uzantısını tahmin etmek için, sanal bir daire oluşturmak üzere biraraya gelen tüm eşik sizlik piksellerinin alanının çapını belirleyin. İlgili çapa "Spread" denir. "Tepe yayılımı" terimi daha sonra ortalama yayılan geçici(Şekil 3C, noktalı kırmızı çizgiler arasındaki fark) en yüksek değeri ifade eder.
  3. Olası eserler için düzeltmeler
    NOT: Elektriksel depolarizasyon intra-pipet çözeltisinin dışa doğru akışı ile ilişkilidir. Bu küçük bir doku deplasman neden olabilir. iGluu'nun uyarım kaynaklı değişiklikleri ile görüntünün odak dışı kaymaları arasında ayrım yapmak için, yer değiştirme yapılarını tanımlamak ve ortadan kaldırmak için aşağıdaki yaklaşımı kullanabilirsiniz(Şekil 4).
    1. YG'den elde edilen suprathreshold piksellerinin uzamsal özelliklerini yer değiştirme işaretleriyle analiz edin (Şekil 4F-H).
    2. Bouton'un başlangıçta belirlenen sınırlarının dışında kalan pikselleri bulun(Şekil 4F–H, kırmızı kutulu).
    3. Sonunda varolan negatif piksel yoğunluğu değerlerinitanımlayın( Şekil 4I, J). Pre-stimülasyon ortalaması ± 3 SD'den daha büyük bir genlik ile negatif yöndeki herhangi bir ΔF/F artifakı olarak kabul edilmeli ve kayıt atılmalıdır.
    4. Odak dışı objelerden kaçınmak için stimülasyon elektrodusatını sinaptik boutonun antero-lateral tarafına yerleştirin, bifazik elektriksel stimülasyon kullanın ve stimülasyon yoğunluğunu/süresini en aza indirin.
      NOT: Odak dışı yapılar da kameradan türetilebilir. İkincisi en iyi mikroskoba sabit değilse, büyük olasılıkla kamera soğutma sisteminin küçük titreşimler nedeniyle salınımlar üretebilir. Bu tür titreşimler ΔF/F görüntülerinde 50 Hz frekansı ile dönen bir "yin ve yang" deseni oluşturur. Titreşimler matematiksel olarak floresan sinyalinden çıkarılabilir, ancak ölçümlerin son kalitesi daha sonra kritik kayıt süresine bağlıdır.
    5. Kamerayı titreşimlerin olmaması için mikroskoba sabitle. İkincisi kalırsa, kamera ve mikroskop adaptörü arasına kauçuk bir conta yerleştirin.
      NOT: İlgi sinapsının etrafındaki striatal nöropilin iGluu ifade etmeyen ve bu nedenle görünmez kalan glutamaterjik varisler içerdiği ihtimalini göz ardı etmek mümkün değildir. Onların co-aktivasyonu durumunda (daha büyük olasılıkla TTX yokluğunda) ilgi boutons elde edilen geçici dökülme etkilenebilir. Aynı durum, odak dışında olan iGluu-ifadeterminalleri için de geçerlidir. Karakteristik bir fenomen bu durumda floresan geçici çok daha geniş bir alandan kaynaklanan olacaktır. Bu yanıt TTX tarafından ortadan kaldırıldığından, bunu yersiz çoklu fiber aktivasyonun neden olduğu spesifik olmayan bir yanıt olarak yorumlanabilir.
    6. Bu spesifik olmayan çoklu fiber yanıtı düzeltmek için Şekil 5'teözetlenen yordamı uygulayın. Görüntüleme alanı sınırlarında piksellerin floresan sinyalini kullanın. Arka plan yanıtını en aza indirmek için, uyarım yoğunluğunu ve süresini en aza indirin veya TTX kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Kortikosriatal glutamaterjik varislerin iki tip belirlenmesi
BT ve PT afferents katman 2 /3 ve 5, sırasıyla kaynaklanır ve ipsilateral ve kontralateral (sadece BT terminalleri) striatum diferansiyel sonuçları ve sonlandırma desenleri sergiler. Hala çok az glutamat salınımı ve hareketlerin başlatılması sırasında gözlenen tekrarlayan aktivasyon koşulları altında açıklık özellikleri hakkında bilinmektedir, ama iyi ilgili glutamat serbest varisleri boyutu22f...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Deneyler genel ilgi ile ilgili bir soru - sinaps bağımsızlığı ve nörodejenerasyon seyrinde olası kaybı, ve biz yaşlı (>1 yıl) fareler akut beyin dilimlerietkilenen sinapsları belirlemek için yeni bir yaklaşım açıklar. Son zamanlarda tanıtılan glutamat sensörü iGluu gelişmiş kinetik özellikleri yararlanarak deneyler sinaptik glutamat salınımı ve alımı arasındaki ilişkiyi daha önce mümkün olmamıştır bir şekilde aydınlatmak.

