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要約

我々は、単一のコルチコストリアタールグルタミン酸シナプスにおけるグルタミン酸放出とクリアランスのバランスを、成体マウスからの急性スライスにおける評価するプロトコルを提示する。このプロトコルは、グルタミン酸検出用の蛍光センサ iGluu、信号取得用のsCMOSカメラ、焦点レーザー照明装置を使用します。

要約

シナプスは、互いに独立して動作する高度に区画化された機能ユニットです。ハンチントン病(HD)および他の神経変性疾患では、グルタミン酸クリアランスの不十分さと結果として生じる流出および流出効果のために、この独立性が損なわれる可能性がある。シナプス前の末端および/または樹状脊椎の変わった占星術のカバレッジ、ならびにグルタミン酸放出部位におけるグルタミン酸輸送体の減少サイズは、疾患の病因に関与しており、その結果、異症/高キネジーの症状が生じる。しかし、HDにおけるグルタミン酸シナプスの機能障害につながるメカニズムはよく理解されていない。シナプスイメージングの改善と応用により、動きの開始を妨げるメカニズムに新たな光を当てるデータを得ました。ここでは、新しい遺伝子でコード化された超高速グルタミン酸センサーiGluu、広視野光学、科学CMOS(sCMOS)カメラ、473 nmレーザー、およびレーザー測位システムを使用して、適切な健康または病気の疾患の年齢から急性の皮質コストリアタールシナプスの状態を評価することによって、単一シナプス分解能を達成するための比較的安価なアプローチの原理要素を説明する。グルタミン酸過渡は、単一または複数のピクセルから構築され、i)グルタミン酸濃度の最大上昇に基づいてi)グルタミン酸放出が活性領域とiiの隣にあるグルタミン酸濃度[Glu]の時間定数(TauD)に反映されるように構築された[Glu]。短期可塑性の安静ブブトンサイズと対照パターンの違いは、子宮内脳症(IT)または錐管(PT)経路に属するコルチコストリアタール末端の同定の基準として役立った。これらの方法を用いて、症状のあるHDマウスではPT型コルチコストリアタールシナプスの40%がグルタミン酸クリアランスが不十分であることを発見し、これらのシナプスが興奮性損傷の危険にさらされる可能性があることを示唆した。この結果は、虚血性表現型を有するハンチントンマウスにおける機能不全シナプスのバイオマーカーとしてのTauDの有用性を強調した。

概要

「単一接続」に属する各シナプス末端の相対的な影響(すなわち、2つの神経細胞間の接続)は、典型的には、心内ナプティックニューロン11,22の初期セグメントに対するその影響によって評価される。ポストナプティクスニューロンからの体細胞および/または樹状記録は、最も一般的であり、これまで、トップダウンまたは垂直の視点33、4、54,5の下で情報処理を明確にする最も生産的な手段でもあります。しかし、それらの離散領域と(げっ歯類)非重なり合う領域を持つアストロサイトの存在,は、シナプス部位6、7、8、9、107における信号交換、統合9,10および同期6の局所メカニズムに基づく水平視点を寄与し得る。8

アストログリアが遊ぶことが知られているので、一般的に、神経変性疾患11、12,12および、特に、グルタマテル作動性シナプス13、14、15、1614,の維持および可塑性における役割13は、シナプス性の変化が多様な対象の線維の中でアストロシンの状態に応じて進化することが考えられる。15,16さらに、健康と病気における標的/アストログリア由来の局所調節機構を調べるには、個々のシナプスを評価する必要があります。本手法は、機能性グルタミン酸放出およびクリアランス指標の範囲を推定し、運動開始に最も密接に関連する脳領域における機能不全(または回収)シナプスを同定するために使用できる基準を定義するために働いた(すなわち、まず運動皮質および側側線条体の中で)。

線条体は、固有のグルタミン酸細胞系ニューロンを欠いている。したがって、他の起源のグルタマテルゲン酸凝集剤を比較的容易に同定することが容易である。後者は主に内側視床と大脳皮質に由来する(詳細については17、18、19、2018,19,20参照)。17コルチコストリアスシナプスは、皮質層2/3および5に局在する錐体ニューロンの軸索によって形成される。それぞれの軸索は、錐体管(PT)をより大きく構成する繊維系を介して、両側のテレンスファリック内(IT)接続またはipsilater接続を形成する。さらに、IT型およびPT型端末は、リリース特性とサイズ21、22,22が異なることを示唆している。これらのデータを考慮すると、グルタミン酸の取り扱いに若干の違いがあると考えることもできます。

線条体はハンチントン病(HD)5で最も影響を受けた脳5領域である。ヒトHDは、重度の遺伝的に遺伝する神経変性疾患である。Q175マウスモデルは、パーキンソニズムと多くの共通点を持つHDの低運動リジッド形態の細胞基盤を調査する機会を提供する。約1年齢から、ホモザイゴテQ175マウス(HOM)は、低血圧の徴候を示し、開場23で動かずに過ごした時間を測定することによって明らかになる。本実験では、ヘテロジゴテQ175マウス(HET)は、HOMで観察された以前の運動障害を確認し、さらに、観察された運動障害は、皮質化基底シナプス末端部24の近傍における占星興奮性アミノ酸トランスポーター2タンパク質(EAAT2)の減少レベルを伴っていることを示した。したがって、占星グルタミン酸の取り込みの赤字は、機能不全またはそれぞれのシナプス25、26,26の損失につながる可能性があると仮定されています。

ここでは、放出された神経伝達物質の量に対して単一シナプスグルタミン酸クリアランスを評価することを可能にする新しいアプローチを説明する。新しいグルタミン酸センサー iGluuは、コルチコストリアタール錐体のニューロンで発現した。それはカタリン・トレック27によって開発され、以前に導入された高親和性が遅いグルタミン酸センサーiGluSnFR28の修飾を表す。両方のセンサーは、強化された緑色蛍光タンパク質(EGFP)の誘導体です。スペクトル特性および運動特性については、Helassaら27を参照してください。簡単に言えば、iGluuは急速な脱活性化動態を備えた低親和性センサーであり、したがってグルタミン酸放出シナプス末端におけるグルタミン酸クリアランスを研究するのに特に適している。iGluuの解離時定数は停止流れ装置で決定され、タウオフ値は20°Cで2.1ms、34°C27の温度に外挿すると0.68msとなった。272光子顕微鏡下でのORGAnotypichippoカンピカル培養のCA1領域におけるスパイラルレーザースキャンを用いて34°Cで探査された単一のシャファー担保端子は、2.7msの平均時反減衰を示した。

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プロトコル

すべての作業は、動物実験のためのEU指令2010/63/EUに従って行われており、ベルリン健康保護技術安全局(G0233/14およびG0218/17)に登録されました。

注:Q175ワイルドタイプ(WT)とヘテロ接合体(HET)からの録音は、任意の年齢と性別で行うことができます。ここでは、51〜76週の年齢で男性と女性を研究しました。

1. コルティコストリアタール軸索における発現用グルタミン酸センサーiGlu uの注入

  1. ピペットプーラー(ワンステップモード)を使用して、ウイルスの注入用のホウケイ酸ガラスピペットを準備します。引っ張った後、ピペットを手動で破って30〜50 μmの先端直径を得る。
  2. ウイルス AAV9-CaMKIIa.iGluuを保存します。WPRE-hGH (7.5 x 1013 13gc/mL) で -80 °Cで 10 μL アリコート.ウイルス産生後すぐに注射を行う場合(6ヶ月以内)、5°Cに保つ。手術前にバイアルを取り出し、室温で維持してください。
  3. ガラスピペットを充填し、すべての気泡を削除します。
  4. 87.5 mg/kg ケタミンおよび 12.5 mg/kg キシラジンを含む溶液の腹腔内注射で動物を麻酔します。皮下に0.25%ブピバカイン(8mg/kg)を注入して、痛みの軽減を追加します。筋肉の緊張をモニタリングし、痛みによる反射神経の欠如を観察することによって麻酔の深さを確認する。
  5. 頭の上に皮膚を剃り、70%アルコールで殺菌します。ステレオタクスティック フレームにマウスを合わせます。
  6. メスを使用して皮膚を取り除き、高速(38,000 rpm)ドリルを使用して、運動皮質の上の骨に1.2 mmの穴を開けます。
  7. 精密マニピュレータのホルダーに付属の注入ピペットを使用してシリンジを取り付けます。4つの異なる部位で、垂直指向のピペットを皮質に挿入します。射出座標は、ブレグマ(mm)に対して:前1.5、横1.56、1.8、2.04、2.28である。硬膜に対する深さは(mm):1.5~1.7です。
  8. 噴射システムを使用して、0.05 μL/minの速度で希釈されていないウイルス溶液のサイトあたり0.3 μLを注入します。各注射後、ピペットを1分間所定の位置に置いてからゆっくりと引き出します(1mm/分)。
  9. ナイロン縫合糸で外科創傷を閉じることによって終わる。
  10. マウスをクリーンケージのヒーティングパッドに0.5〜1時間放置してから、元のケージに戻します。
  11. 急性脳スライスの調製前に6〜8週間、12時間の昼夜サイクルでマウスを維持します。
    注:細胞の損傷とシナプス損失をもたらす免疫反応を避けるために、複数のウイルス構造の注入は、一次注射後2〜3時間以内に同時に行う必要があります。iGluu注射の座標は、パキシノスとフランクリン29脳アトラスに従って選択されました。彼らはM1運動皮質に対応する。注入された脳の免疫染色は、多くのが、主によく孤立した軸索および軸索静脈を、ipsi-および反側線条体および反側M1およびS1皮質において可視化した。

2. グルタミン酸センサー iGlu u を発現するグルタマテル作動性端子の検索u

  1. キャリブレーションモード
    1. sCMOSカメラとカメラコントロールソフトウェアを次の設定で準備します。読み出しページでピクセル読み出し率を設定するピクセル読み出し率:560 MHz(=最速の読み出し率)、感度/ダイナミックレンジ:ビット、スプリアスノイズフィルタ:はい、オーバーラップ読み出し:はい。[ビニング/ROI]ページで、[全画面表示] を選択します。
    2. カバースリップの下に5 mg/mLルシファーイエロー(LY)の滴を含むガラススライドを準備します。
    3. LYスライドを63倍の目的の下に置き、レーザーシャッターを開き、次の設定を使用してシリアル取得を実行します:ピクセルビニング:1x1、トリガモード:内部、露光時間:最小(決定されます)。
    4. レーザーパワーを調整して、直径4μmの蛍光スポットを生成します(画像には飽和ピクセルを含めるべきではありません)。
    5. レーザー測位システムのキャリブレーションを実行するには、レーザーポジショニングソフトウェアで次の設定を選択します:スポットサイズ直径:10、走査速度:43.200 kHz。右側のパネルの[画像の取得開始] ボタンをクリックします。[実行数: 0、実行遅延: 0]を設定し、[シーケンス]ページで[TTLで実行]オプションを選択します。キャリブレーションページの「キャリブレーション」ボタンをクリックし、取得画面の左上隅に表示される指示に従ってレーザー制御ソフトウェアを調整します。
    6. セットアップは、カメラとレーザー制御のための独立したソフトウェアを使用している場合は、カメラ取得ウィンドウからスクリーンショットを取得し、XY座標の再計算のためのレーザー制御ソフトウェアに送信します。ソフトウェアが別のコンピュータにインストールされている場合は、ビデオグラバーを使用してレーザーコントロールソフトウェアに画像をインポートします。レーザー制御ソフトウェアには、XYスケーリングファクターとオフセットに関する情報が必要です。この目的のために、レーザー制御プログラムの取得ウィンドウ内の画像の左上、左下、右下の角の座標を決定します。X ファクター = (X 右下 – 左下 X)/2048、X オフセット = X 左下、Y ファクター = (Y 左上 – Y 左下)/2048、Y オフセット = Y のオフセット = Y 下左の式に従ってスケーリング係数を計算します。
    7. キャリブレーション手順の最後に、267x460 ピクセルの長方形の領域 (ROI) を作成し、画面の中央に移動して[シーケンス開始]ボタンをクリックします。
    8. 次のカメラコントロールソフトウェア設定に戻ります:ビニング: 2x2,トリガモード: 外部露光,露光時間: 最小 (決定されます).
  2. 自己蛍光補正モード
    注:アクティブシナプス端末の環境における[Glu]の安静レベルは、通常、100 nM 14、30、31、32、33、34未満です。14,30,31,32,33,34したがって、グルタミン酸の任意のセンサー、特にiGluuのような低親和性センサーは、シナプスグルタミン酸放出の不在時にはかなり薄暗くなる。それにもかかわらず、一部のiGluu蛍光は安静時に検出されることさえできるが、組織の自己蛍光と区別されなければならない。473 nmの照明は、iGluu蛍光と自己蛍光の両方を引き出す(図1A-C)。後者は広い波長範囲を占め、iGluu蛍光は480〜580nm(最大510 nm)に制限されています。自己蛍光の補正は、異なるハイパスフィルターを持つ2つの画像の取得に基づいています。
    1. 他の35に記載されているように、事前に脳スライスを準備します。ふすまのスライスを用意しておきなさい。
    2. スライスを記録チャンバーに移し、125 mM NaClを含む酸素化人工脳脊髄液(ACSF)に浸し、 3 mM KCl,1.25 mMNaH2PO4,25mM NaHCO3,2mM CaCl2,1mM MgCl2,10mMグルコース(pH 7.3,303 mOsm/L),0.5 mMナトリウムピルビン酸、2.8 mMアスコルビン酸ナトリウムおよび0.05mMMM流量は1~2 mL/minで、浴温は28~30 °Cに保ちます。
