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Résumé

Nous présentons un protocole pour évaluer l’équilibre entre la libération de glutamate et le dégagement aux synapses glutamatergics corticostriatal simples dans des tranches aigues des souris adultes. Ce protocole utilise le capteur fluorescent iGluu pour la détection de glutamate, une caméra sCMOS pour l’acquisition du signal et un dispositif pour l’éclairage laser focal.

Résumé

Les synapses sont des unités fonctionnelles hautement compartimentées qui fonctionnent indépendamment les unes sur les autres. Dans la maladie de Huntington (MH) et d’autres troubles neurodégénératifs, cette indépendance pourrait être compromise en raison de l’élimination insuffisante du glutamate et des effets de déversement et de déversement qui en résultent. La couverture astrocytique altérée des terminaux et/ou des épines dendritiques altérées ainsi qu’une taille réduite des grappes de transport de glutamate aux sites de rejet de glutamate ont été impliquées dans la pathogénie des maladies ayant pour résultat des symptômes de dys-/hyperkinésie. Cependant, les mécanismes menant au dysfonctionnement des synapses glutamatergiques dans la MH ne sont pas bien compris. Améliorer et appliquer l’imagerie synapse, nous avons obtenu des données jetant un nouvel éclairage sur les mécanismes empêchant l’initiation des mouvements. Ici, nous décrivons les principaux éléments d’une approche relativement peu coûteuse pour atteindre une seule résolution synapse en utilisant le nouveau capteur de glutamate ultra-rapide génétiquement codé iGluu, optique à champ large, une caméra scientifique CMOS (sCMOS), un laser de 473 nm et un système de positionnement laser pour évaluer l’état des synapses corticostriatales dans les tranches aigues de souris saines ou malades appropriées de l’âge. Les transitoires de glutamate ont été construites à partir de pixels simples ou multiples pour obtenir des estimations de la libération de glutamate i) basée sur l’élévation maximale de la concentration de glutamate [Glu] à côté de la zone active et ii) l’absorption de glutamate comme reflété dans la constante de temps de décomposition (TauD) du perisynaptique [Glu]. Les différences dans la taille du bouton de repos et les modèles contrastés de plasticité à court terme ont servi de critères pour l’identification des terminaux corticostriatal comme appartenant à la voie intratelencéphalique (IT) ou du tractus pyramidal (PT). En utilisant ces méthodes, nous avons découvert que chez les souris MH symptomatiques - 40% des synapses corticostriatal de type PT présentaient un dégagement insuffisant de glutamate, ce qui suggère que ces synapses pourraient être à risque de dommages excitoxiques. Les résultats soulignent l’utilité du TauD en tant que biomarqueur des synapses dysfonctionnelles chez les souris Huntington avec un phénotype hypokinétique.

Introduction

L’impact relatif de chaque terminal synaptique appartenant à une « connexion unitaire » (c.-à-d. la connexion entre 2 cellules nerveuses) est généralement évalué par son influence sur le segment initial du neurone postynaptique1,2. Les enregistrements somatiques et/ou dendritiques des neurones postsynaptiques représentent les moyens les plus courants et, jusqu’à présent, aussi les moyens les plus productifs de clarifier le traitement de l’information sous une perspective descendante ou verticale3,4,5. Cependant, la présence d’astrocytes avec leurs territoires discrets et (chez les rongeurs) non-overlapping peut contribuer à une perspective horizontale qui est basée sur les mécanismes locaux d’échange de signaux, d’intégration et de synchronisation aux sites synaptiques6,7,8,9,10.

Parce qu’on sait que les astroglias jouent, en général, un rôle majeur dans la pathogénie de la maladie neurodégénérative11,12 et, en particulier, un rôle dans l’entretien et la plasticité des synapses glutamatergiques13,14,15,16, il est concevable que les modifications de la performance synaptique évoluent en fonction de l’état des astrocytes dans la zone cible partagée des fibres afferentes avec diverses origines. Pour explorer davantage les mécanismes de réglementation locaux dérivés de la cible/astroglia dans la santé et la maladie, il est nécessaire d’évaluer les synapses individuelles. La présente approche a été élaborée pour estimer la gamme d’indicateurs fonctionnels de rejet et de dégagement du glutamate et pour définir des critères qui peuvent être utilisés pour identifier les synapses dysfonctionnelles (ou récupérées) dans les zones du cerveau les plus étroitement liées à l’initiation des mouvements (c.-à-d. tout d’abord dans le cortex moteur et le striatum dorsale).

Le striatum manque de neurones glutamatergiques intrinsèques. Par conséquent, il est relativement facile d’identifier les afferents glutamatergiques d’origine extrastriatale. Ce dernier provient principalement du thalamus médial et du cortex cérébral (voir17,18,19,,20 pour plus). Les synapses corticostriatales sont formées par les axones des neurones pyramidaux localisés dans les couches corticales 2/3 et 5. Les axones respectifs forment des connexions bilatérales intra-télencéphaliques (IT) ou des connexions ipsilateral via un système de fibres qui constitue plus caudally le tractus pyramidal (PT). Il a également été suggéré que les terminaux de type IT et PT diffèrent dans leurs caractéristiques de libération et la taille21,22. Compte tenu de ces données, on pourrait également s’attendre à des différences dans le traitement du glutamate.

Le striatum est la zone du cerveau la plus touchée dans la maladie de Huntington (HD)5. La MH humaine est un trouble neurodégénératif génétiquement héréditaire grave. Le modèle de souris Q175 offre l’occasion d’étudier la base cellulaire de la forme hypokinétique-rigide de la MH, un état qui a beaucoup en commun avec le parkinsonisme. À partir d’un âge d’environ 1 an, les souris homozygote Q175 (HOM) présentent des signes d’hypokinésie, comme révélé en mesurant le temps passé sans mouvement dans un champ ouvert23. Les expériences actuelles avec des souris hétérozygote Q175 (HET) ont confirmé les déficits moteurs précédents observés dans LE CDM et, en outre, ont montré que les déficits moteurs observés étaient accompagnés d’un niveau réduit du transporteur d’acide aminé excitatoire astrocytique 2 protéine (EAAT2) dans le voisinage immédiat des terminaux synaptiques corticostriatal24. Il a donc été supposé qu’un déficit dans l’absorption astrocytique de glutamate pourrait conduire à un dysfonctionnement ou même à la perte de synapses respectives25,26.

Ici, nous décrivons une nouvelle approche qui permet d’évaluer le dégagement unique de glutamate de synapse par rapport à la quantité du neurotransmetteur libéré. Le nouveau capteur de glutamate iGluu a été exprimé dans les neurones pyramidaux corticostriatal. Il a été développé par Katalin Târôk27 et représente une modification du capteur de glutamate de haute affinité précédemment introduit mais lent iGluSnFR28. Les deux capteurs sont des dérivés de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP). Pour les caractéristiques spectrales et cinétiques, voir Helassa et al.27. En bref, iGluu est un capteur de faible affinité avec une cinétique rapide de désactivation et donc particulièrement bien adapté pour étudier le dégagement de glutamate aux terminaux synaptiques de glutamate-libération. La constante de temps de dissociation d’iGluu a été déterminée dans un dispositif d’arrêt-flux, qui a rendu un Tauhors valeur de 2,1 ms à 20 oC, mais 0,68 ms lorsqu’il est extrapolé à une température de 34 oC27. Les terminaux collatéraux Schaffer simples sondés à 34 oC avec balayage de laser en spirale dans la région de CA1 des cultures hippocampales organotypiques sous un microscope de 2-photon ont montré une constante moyenne de temps de décomposition de 2,7 ms.

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Protocole

Tous les travaux ont été effectués conformément à la directive de l’UE 2010/63/UE pour les expériences animales et ont été enregistrés au Bureau de la protection de la santé et de la sécurité technique de Berlin (G0233/14 et G0218/17).

REMARQUE : Les enregistrements de type sauvage Q175 (WT) et hétérozygotes (HET) peuvent être effectués à tout âge et sexe. Ici, nous avons étudié les hommes et les femmes à un âge de 51 à 76 semaines.

1. Injection du capteur glutamate iGluu pour l’expression dans les axons corticostriatal

  1. Utilisez le puller pipette (mode étape) pour préparer des pipettes en verre borosilicate pour l’injection du virus. Après avoir tiré, casser manuellement la pipette pour obtenir un diamètre de pointe de 30 à 50 m. Autoclave la pipette et les instruments chirurgicaux, y compris la perceuse pour ouvrir le crâne.
  2. Stocker le virus AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 1013gc/mL) à -80 oC en aliquots de 10 L. Si des injections sont effectuées peu de temps après la production du virus (dans les 6 mois), conserver à 5 oC. Avant la chirurgie, sortez la fiole et maintenez-la à température ambiante.
  3. Remplissez la pipette en verre et retirez les bulles.
  4. Anesthésiez l’animal avec une injection intraperitonéale d’une solution contenant 87,5 mg/kg de kétamine et 12,5 mg/kg de xylazine. Injectez sous-cutanée 0,25 % de bupivacain (8 mg/kg) pour soulager davantage la douleur. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en surveillant le tonus musculaire et en observant l’absence de réflexes induits par la douleur.
  5. Raser la peau sur la tête et la stériliser avec 70% d’alcool. Ajuster la souris dans le cadre stéréotaxique.
  6. Utilisez un scalpel pour enlever la peau et une perceuse à grande vitesse (38 000 tr/min) pour faire un trou de 1,2 mm dans l’os au-dessus du cortex moteur.
  7. Monter la seringue avec la pipette d’injection attachée dans le support d’un manipulateur de précision. Insérez la pipette orientée verticalement dans le cortex à 4 sites différents. Les coordonnées d’injection sont, en ce qui concerne le bregma (en mm): antérieur 1,5, latéral 1,56, 1,8, 2,04, 2,28. La profondeur par rapport au dura mater est (en mm): 1.5-1.7.
  8. À l’aide du système d’injection, injectez 0,3 l par site de la solution virale non diluée avec une vitesse de 0,05 l/min. Après chaque injection, laisser la pipette en place pendant 1 min avant de la retirer lentement (1 mm/min).
  9. Terminer en fermant la plaie chirurgicale avec une suture en nylon.
  10. Laisser la souris de 0,5 à 1 h sur un coussin chauffant dans une cage propre avant de la retourner dans sa cage d’origine.
  11. Maintenir la souris sur un cycle de 12 h jour-nuit pendant 6 à 8 semaines avant la préparation des tranches cérébrales aigues.
    REMARQUE : Pour éviter les réactions immunitaires entraînant des dommages cellulaires et une perte de synapse, l’injection de plusieurs constructions virales doit être effectuée simultanément ou dans les 2 à 3 heures suivant l’injection primaire. Les coordonnées de l’injectiond’iGlu u ont été sélectionnées selon l’atlas du cerveau Paxinos et Franklin29. Ils correspondent au cortex moteur M1. L’immunostaining des cerveaux injectés a visualisé de nombreux axones mais surtout bien isolés et varicosities d’axone dans le striatum ipsi-et contralateral et dans les cortices contralatéraux M1 et S1.

2. Recherche de terminaux glutamatergiques exprimant le capteur glutamate iGluu

  1. Mode d’étalonnage
    1. Préparez la caméra sCMOS et le logiciel de contrôle de la caméra avec les paramètres suivants. Sur la page Readout set Pixel readout rate: 560 MHz (- lecture la plus rapide), Sensibilité/Gamme dynamique: bit, Spurious Noise Filter: Yes, Overlap Readout: Yes. Sur la page Binning/ROI, sélectionnez Plein écran.
    2. Préparer une glissière en verre contenant une goutte de 5 mg/mL Lucifer Jaune (LY) sous un glissement de couvercle.
    3. Placez la diapositive LY sous un objectif 63x, ouvrez l’obturateur laser et effectuez une acquisition en série en utilisant les réglages suivants : Pixel Binning: 1x1, mode Déclencheur: Interne, Temps d’exposition: Minimal (à déterminer).
    4. Ajuster la puissance laser pour produire une tache de fluorescence de 4 m de diamètre (l’image ne doit pas contenir de pixels saturés).
    5. Pour effectuer un étalonnage du système de positionnement laser, sélectionnez les paramètres suivants dans le logiciel de positionnement laser : diamètre de la taille d’un spot: 10, vitesse de balayage: 43.200 kHz. Cliquez sur le bouton d’acquisition d’images Démarrer sur le panneau droit. Set Runs: 0, Run delay: 0, et sélectionnez l’option Run at TTL sur la page Séquence. Cliquez sur le bouton Calibrate sur la page Calibration et étalonnez le logiciel de commande laser selon les instructions affichées dans le coin supérieur gauche de l’écran d’acquisition.
    6. Si la configuration utilise un logiciel indépendant pour le contrôle de la caméra et du laser, acquérez des captures d’écran de la fenêtre d’acquisition de la caméra et envoyez-la au logiciel de commande laser pour un re-calcul des coordonnées XY. Si le logiciel est installé sur différents ordinateurs, puis utilisez un saisisseur vidéo pour importer l’image dans le logiciel de contrôle laser. Le logiciel de commande laser aura besoin de l’information sur les facteurs de mise à l’échelle XY et les compensations. À cette fin, déterminez les coordonnées des coins supérieurs gauche, en bas et en bas-gauche de l’image dans la fenêtre d’acquisition du programme de commande laser. Calculez les facteurs d’échelle en fonction des équations suivantes : facteur X (X en bas à droite et X en bas à gauche)/2048, décalage X X en bas à gauche, facteur Y (en haut à gauche , Y en bas à gauche)/2048, Y offset - Y en bas à gauche.
    7. À la fin de la procédure d’étalonnage, créez une région d’intérêt rectangulaire (ROI) de 267x460 pixels, déplacez-la au centre de l’écran et cliquez sur le bouton Séquence Démarrer.
    8. Retour aux paramètres suivants du logiciel de contrôle de la caméra : Binning: 2x2, Mode Déclencheur: Exposition externe, Temps d’exposition: Minimal (à déterminer).
  2. Mode de correction de l’autofluorescence
    REMARQUE: Le niveau de repos de [Glu] dans l’environnement des terminaux synaptiques actifs est généralement inférieur à 100 nM14,30,31,32,33,34. En conséquence, tout capteur de glutamate, en particulier un capteur de faible affinité comme iGluu sera plutôt faible en l’absence de libération de glutamate synaptique. Néanmoins, une certaine fluorescence iGluu peut même être détectée au repos, mais doit être distinguée de l’autofluorescence tissulaire. L’éclairage de 473 nm suscite à la fois iGluu fluorescence et autofluorescence(figure 1A-C). Ce dernier occupe un large éventail de longueurs d’onde, tandis que la fluorescence iGluu est limitée à 480-580 nm (avec un maximum à 510 nm). La correction de l’autofluorescence est basée sur l’acquisition de deux images avec différents filtres à passage élevé.
    1. Préparer les tranches de cerveau à l’avance comme décrit ailleurs35. Gardez les tranches de son prêtes.
    2. Transférer les tranches dans la chambre d’enregistrement, les submerger en crérebrospinalfluide artificiel oxygéné (ACSF) contenant 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 m NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 , 10 m de glucose (pH 7, 3 303 mOsm/L), complété par 0,5 mM de pyruvate de sodium, 2,8 mM d’ascorbate de sodium et 0,005 mM glutathion.2 Utilisez un débit de 1 à 2 ml/min. Maintenir la température du bain à 28 à 30 oC.
    3. Localiser le striatum dorsale dans le cadre d’un objectif d’immersion 20x. Fixer les tranches avec une grille de nylon sur une harpe en platine pour minimiser le mouvement des tissus. Passez à l’objectif d’immersion 63x /NA 1.0. Sélectionnez des filtres réfléchissant la lumière à 473 nm (miroir dichroique) et la lumière de passage avec des longueurs d’onde 'gt;510 nm (filtre d’émission).
    4. Synchroniser l’éclairage, la stimulation et l’acquisition d’images à l’aide d’un tableau AD/DA avec le logiciel de contrôle respectif. Définissez le programme de déclenchement pour contrôler l’acquisition avec un temps d’exposition au laser de 180 ms et un temps d’acquisition d’image de 160 ms. Utilisez le dispositif de positionnement laser pour envoyer le faisceau laser à un nombre prédéterminé de points et définir les paramètres pour la vitesse de balayage et la taille de tache.
    5. Acquérir une image de l’autofluorescence et iGluu-structures positives à l’aide d’un filtre à col élevé à 510 nm ("image jaune").
    6. Acquérir une image avec l’autofluorescence seul à l’aide d’un filtre à cols hauts à 600 nm ("image rouge").
    7. Échelle des images rouges et jaunes, en utilisant les intensités moyennes des 10 pixels les plus brillants et les 10 pixels les plus foncés pour définir la gamme. Effectuez une soustraction « jaune moins image rouge » et réaménagez l’image soustraite pour générer un fichier standard 8 bits tif pour une visualisation pratique du bouton d’intérêt(figure 1D). Il contient les pixels lumineuxudes structures iGlu u-positives, des pixels gris de l’arrière-plan et des pixels sombres des structures à l’autofluorescence.
      REMARQUE : Avec l’équipement donné, la fluorescence moyenne au repos (F) sera inférieure à 700 A.U.
  3. Mode de recherche Bouton
    REMARQUE : les pixels iGluu-positifspeuvent appartenir à des éléments fonctionnellement différents de l’arbre axonal, tels que des branches d’axone de différents ordre, des sites de bifurcation, des varices après l’épuisement vésicle ou des varices entièrement actives. Cependant, il est presque impossible d’identifier les terminaux synaptiques fonctionnels simplement par inspection visuelle. Par conséquent, chaque terminal synaptique glutamatergique a besoin d’identification par sa réactivité à la dépolarisation électrique. Les sites qui ne répondent pas à la stimulation doivent être jetés. Les moyens physiologiques d’induire la libération de glutamate des axones corticostriatal est d’obtenir un potentiel d’action. Ceci peut être réalisé soit en utilisant un canal rhodopsin de caractéristiques spectrales appropriées ou par stimulation électrique d’un axone visualisé par iGluu lui-même. Pour éviter l’activation accidentelle de l’opsine, nous avons préféré ce dernier
    1. Utilisez le puller de micropipette (en mode quatre étapes) pour produire des pipettes de stimulation à partir de capillaires en verre borosilicate. Le diamètre interne de la pointe doit être d’environ 1 m. Lorsqu’elle est remplie d’ACSF, la résistance aux électrodes doit être d’environ 10 M.
    2. Pour induire la libération potentielle de glutamate d’un ensemble de boutons synaptiques attachés au même axon, utilisez le grossissement 63x, le filtre d’émission de 510 nm et l’image soustraite pour placer une électrode de stimulation de verre à côté d’une varice fluorescente . Évitez la proximité d’axones supplémentaires.
    3. Allumez le stimulateur pour délivrer des impulsions de courant dépolarisantes à la pipette de stimulation. Utilisez des intensités actuelles autour de 2 A (pas plus de 10 a).
    4. Activez le système d’application de bain multicanal où un canal offre la solution de bain standard et les autres canaux livrent les bloqueurs nécessaires des canaux ioniques, des transporteurs ou des récepteurs membranaires. Contrôler le flux sur le site de l’enregistrement, puis passer au canal de tétrodotoxine (TTX) (solution de bain plus 1 M TTX). Après 2 à 3 min, stimulez à nouveau le bouton d’intérêt, mais maintenant en l’absence de génération potentielle d’action. La libération est directement due à l’afflux de calcium par des canaux de calcium dépendants de la tension.
    5. En tournant la clé d’intensité sur le stimulateur, ajuster le courant de stimulation pour obtenir des réponses similaires à celles obtenues par des potentiels d’action. Typiquement, le courant de stimulation serait d’environ 6 'A pour une dépolarisation de 0,5 ms.
    6. Pour les tests de base de la préparation, appliquez 0,5 mM CdCl2. La présence de ce canal de calcium bloquant la libération de glutamate empêche complètement la libération synaptique de glutamate validant ainsi la dépendance de calcium du signal de glutamate directement évoqué.
      REMARQUE : La recommandation générale suivante peut aider à augmenter le taux de réussite des expériences synapses uniques dans le striatum. Pour sélectionner des terminaux synaptiques glutamatergiques avec des machines de libération intactes, une varice devrait : (i) Avoir une forme lisse ressemblant à un fuseau; (ii) Ne pas être associé à une bifurcation d’axone; (iii) Soyez plus lumineux que d’autres structures sur « l’image jaune » ; (iv) Résidez dans le neuropil striatal plutôt que dans les tractations de fibres; v) Résidez sur une branche axone très mince; (vi) Ne pas résider dans les parties les plus profondes de la tranche.

3. Visualisation de la libération et du dégagement du glutamate

  1. Mode d’enregistrement
    REMARQUE : Après la soustraction de l’autofluorescence (étape 2.2) et quelques tests initiaux pour la réactivité du bouton d’intérêt (étape 2.3), l’acquisition de données peut commencer. Les réponses à l’activation électrique de la libération de glutamate à partir de terminaux axones simples peuvent être observées directement dans l’image(figure 2), sans appliquer d’autres outils d’analyse. Cependant, il s’est avéré très pratique d’extraire immédiatement certains indicateurs de base de la performance synapse(figure 3). Cette information est nécessaire pour prendre des décisions sur le cours ultérieur de l’expérience, comme la sélection de types terminaux particuliers, l’évaluation rapide des modifications liées à la MH, le nombre et la fréquence des essais ou des médicaments à appliquer avec le système de superfusion. Il pourrait également être nécessaire de traiter éventuellement des artefacts apparaissant. Tout d’abord, les paramètres standard pour l’enregistrement des données sont décrits.
    1. À l’aide du microscope XY lecteurs, placez le bouton testé iGluu-positifprès du centre de champ de vision. Arrêtez l’acquisition d’image avec le bouton d’acquisition Abort. Sur la dernière photo acquise, déterminez la position XY du centre bouton au repos en cliquant dessus avec le bouton de la souris gauche. Les coordonnées XY du curseur défini seront affichées sur le panneau d’état inférieur de la fenêtre d’acquisition.
    2. À l’aide des données d’étalonnage (étape 2.1.6), calculez les coordonnées du site où le faisceau laser doit être envoyé pour l’excitation de la fluorescence iGluu. Utilisez les équations suivantes : X laser ' X caméra ' X factor ' X offset, Y laser ' Y offset ' Y camera ' Y facteur. Lors de l’exécution de ce recalcul, faites attention aux réglages de retournement vertical ou horizontal de la caméra.
    3. Créez une séquence d’un point dans le logiciel de commande laser à l’aide des coordonnées calculées. À cette fin, sélectionnez Point in the Add à la boîte de séquence sur la page Séquence du logiciel de contrôle laser. Sélectionnez 10 's pour le retard pour déclencher le début et 180 ms pour le temps d’impulsion laser. Déplacez la souris vers les coordonnées calculées et cliquez sur le bouton gauche.
    4. Sélectionnez les paramètres suivants dans le logiciel de commande laser : Exécute: 0, Retard d’exécution: 0, Séquence: Exécuter à TTL. Cliquez ensuite sur la séquence Démarrer.
    5. Dans le logiciel de contrôle de la caméra, sélectionnez les paramètres suivants : Sur la page Binning/ROI, set Image Area: Custom, Pixel Binning: 2x2, Hauteur: 20, Largeur : 20, Gauche: X-coordinate de l’iGluuau repos -spot positif moins 10 px, Bottom: Y-coordinate of the resting iGluu-positive spot minus 10 px, Acquisition: Kinetic Series, Kinetic Series Length: 400 : 0.0003744s (valeur minimale). Avec de tels paramètres, le taux d’acquisition sera de 2,48 kHz.
    6. Sélectionnez mode Déclencheur: Externe. Cliquez sur Prenez le signal dans le logiciel de contrôle de la caméra. Initier le protocole expérimental établi pour le dispositif de déclenchement.
    7. Mettre en œuvre le protocole expérimental Essai avec la ligne de temps suivante: 0 ms - début de l’essai, 1 ms - commencer l’éclairage laser, 20 ms - commencer l’acquisition d’images avec la caméra, 70 ms - commencer la stimulation électrique 1, 120 - commencer la stimulation électrique 2, 181 ms - essai de fin (laser et caméra éteint). Ainsi, au cours d’un essai, la caméra acquiert 400 images d’une fréquence de 2,48 kHz. Voir les étapes 2.3.3 et 2.3.5. pour plus de détails sur la stimulation électrique.
    8. Pour permettre un rétablissement suffisant des piscines de vésicules présynaptiques, appliquez le protocole Essai avec une fréquence de répétition de 0,1 Hz ou plus bas.
  2. Construction hors ligne du glutamate évaluation transitoire et rapide de la libération et de l’autorisation du glutamate pour l’identification des synapses pathologiques
    1. Activez les routines d’évaluation. Ici, nous utilisons un logiciel écrit en interne SynBout v. 3.2. (auteur: Anton Dvorzhak). Les étapes suivantes sont nécessaires pour construire un transitoire de F/F à partir des pixels avec la fluorescence élevée d’iGluu comme dans la vidéo de la figure 2.
    2. Pour déterminer la taille du bouton, calculer l’écart moyen et standard (SD) de l’intensité de fluorescence du retour sur investissement au repos (F), avant le début de la stimulation. Déterminer et boxer la zone occupée par des pixels avec F 'gt;mean 3 SD (Figure 3A). Déterminer un diamètre virtuel (en m) en supposant une forme circulaire de la zone supra-seuil.
    3. Déterminer la différence entre la valeur d’intensité maximale et F. Tracer le courant stimulant et le courant stimulant et le F/F contre le temps(figure 3B). Calculez le SD de F/F au repos (avant le début de la stimulation) et l’amplitude maximale. Utilisez pixel avec amplitude maximale plus de 3 SD de 'F/F pour effectuer un ajustement monoexponentiel pour la décomposition du pic. Déterminer la constante de temps de la pourriture TauD de F/F.
    4. Pour estimer l’amplitude maximale à une synapse donnée, sélectionnez le pixel avec la valeur la plus élevée de F/F. Il est généralement situé à l’intérieur ou à côté des limites du bouton de repos iGluu fluorescence. L’amplitude maximale serait le meilleur indicateur de la charge de glutamate présentée à la machinerie de dégagement d’une seule synapse.
    5. Pour estimer l’extension spatiale du signal iGluu, déterminez le diamètre de la zone de tous les pixels supra-seuil combinés pour former un cercle virtuel. Le diamètre respectif est appelé "Spread". Le terme « écart de pointe » fait alors référence à la valeur maximale de l’écart moyen transitoire(figure 3C, différence entre les lignes rouges pointillées).
  3. Corrections pour les artefacts possibles
    REMARQUE : La dépolarisation électrique est associée à un flux extérieur de la solution intra-pipette. Cela peut entraîner un petit déplacement de tissus. Pour faire la distinction entre les changements induits par la stimulation d’iGluu et les changements hors foyer de l’image, on pourrait utiliser l’approche suivante pour identifier et éliminer les artefacts de déplacement(figure 4).
    1. Analyser les caractéristiques spatiales des pixels suprathreshold dérivés d’un retour sur investissement avec des signes de déplacement(figure 4F-H).
    2. Trouvez des pixels en dehors des limites initialement déterminées du bouton au repos(figure 4F-H, en boîte en rouge).
    3. Identifier les valeurs d’intensité négatives des pixels (figure 4I, J). Toute F/F dans la direction négative avec une amplitude plus grande que la moyenne pré-stimulation 3 SD doit être considérée comme un artefact, et l’enregistrement doit être jeté.
    4. Pour éviter les artefacts désentraux, placez l’électrode de stimulation sur le côté antero-latéral du bouton synaptique, utilisez la stimulation électrique biphasique et minimisez l’intensité/durée de stimulation.
      REMARQUE : Des artefacts flous peuvent également être dérivés de la caméra. Si ce dernier n’est pas fixé de façon optimale au microscope, il peut produire des oscillations, probablement en raison de petites vibrations du système de refroidissement de la caméra. Ces vibrations créent un motif "yin et yang" dans les images de F/F tournant avec une fréquence de 50 Hz. Les vibrations peuvent être mathématiquement soustraites du signal de fluorescence, mais la qualité finale des mesures dépendrait alors de façon critique du temps d’enregistrement.
    5. Fixez la caméra au microscope de telle sorte que les vibrations sont absentes. Si ce dernier reste, placez un joint en caoutchouc entre la caméra et l’adaptateur au microscope.
      REMARQUE : On ne peut négliger la possibilité que le neuropil striatal autour de la synapse d’intérêt contienne des varicosities glutamatergiques qui n’expriment pas iGluu et restent donc invisibles. Dans le cas de leur co-activation (plus probablement en l’absence de TTX), les transitoires obtenus à partir des boutons d’intérêt pourraient être affectés par le débordement. La même choseus’applique à iGlu u-exprimant des terminaux qui étaient hors de propos. Un phénomène caractéristique serait dans ce cas que les transitoires de fluorescence proviennent d’une zone beaucoup plus large. Comme cette réponse est éliminée par TTX, on peut l’interpréter comme une réponse non spécifique induite par l’activation multi-fibres injustifiée.
    6. Pour corriger cette réponse multifibre non spécifique, suivez la procédure décrite dans la figure 5. Utilisez le signal de fluorescence des pixels aux limites du champ de vision. Pour minimiser la réponse de fond, minimisez l’intensité et la durée de stimulation ou utilisez TTX.

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Résultats

Identification de deux types de varicosses glutamatergiques corticostriatale
Les afferents d’it et de PT proviennent respectivement des couches 2/3 et 5, et présentent des modèles différentiels de ramification et de terminaison dans le striatum ipsilateral et contralatéral (terminaux IT seulement). On sait encore peu de choses sur les propriétés de la libération et du dégagement du glutamate dans des conditions d’activation répétitives observées lors de l’initiation des mouvements, ma...

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Discussion

Les expériences concernent une question d’intérêt général — l’indépendance synapse et sa perte possible au cours de la neurodégénérescence, et nous décrivons une nouvelle approche pour identifier les synapses affectées dans les tranches cérébrales aigues des souris âgées (1 an). Profitant des caractéristiques cinétique améliorées du capteur de glutamate récemment introduit iGluu les expériences éclairent la relation entre la libération synaptique de glutamate et l’absorption d’...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus par CHDI (A-12467), la Fondation allemande de recherche (Exc 257/1 et DFG Project-ID 327654276 - SFB 1315) et les Fonds de recherche intra-muros de la Charité. Nous remercions K. Tûrôk, St. George’s, Université de Londres, et N. Helassa, Université de Liverpool, pour l’iGluu plasmid et de nombreuses discussions utiles. D. Betances et A. Schonherr ont fourni une excellente assistance technique.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Stereo microsopeWPIPZMIIIPrecision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frameStoelting51500DDigital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipmentStoelting514439VForedom K1070 cromoter Kit
Injection systemStoelting53311Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µlHamilton8793075RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning systemRapp OptoElectronicUGA-40UGA-40
Blue laser for iGluu excitationRapp OptoElectronicDL-473-020-S473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nmRapp OptoElectronicROE TB-355-405-473Dichroic
1P upright microscopeCarl Zeiss000000-1066-600Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0Carl Zeiss421480-9900W Plan-Apochromat
4x objectiveCarl Zeiss44-00-20Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluuOmega opticalXF2030
Emission filter for iGluuOmega opticalXF3086
Dichroic mirrorOmega opticalQMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr.Omega opticalQMAX EM600-650
sCMOS cameraAndorZYLA4.2PCL10ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition softwareAndor4.30.30034.0Solis
AD/DA converterHEKA Elektronik895035InstruTECH LIH8+8
Aquisition softwareHEKA Elektronik895153TIDA5.25
Electrode positioning systemSutter InstrumentMPC-200Micromanipulator
Electrical stimulatorCharite workshopsSTIM-26
SlicerLeicaVT1200 SVibrotome
Brown/Flaming-type pullerSutter InstrSU-P1000P-1000
Glass tubes for injection pipettesWPI1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettesWPIR100-F3
TetrodotoxinAbcamab120054TTX
iGluu plasmidAddgene106122pCI-syn-iGluu
Q175 miceJackson Lab27410Z-Q175-KI

Références

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