Glutamat temizliğini...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma CHDI (A-12467), Alman Araştırma Vakfı (Exc 257/1 ve DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) ve Charité intramural Araştırma Fonları tarafından desteklenmiştir. K. Török, St. George's, Londra Üniversitesi ve Liverpool Üniversitesi N. Helassa'ya iGluu plazmid ve birçok yararlı tartışma için teşekkür ederiz. D. Betances ve A. Schönherr mükemmel teknik yardım sağladı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Stereo microsopeWPIPZMIIIPrecision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frameStoelting51500DDigital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipmentStoelting514439VForedom K1070 cromoter Kit
Injection systemStoelting53311Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µlHamilton8793075RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning systemRapp OptoElectronicUGA-40UGA-40
Blue laser for iGluu excitationRapp OptoElectronicDL-473-020-S473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nmRapp OptoElectronicROE TB-355-405-473Dichroic
1P upright microscopeCarl Zeiss000000-1066-600Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0Carl Zeiss421480-9900W Plan-Apochromat
4x objectiveCarl Zeiss44-00-20Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluuOmega opticalXF2030
Emission filter for iGluuOmega opticalXF3086
Dichroic mirrorOmega opticalQMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr.Omega opticalQMAX EM600-650
sCMOS cameraAndorZYLA4.2PCL10ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition softwareAndor4.30.30034.0Solis
AD/DA converterHEKA Elektronik895035InstruTECH LIH8+8
Aquisition softwareHEKA Elektronik895153TIDA5.25
Electrode positioning systemSutter InstrumentMPC-200Micromanipulator
Electrical stimulatorCharite workshopsSTIM-26
SlicerLeicaVT1200 SVibrotome
Brown/Flaming-type pullerSutter InstrSU-P1000P-1000
Glass tubes for injection pipettesWPI1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettesWPIR100-F3
TetrodotoxinAbcamab120054TTX
iGluu plasmidAddgene106122pCI-syn-iGluu
Q175 miceJackson Lab27410Z-Q175-KI

Referanslar

  1. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
  2. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
  3. Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56(2018).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
  5. Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington's disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
  6. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
  7. Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
  8. Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554(2018).
  9. Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
  10. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239(2018).
  11. Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
  12. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
  13. Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
  14. Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451(2018).
  15. Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
  16. Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
  17. Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington's disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
  18. Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington's disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
  19. Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson's disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
  20. Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
  21. Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
  22. Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons - dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142(2010).
  23. Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. Neuroscience. 311, 519-538 (2015).
  24. Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
  25. Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington's disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
  26. Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
  27. Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
  28. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
  29. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier. (2003).
  30. Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
  31. Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
  32. Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154(2017).
  33. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
  34. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  35. Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
  36. Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
  37. Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
  38. Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
  39. Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
  40. Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
  41. Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
  42. Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, aO., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
  43. Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
  44. Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19(2019).
  45. Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
  46. Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington's disease mice. Scientific Reports. 9, 6634(2019).
  47. Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414(2019).
  48. Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
  49. Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 157glutamat sal n mglutamat temizli iglutamat yay l mpresinaptik terminalastrositglutamat al mr me kineti id k lmeoptogenetikiGluusCMOS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır