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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per valutare l'equilibrio tra il rilascio del glutammato e l'autorizzazione alle singole sinapsi glutamatergiche corticosterogiche in fette acute di topi adulti. Questo protocollo utilizza il sensore fluorescente iGluu per il rilevamento del glutammato, una telecamera sCMOS per l'acquisizione del segnale e un dispositivo per l'illuminazione laser focale.

Abstract

Le sinapsi sono unità funzionali altamente compartimentate che operano in modo indipendente l'una sull'altra. Nella malattia di Huntington (HD) e in altri disturbi neurodegenerativi, questa indipendenza potrebbe essere compromessa a causa dell'insufficiente eliminazione del glutammato e dei conseguenti effetti di fuoriuscita e fuoriuscita. Una copertura astrocitica alterata dei terminali pressinaptici e/o delle spine dendritiche, nonché una dimensione ridotta degli ammassi trasportatori di glutammato nei siti di rilascio del glutammato sono state implicate nella patogenesi delle malattie che si sono manifestate sintomi di dis-ipercinesi. Tuttavia, i meccanismi che portano alla disfunzione delle sinapsi glutamategiche nella MH non sono ben compresi. Migliorando e applicando l'imaging a sinapsi abbiamo ottenuto dati che gettano nuova luce sui meccanismi che impediscono l'avvio dei movimenti. Qui, descriviamo gli elementi principali di un approccio relativamente poco costoso per ottenere una risoluzione a sinapsi singola utilizzando il nuovo sensore di glutammato ultraveloce codificato geneticamente iGluu, ottica a campo largo, una telecamera scientifica CMOS (sCMOS), un laser da 473 nm e un sistema di posizionamento laser per valutare lo stato delle sinapsi corticostriatali in fette acute da topi sani o malati appropriati. I transienti glutammati sono stati costruiti da uno o più pixel per ottenere stime del rilascio di i) glutammato in base all'elevazione massima della concentrazione di glutammato [Glu] accanto alla zona attiva e ii) assorbimento del glutammato come riflesso nella costante temporale di decadimento (TauD) del perissitico [Glu]. Le differenze nella dimensione dell'bouton a riposo e nei modelli contrastanti di plasticità a breve termine servivano come criteri per l'identificazione dei terminali corticostalati come appartenenti al percorso intratelencephalico (IT) o al tratto piramidale (PT). Utilizzando questi metodi, abbiamo scoperto che nei topi MH sintomatici il 40% delle sinapsi corticostriatali di tipo PT mostrava una scarsa distanza del glutammato, suggerendo che queste sinapsi potrebbero essere a rischio di danni da eccitotossici. I risultati sottolineano l'utilità del TauD come biomarcatore delle sinapsi disfunzionali nei topi di Huntington con un fenotipo iponetetico.

Introduzione

L'impatto relativo di ogni terminale sinaptico appartenente a una "connessione unitaria" (cioè la connessione tra due cellule nervose) è tipicamente valutato dalla sua influenza sul segmento iniziale del neurone post-sinaptico1,2. Le registrazioni somatiche e/o dendritiche dei neuroni post-sinaptici rappresentano le più comuni e, fino ad ora, anche i mezzi più produttivi per chiarire l'elaborazione delle informazioni sotto una prospettiva top-down o verticale3,4,5. Tuttavia, la presenza di astrociti con i loro territori discreti e (in roditori) non sovrapposti può contribuire a una prospettiva orizzontale che si basa su meccanismi locali di scambio di segnale, integrazione e sincronizzazione nei siti sinaptici6,7,8,9,10.

Perché è noto che l'astroglia gioca, in generale, un ruolo importante nella patogenesi della malattia neurodegenerativa11,12 e, in particolare, un ruolo nel mantenimento e plasticità delle sinapsi glutamategiche13,14,15,,16, è concepibile che alterazioni delle prestazioni sinaptiche si evolvono in conformità con lo stato di astrociti nell'area di destinazione condivisa di fibre afferenti di varia origine. Per esplorare ulteriormente i meccanismi normativi locali di origine target/astroglia in materia di salute e malattia, è necessario valutare le singole sinapsi. L'approccio attuale è stato elaborato per stimare la gamma di indicatori funzionali di rilascio e gioco del glutammato e per definire i criteri che possono essere utilizzati per identificare le sinapsi disfunzionali (o recuperate) nelle aree cerebrali più strettamente correlate all'inizio del movimento (cioè, prima di tutto nella corteccia motoria e nello striato dorsale).

Lo striato manca di neuroni glutamatergici intrinseci. Pertanto, è relativamente facile identificare gli afferenti glutamatergici di origine extrastriata. Questi ultimi hanno per lo più origine nel talamo mediale e nella corteccia cerebrale (vedi17,18,19,20 per di più). Le sinapsi corticostriatali sono formate dagli assoni dei neuroni piramidali localizzati negli strati corticali 2/3 e 5. I rispettivi assoni formano connessioni bilaterali intratelefila (IT) o connessioni ipsilaterali attraverso un sistema in fibra che costituisce più caudalmente il tratto piramidale (PT). È stato inoltre suggerito che i terminali di tipo IT e PT differiscono per le loro caratteristiche di rilascio e dimensione21,22. Alla luce di questi dati, ci si potrebbe aspettare anche alcune differenze nella gestione del glutammato.

Lo striato è l'area cerebrale più colpita nella malattia di Huntington (HD)5. La MH umana è un grave disturbo neurodegenerativo geneticamente ereditato. Il modello murino Q175 offre l'opportunità di studiare la base cellulare della forma ipocinetica-rigida della MH, uno stato che ha molto in comune con il parkinsonismo. A partire da un'età di circa 1 anno, i topi omozigote Q175 (HOM) presentano segni di ipocinesia, come rivelato misurando il tempo trascorso senza movimento in un campo aperto23. I presenti esperimenti con topi eterozigote Q175 (HET) hanno confermato i precedenti deficit motori osservati nell'HOM e, inoltre, hanno dimostrato che i deficit motori osservati sono stati accompagnati da un livello ridotto dell'amminoacido eccitativo astrocitatorio trasportatore 2 proteine (EAAT2) nelle immediate vicinanze dei terminali sinaptici corticostriali24. È stato quindi ipotizzato che un deficit nell'assorbimento del glutammato astrocitico potrebbe portare a disfunzione o addirittura alla perdita delle rispettive sinapsi25,26.

Qui, descriviamo un nuovo approccio che permette di valutare l'autorizzazione del glutammato a sinapsi singola rispetto alla quantità del neurotrasmettitore rilasciato. Il nuovo sensore di glutammato iGluu è stato espresso nei neuroni piramidali corticostriatali. È stato sviluppato da Katalin T'r'k27 e rappresenta una modifica del sensore ad alta affinità ma lento del glutammato iGluSnFR28introdotto in precedenza. Entrambi i sensori sono derivati della proteina fluorescente verde potenziata (EGFP). Per le caratteristiche spettrali e cinetiche, vedere Helassa et al.27. In breve, iGluu è un sensore a bassa affinità con cinetica di deattivazione rapida e quindi particolarmente adatto per studiare l'autorizzazione del glutammato nei terminali sinaptici che rilasciano glutammato. La costante del tempo di dissociazione di iGluu è stata determinata in un dispositivo di arresto del flusso, che ha reso un valore di spegnimento di Tau di 2,1 ms a 20 , ma 0,68 ms quando estrapolato ad una temperatura di 34 .off 27 I singoli terminali collaterali di Schaffer sondati a 34 gradi centigradi con la scansione a spirale nella regione CA1 delle colture organotipiche dell'ippocampo sotto un microscopio a 2 fotoni hanno mostrato una costante temporale media di decadimento di 2,7 ms.

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Protocollo

Tutti i lavori sono stati effettuati in conformità con la direttiva UE 2010/63/EU per esperimenti sugli animali ed è stato registrato presso l'Ufficio di Berlino per la protezione della salute e la sicurezza tecnica (G0233/14 e G0218/17).

NOTA: le registrazioni da Q175 wild-type (WT) ed heterozygotes (HET) possono essere eseguite a qualsiasi età e sesso. Qui abbiamo studiato maschi e femmine all'età di 51-76 settimane.

1. Iniezione del Sensore Glutamate iGluu per l'Espressione in Assoni Corticostriatali

  1. Utilizzare l'emittente pipetta (modalità a un passo) per preparare pipette di vetro borosilicate per l'iniezione del virus. Dopo aver tirato, rompere manualmente il pipetta per ottenere un diametro della punta di 30-50 m. Autoclave la pipetta e gli strumenti chirurgici, compreso il trapano per l'apertura del cranio.
  2. Memorizzare il virus AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 1013gc/mL) a -80 gradi centigradi in 10 aliquote l. Se le iniezioni vengono eseguite poco dopo la produzione di virus (entro 6 mesi), tenere a 5 gradi centigradi. Prima dell'intervento chirurgico, estrarre la fiala e mantenerla a temperatura ambiente.
  3. Riempire la pipetta di vetro e rimuovere eventuali bolle.
  4. Anestesizzare l'animale con un'iniezione intraperitoneale di una soluzione contenente 87,5 mg/kg di ketamina e 12,5 mg/kg di xilola. Iniettare sottocutaneamente 0.25% bupivacaina (8 mg/kg) per alleviare ulteriore il dolore. Controllare la profondità dell'anestesia monitorando il tono muscolare e osservando l'assenza di riflessi indotti dal dolore.
  5. Rasare la pelle sulla testa e sterilizzarla con il 70% di alcol. Inserire il mouse nella cornice stereotaxic.
  6. Utilizzare un bisturi per rimuovere la pelle e un trapano ad alta velocità (38.000 rpm) per fare un foro di 1,2 mm nell'osso sopra la corteccia motoria.
  7. Montare la siringa con la pipetta a iniezione attaccata nel supporto di un manipolatore di precisione. Inserire la pipetta orientata verticalmente nella corteccia in 4 siti diversi. Le coordinate di iniezione sono, per quanto riguarda il bregma (in mm): anteriore 1,5), laterale 1,56, 1,8, 2,04, 2,28. La profondità rispetto alla dura mater è (in mm): 1.5–1.7.
  8. Utilizzando il sistema di iniezione, iniettare 0,3 l per sito della soluzione di virus non diluito con una velocità di 0,05 l/min. Dopo ogni iniezione, lasciare la pipetta in posizione per 1 min prima di ritirarla lentamente (1 mm/min).
  9. Terminare chiudendo la ferita chirurgica con una sutura di nylon.
  10. Lasciare il mouse per 0,5 a 1 h su una piastra di riscaldamento in una gabbia pulita prima di restituirlo alla sua gabbia originale.
  11. Mantenere il mouse su un ciclo giorno-notte 12 h per 6 A 8 settimane prima della preparazione di fette di cervello acuto.
    NOTA: Per evitare reazioni immunitarie con conseguente danno cellulare e perdita di sinapsi, l'iniezione di più costrutti virali deve essere eseguita contemporaneamente o entro 2-3 ore dopo l'iniezione primaria. Le coordinate per l'iniezione di iGluu sono state selezionate secondo l'atlante cerebrale Paxinos e Franklin29. Corrispondono alla corteccia motoria M1. L'immunostaining del cervello iniettato ha visualizzato numerosi ma per lo più ben isolati assoni e varietà assoni nello striato ipsi- e contralaterale e nei cortici m1 e S1 contralaterali.

2. Ricerca di terminali glutamatergici che esprimono il sensore Glutamate iGluu

  1. Modalità di calibrazione
    1. Preparare la telecamera sCMOS e il software di controllo della fotocamera con le seguenti impostazioni. Nella pagina Lettura impostare Frequenzadi lettura pixel : 560 MHz (lettura più veloce), Sensibilità/Intervallo dinamico: bit, Filtro rumore spurio: Sì, Lettura sovrapposta: Sì. Nella pagina Binning/ROI, selezionare Schermo intero.
    2. Preparare uno scivolo di vetro contenente una goccia di 5 mg/mL Lucifer Giallo (LY) sotto una ricevuta di copertura.
    3. Posizionare la diapositiva LY sotto un obiettivo 63x, aprire l'otturatore laser ed eseguire un'acquisizione seriale utilizzando le seguenti impostazioni: Pixel Binning: 1x1, Modalità trigger: Interno, Tempo di esposizione: Minimo (da determinare).
    4. Regolare la potenza del laser per produrre uno spot di fluorescenza di 4 m di diametro (l'immagine non deve contenere pixel saturi).
    5. Per eseguire una calibrazione del sistema di posizionamento laser, selezionare le seguenti impostazioni nel software di posizionamento laser: Diametro delle dimensioni spot: 10, Velocità di scansione: 43.200 kHz. Fare clic sul pulsante Avvia acquisizione immagine nel riquadro di destra. Imposta esecuzioni: 0, Ritardo esecuzione: 0 e selezionare l'opzione Esegui al TTL nella pagina Sequenza. Fare clic sul pulsante Calibra nella pagina Calibrazione e calibrare il software di controllo laser in base alle istruzioni visualizzate nell'angolo superiore sinistro della schermata di acquisizione.
    6. Se la configurazione utilizza un software indipendente per la fotocamera e il controllo laser, acquisire screenshot dalla finestra di acquisizione della fotocamera e inviarlo al software di controllo laser per un ricalcolo delle coordinate XY. Se il software è installato su computer diversi, quindi utilizzare un grabber video per importare l'immagine nel software di controllo laser. Il software di controllo laser avrà bisogno delle informazioni sui fattori di scala XY e gli offset. A tale scopo, determinare le coordinate degli angoli in alto a sinistra, in basso a sinistra e in basso a destra dell'immagine all'interno della finestra di acquisizione del programma di controllo laser. Calcolare i fattori di scala in base alle seguenti equazioni: fattore X - (X in basso a destra – X in basso a sinistra)/2048, X offset - X in basso a sinistra, fattore Y (Y in alto a sinistra – Y in basso a sinistra)/2048, Scostamento Y - Y in basso a sinistra.
    7. Al termine della procedura di calibrazione, create un'area di interesse rettangolare (ROI) di 267x460 pixel, spostatela al centro dello schermo e fate clic sul pulsante Sequenza iniziale.
    8. Tornare alle seguenti impostazioni software di controllo della telecamera: Binning: 2x2, Modalità trigger: Esposizione esterna, Tempo di esposizione: Minimo (da determinare).
  2. Modalità di correzione autofluorescenza
    NOTA: il livello di riposo di [Glu] nell'ambiente dei terminali sinaptici attivi è in genere inferiore a 100 nM14,30,31,32,33,34. Di conseguenza, qualsiasi sensore di glutammato, in particolare un sensore di bassa affinità come iGluu sarà piuttosto fioca in assenza di rilascio di glutammato sinaptico. Tuttavia, alcuni iGluu fluorescenza può anche essere rilevato a riposo, ma deve essere distinto dall'autofluorescenza del tessuto. L'illuminazione di 473 nm suscita sia la fluorescenza iGluu che l'autofluorescenza(Figura 1A–C). Quest'ultimo occupa una vasta gamma di lunghezze d'onda, mentre la fluorescenza iGluu è limitata a 480-580 nm (con un massimo di 510 nm). La correzione per l'autofluorescenza si basa sull'acquisizione di due immagini con diversi filtri high-pass.
    1. Preparare le fette di cervello in anticipo come descritto altrove35. Tenere le fette di crusca pronte.
    2. Trasferire le fette nella camera di registrazione, immergendole in cerebrospinalfluid artificiali ossigenati (ACSF) contenenti 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 m MgCl2, 10 mM di glucosio (pH 7.3, 303 mOsm/L), integrato con 0,5 mM di piedvate di sodio, 2,8 mM di sodio asbatcore e 0,005 mMosat. Utilizzare una portata di 1–2 mL/min. Mantenere la temperatura del bagno a 28-30 gradi centigradi.
    3. Individuare lo striato dorsale sotto un obiettivo di immersione dell'acqua 20x. Fissare le fette con una griglia di nylon su un'arpa di platino per ridurre al minimo il movimento del tessuto. Passare all'obiettivo di immersione in acqua 63x /NA 1.0. Selezionare i filtri che riflettono la luce a 473 nm (specchio dicroico) e passano la luce con lunghezze d'onda >510 nm (filtro di emissione).
    4. Sincronizza l'illuminazione, la stimolazione e l'acquisizione delle immagini utilizzando una scheda AD/DA con il rispettivo software di controllo. Impostare il programma trigger per controllare l'acquisizione con un tempo di esposizione al laser di 180 ms e un tempo di acquisizione dell'immagine di 160 ms. Utilizzare il dispositivo di posizionamento laser per inviare il raggio laser a un numero predeterminato di punti e definire le impostazioni per la velocità di scansione e la dimensione spot.
    5. Acquisire un'immagine delle strutture sia autofluorescenza che iGluu-positive utilizzando un filtro passa-alto a 510 nm ("immagine gialla").
    6. Acquisire un'immagine con autofluorescenza da solo utilizzando un filtro passa-alto a 600 nm ("immagine rossa").
    7. Ridimensiona le immagini rosse e gialle, utilizzando le intensità medi dei 10 pixel più luminosi e i 10 pixel più scuri per definire l'intervallo. Eseguire una sottrazione "immagine gialla meno rossa" e ridimensionare l'immagine sottratta per generare un file tif standard a 8 bit per una comoda visualizzazione dell'incontro di interesse (Figura 1D). Contiene i pixel luminosi delle strutture iGluu-positive, i pixel grigi dallo sfondo e i pixel scuri delle strutture con autofluorescenza.
      NOTA: Con l'apparecchiatura data la fluorescenza a riposo media (F) sarà inferiore a 700 U.S.A.
  3. Modalità di ricerca Bouton
    NOTA: iGluu-positivi pixel possono appartenere a elementi funzionalmente diversi dell'albero assonale, come rami assonali di ordine diverso, siti di biforcazione, varietà dopo l'esaurimento delle vesciche o variecosità completamente attive. Tuttavia, è quasi impossibile identificare i terminali sinaptici funzionali solo mediante ispezione visiva. Pertanto, ogni terminale sinaptico glutamategico ha bisogno di essere identificati dalla sua reattività alla depolarizzazione elettrica. I siti che non rispondono alla stimolazione devono essere scartati. Il mezzo fisiologico per indurre il rilascio di glutammato dagli assoni corticosteraiali è quello di suscitare un potenziale d'azione. Ciò può essere ottenuto utilizzando un canale di rodopsina di caratteristiche spettrali appropriate o mediante stimolazione elettrica di un assone visualizzato da iGluu stesso. Per evitare l'attivazione accidentale di opsin, abbiamo preferito quest'ultimo passo
    1. Utilizzare l'estrattore di micropipette (in modalità a quattro fasi) per produrre pipette di stimolazione da capillari di vetro borosilicato. Il diametro della punta interna dovrebbe essere di circa 1 m. Quando viene riempito con ACSF, la resistenza dell'elettrodo dovrebbe essere di circa 10 M.
    2. Per indurre l'azione potenziale-dipendente rilascio del glutammato da una serie di bouttoni sinaptici attaccati allo stesso assone, utilizzare l'ingrandimento 63x, il filtro di emissione 510 nm e l'immagine sottratta per posizionare un elettrodo di stimolazione del vetro accanto a una varicosità fluorescente . Evitare la vicinanza di assoni aggiuntivi.
    3. Accendere lo stimolatore per fornire impulsi di corrente depolarizzante alla pipetta di stimolazione. Utilizzare intensità di corrente intorno a 2 A (non più di 10 a).
    4. Accendere il sistema di applicazione bagno multicanale in cui un canale offre la soluzione bagno standard e gli altri canali offrono i blocchi necessari di canali ionici, trasportatori o recettori della membrana. Controllare il flusso nel sito di registrazione e quindi passare al canale tetrodotossina (TTX) (soluzione di bagno più 1 TTX). Dopo 2-3 min, stimolare di nuovo l'incontro di interesse, ma ora in assenza di azione potenziale generazione. Il rilascio è direttamente dovuto all'afflusso di calcio attraverso canali di calcio dipendenti dalla tensione.
    5. Ruotando il tasto di intensità sullo stimolatore, regolare la corrente di stimolazione per ottenere risposte simili a quelle suscitate da potenziali d'azione. Tipicamente, la corrente di stimolazione sarebbe di circa 6 a per una depolarizzazione di 0,5 ms.
    6. Per i test di base della preparazione, applicare 0,5 mM CdCl2. La presenza di questo rilascio di glutammato isolante canale di calcio impedisce completamente il rilascio di glutammato sinaptico convalidando così la dipendenza dal calcio del segnale del glutammato direttamente evocato.
      NOTA: La seguente raccomandazione generale può contribuire ad aumentare il tasso di successo degli esperimenti di sinapsi singola nello striato. Per selezionare i terminali sinaptici glutamatergici con macchinari di rilascio intatti, una varicosità dovrebbe: (i) avere una forma liscia simile a un mandrino; (ii) Non essere associato a una biforcazione assonale; (iii) Essere più luminosi di altre strutture sull'"immagine gialla"; (iv) risiedere nel neuropil striatore piuttosto che nei tratti di fibra; (v) Risiede su un ramo assone molto sottile; (vi) Non risiede all'interno delle parti più profonde della fetta.

3. Visualizzazione del rilascio e del gioco di Glutamate

  1. Modalità di registrazione
    NOTA: dopo la sottrazione dell'autofluorescenza (passaggio 2.2) e alcuni test iniziali per la reattività dell'incontro di interesse (passaggio 2.3), è possibile iniziare l'acquisizione dei dati. Le risposte all'attivazione elettrica del rilascio del glutammato da terminali assonali singoli possono essere osservate direttamente nell'immagine(Figura 2),senza applicare ulteriori strumenti di analisi. Tuttavia, si è rivelato molto conveniente per estrarre immediatamente alcuni indicatori di base delle prestazioni di sinapsi (Figura 3). Queste informazioni sono necessarie per prendere decisioni sul successivo corso dell'esperimento, come la selezione di particolari tipi di terminali, la valutazione rapida delle alterazioni correlate alla MH, il numero e la frequenza delle sperimentazioni o dei farmaci da applicare con il sistema di superfusione. Potrebbe anche essere necessario affrontare artefatti che alla volta appaiono. In primo luogo, vengono descritte le impostazioni standard per la registrazione dei dati.
    1. Utilizzando le unità XY al microscopio, posizionare l'iGluu-positive bouton testato vicino al centro del campo di visualizzazione. Interrompere l'acquisizione dell'immagine con il pulsante di acquisizione Interrompi. Nell'ultima immagine acquisita, determinare la posizione XY del centro bouton di riposo facendo clic su di esso con il pulsante sinistro del mouse. Le coordinate XY del cursore impostato verranno visualizzate nel pannello di stato inferiore della finestra di acquisizione.
    2. Utilizzando i dati di calibrazione (passaggio 2.1.6), calcolare le coordinate del sito in cui deve essere inviato il raggio laser per l'eccitazione della fluorescenza iGluu. Usa le seguenti equazioni: X laser : X camera , X fattore X x x offset, Y laser - Scostamento Y – Y fotocamera - fattore Y. Durante l'esecuzione di questo ricalcolo, prestare attenzione alle impostazioni di capovolgimento verticale o orizzontale della fotocamera.
    3. Creare una sequenza di un punto nel software di controllo laser utilizzando le coordinate calcolate. A tale scopo, selezionare Punto nella casella Aggiungi alla sequenza nella pagina Sequenza del software di controllo laser. Selezionare 10 s per il ritardo di insorgenza e 180 ms per il tempo dell'impulso laser. Spostare il mouse sulle coordinate calcolate e fare clic sul pulsante sinistro.
    4. Selezionare le seguenti impostazioni nel software di controllo laser: Run: 0, Ritardo esecuzione: 0, Sequenza: Esegui in TTL. Quindi fare clic su Inizia sequenza.
    5. Nel software di controllo della telecamera, selezionare le seguenti impostazioni: Nella pagina Binning/ROI, impostare Area immagine: Personalizzato, Binning pixel: 2x2, Altezza: 20, Larghezza: 20, Sinistra: Coordinata X del riposo iGluu-spot positivo meno 10 px, Inferiore: Coordinata Y del riposo iGluu-spot positivo meno 10 px, Modalità acquisizione: Serie Kinetica, Lunghezza Kinetic Series400 : Exposure Time 0.0003744s (valore minimo). Con tali impostazioni, il tasso di acquisizione sarà di 2,48 kHz.
    6. Selezionare Modalità trigger: Esterno. Fare clic su Prendi segnale nel software di controllo della fotocamera. Avviare il protocollo sperimentale previsto per il dispositivo di attivazione.
    7. Implementare il protocollo sperimentale Trial con la seguente linea temporale: 0 ms – start trial, 1 ms – start laser illuminazione, 20 ms – avviare l'acquisizione dell'immagine con fotocamera, 70 ms – avviare la stimolazione elettrica 1, 120 – avviare la stimolazione elettrica 2, 181 ms – prova finale (laser e fotocamera spenta). Così, durante una prova la fotocamera acquisisce 400 fotogrammi con una frequenza di 2,48 kHz. Vedere i passaggi 2.3.3 e 2.3.5. per i dettagli sulla stimolazione elettrica.
    8. Per consentire un recupero sufficiente dei pool di vescicoli pressinaptici, applicare il protocollo Prova con una frequenza di ripetizione di 0,1 Hz o inferiore.
  2. Costruzione off-line del glutammato transitorio e rapida valutazione del rilascio e della clearance del glutammato per l'identificazione delle sinapsi patologiche
    1. Attivare le routine di valutazione. Qui, usiamo un software scritto internamente SynBout v. 3.2. (autore: Anton Dvorzhak). I seguenti passaggi sono necessari per costruire un transitorio F/F dai pixel con elevata fluorescenza iGluu come nel video della Figura 2.
    2. Per determinare la dimensione dell'incontro, calcolare la media e la deviazione standard (SD) dell'intensità di fluorescenza del ROI a riposo (F), prima dell'inizio della stimolazione. Determinare e boxare l'area occupata da pixel con F>mean : 3 SD (Figura 3A). Determinare un diametro virtuale (in m) assumendo una forma circolare dell'area sopra-soglia.
    3. Determinare la differenza tra il valore dell'intensità massima e F. Tracciare la corrente stimolante e F/F rispetto al tempo (Figura 3B). Calcolare la SD di F/F a riposo (prima dell'inizio della stimolazione) e la "ampiezza del picco". Utilizzare un pixel con ampiezza di picco superiore a 3 SD di F/F per eseguire il raccordo monoesponenziale per il decadimento dal picco. Determinare la costante di tempo di decadimento TauD di F/F.
    4. Per stimare l'ampiezza massima in corrispondenza di una determinata sinapsi, selezionare il pixel con il valore F/F più alto. Si trova in genere all'interno o accanto ai confini dell'incontro a riposo iGluu fluorescenza. L'"ampiezza massima" sarebbe il miglior indicatore del carico di glutammato presentato ai macchinari di sdoganamento di una singola sinapsi.
    5. Per stimare l'estensione spaziale del segnale iGluu, determinare il diametro dell'area di tutti i pixel sopra-soglia combinati per formare un cerchio virtuale. Il rispettivo diametro si chiama "Spread". Il termine "Peak spread" si riferisce quindi al valore di picco dello spread medio transitorio(Figura 3C, differenza tra linee rosse tratteggiate).
  3. Correzioni per possibili artefatti
    NOTA: la depolarizzazione elettrica è associata a un flusso verso l'esterno della soluzione intrapipette. Ciò può provocare un piccolo spostamento del tessuto. Per discriminare tra i cambiamenti indotti dalla stimolazione degli spostamenti iGluu e fuori fuoco dell'immagine, si potrebbe utilizzare il seguente approccio per identificare ed eliminare gli artefatti di spostamento (Figura 4).
    1. Analizzare le caratteristiche spaziali dei pixel soprasogliati derivati da un ROI con segni di spostamento (Figura 4F–H).
    2. Trovare i pixel al di fuori dei limiti inizialmente determinati dell'incontro a riposo(Figura 4F–H, in rosso).
    3. Identificare i valori di intensità dei pixel negativi esistenti (Figura 4I, J). Qualsiasi SD in direzione negativa con un'ampiezza maggiore della media di pre-stimolazione 3 Deve essere considerata come artefatto e il record deve essere scartato.
    4. Per evitare artefatti fuori fuoco, posizionare l'elettrodo di stimolazione sul lato anterolaterale dell'incontro sinaptico, utilizzare la stimolazione elettrica bifasica e ridurre al minimo l'intensità/durata della stimolazione.
      NOTA: anche gli artefatti fuori fuoco possono essere derivati dalla fotocamera. Se quest'ultimo non è fissato in modo ottimale al microscopio può produrre oscillazioni, molto probabilmente a causa di piccole vibrazioni del sistema di raffreddamento della fotocamera. Tali vibrazioni creano un modello "yin e yang" nelle immagini di zF/F che ruotano con una frequenza di 50 Hz. Le vibrazioni possono essere sottratte matematicamente dal segnale di fluorescenza, ma la qualità finale delle misurazioni dipenderebbe quindi criticamente dal tempo di registrazione.
    5. Fissare la fotocamera al microscopio in modo che le vibrazioni siano assenti. Se quest'ultimo rimane, posizionare una guarnizione di gomma tra la fotocamera e l'adattatore da microscopio.
      NOTA: Non si può trascurare la possibilità che il neuropil striatale intorno alla sinapsi di interesse contenga variecosità glutamategiche che non esprimono iGluu e quindi rimangono invisibili. Nel caso della loro co-attivazione (più probabile in assenza di TTX) i transitori ottenuti dai bouton di interesse potrebbero essere influenzati da fuoriuscite. Lo stesso vale perui terminali iGlu u-expressing che erano fuori fuoco. Un fenomeno caratteristico sarebbe in questo caso che i transitori di fluorescenza provengono da un'area molto più ampia. Poiché questa risposta viene eliminata da TTX, si può interpretare come una risposta non specifica indotta da un'attivazione multifibra ingiustificata.
    6. Per correggere questa risposta multifibra non specifica, seguire la procedura descritta nella Figura 5. Utilizzare il segnale di fluorescenza dei pixel ai limiti del campo di visualizzazione. Per ridurre al minimo la risposta in background, ridurre al minimo l'intensità e la durata della stimolazione o utilizzare il TTX.

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Risultati

Identificazione di due tipi di glutamatesità corticostriatali
Gli afferenti IT e PT hanno origine rispettivamente nei livelli 2/3 e 5 e presentano modelli di ramificazione e terminazione differenziali nello striato ipsilaterale e contralaterale (solo terminali IT). Si sa ancora poco sulle proprietà del rilascio e della clearance del glutammato in condizioni ripetitive di attivazione osservate durante l'avvio dei movimenti, ma è ben documentato che le rispettive varietà di rilascio del glutammato d...

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Discussione

Gli esperimenti riguardano una questione di interesse generale : l'indipendenza da sinapsi e la sua possibile perdita nel corso della neurodegenerazione, e descriviamo un nuovo approccio per identificare le sinapsi colpite nelle fette cerebrali acute da topi invecchiati (>1 anno). Approfittando delle caratteristiche cinetiche migliorate del sensore di glutammato recentemente introdotto iGluu, gli esperimenti illuminano la relazione tra il rilascio e l'assorbimento del glutammato sinaptico in un modo che prima ...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da CHDI (A-12467), dalla Fondazione tedesca per la ricerca (Exc 257/1 e dal progetto-ID DFG 327654276 – SFB 1315) e dai fondi di ricerca intramurali della Charité. Ringraziamo K. T'r'k, St. George's, Università di Londra, e N. Helassa, Università di Liverpool, per l'iGluu plasmid e molte discussioni utili. D. Betances e A. Schànherr hanno fornito un'eccellente assistenza tecnica.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Stereo microsopeWPIPZMIIIPrecision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frameStoelting51500DDigital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipmentStoelting514439VForedom K1070 cromoter Kit
Injection systemStoelting53311Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µlHamilton8793075RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning systemRapp OptoElectronicUGA-40UGA-40
Blue laser for iGluu excitationRapp OptoElectronicDL-473-020-S473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nmRapp OptoElectronicROE TB-355-405-473Dichroic
1P upright microscopeCarl Zeiss000000-1066-600Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0Carl Zeiss421480-9900W Plan-Apochromat
4x objectiveCarl Zeiss44-00-20Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluuOmega opticalXF2030
Emission filter for iGluuOmega opticalXF3086
Dichroic mirrorOmega opticalQMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr.Omega opticalQMAX EM600-650
sCMOS cameraAndorZYLA4.2PCL10ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition softwareAndor4.30.30034.0Solis
AD/DA converterHEKA Elektronik895035InstruTECH LIH8+8
Aquisition softwareHEKA Elektronik895153TIDA5.25
Electrode positioning systemSutter InstrumentMPC-200Micromanipulator
Electrical stimulatorCharite workshopsSTIM-26
SlicerLeicaVT1200 SVibrotome
Brown/Flaming-type pullerSutter InstrSU-P1000P-1000
Glass tubes for injection pipettesWPI1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettesWPIR100-F3
TetrodotoxinAbcamab120054TTX
iGluu plasmidAddgene106122pCI-syn-iGluu
Q175 miceJackson Lab27410Z-Q175-KI

Riferimenti

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