    3. 20倍の水浸しの目的の下で、後頭線を見つけます。白金のハープにナイロングリッドでスライスを固定し、組織の動きを最小限に抑えます。63x /NA 1.0 の水浸しの目的に切り替えます。473 nm(二色性鏡)で光を反射し、波長が510nm(エミッションフィルタ)で光を通過するフィルタを選択します。
    4. AD/DAボードを使用して、照明、刺激、画像取得をそれぞれの制御ソフトウェアと同期させます。180 msのレーザー露光時間と160 msの画像取得時間で取得を制御するトリガプログラムを設定します。 Scanning velocity Spot size
    5. 510 nmのハイパスフィルターを用いて自己蛍光とiGluu-positive構造の両方の画像を取得する(「黄色の画像」)。
    6. 600nmのハイパスフィルターを使用して自家蛍光だけで画像を取得する(「赤い画像」)。
    7. 赤と黄色の画像を、最も明るい 10 ピクセルと最も暗いピクセルの平均強度を使用して、範囲を定義します。減算 "黄色 - 赤い画像" を実行し、減算された画像を再スケールして標準の 8 ビット tif ファイルを生成し、対象の吹き出物を簡単に視覚化します (図 1D)。iGluu-positive構造からの明るいピクセル、背景からの灰色のピクセル、および自己蛍光を有する構造からの暗いピクセルが含まれています。
      注:与えられた機器では、平均安静蛍光(F)は700 A.U.を下回ります。
  3. ブートン検索モード
    注:iGluu-positiveピクセルは、異なる順序の軸索枝、分岐の部位、小胞枯渇後の静脈瘤、または完全に活性な静脈瘤など、軸索木の機能的に異なる要素に属し得る。しかし、視覚検査だけで機能的なシナプス端子を特定することはほとんど不可能です。したがって、各グルタミン酸シナプス末端は、電気脱分極に対する応答性による同定が必要です。刺激に反応しない部位は廃棄する必要があります。コルチコストリアス軸索からグルタミン酸放出を誘導する生理学的手段は、作用電位を惹起する。これは、適切なスペクトル特性のチャネルロドプシンを使用するか、iGluu自体によって視覚化された軸索の電気刺激によって達成することができる。偶発的なオプスの活性化を避けるために、我々は後者のアプリスターベートを好んだ
    1. マイクロピペットプーラー(4段階モード)を使用して、ホウケイ酸ガラス毛細血管から刺激ピペットを生成します。内部先端の直径は約1μmであるべきである。ACSFで充填した場合、電極抵抗は約10MΩでなければなりません。
    2. 同じ軸索に付着したシナプス・ブトンのセットからグルタミン酸の作用電位依存性放出を誘導するために、63倍の倍率、510 nmの発光フィルターおよび減算された画像を使用して、蛍光変動の隣にガラス刺激電極を配置する.追加の軸索の近接を避けてください。
    3. 刺激ピペットに脱分極電流パルスを供給するために刺激装置をオンにします。電流強度は2 μA(10 μA以下)の周りに使用してください。
    4. 1つのチャネルが標準的なバス溶液を提供し、他のチャネルがイオンチャネル、トランスポーターまたは膜受容体の必要なブロッカーを提供するマルチチャネルバスアプリケーションシステムをオンにします。記録部位の流れを制御し、テトロドトキシン(TTX)チャネル(浴液+1 μM TTX)に切り替えます。2-3分後、再び興味のあるブトンを刺激しますが、今はアクション潜在的な生成がない場合。放出は、電圧依存のカルシウムチャネルを介したカルシウム流入によるものである。
    5. 刺激器の強度キーを回すことによって、刺激電流を調整して、作用電位を介して引き出されるものと同様の応答を得る。通常、刺激電流は、0.5 msの脱分極では約6μAになります。
    6. 準備の基本的なテストのためには、0.5 mM CdCl2を適用する。このカルシウムチャネルブロッカーグルタミン酸放出の存在は、シナプスグルタミン酸放出を完全に防止し、それによって直接呼び起こされるグルタミン酸シグナルのカルシウム依存性を検証する。
      注: 以下の一般的な推奨事項は、線条体における単一シナプス実験の成功率を高める上で役立つ場合があります。無傷の放出機械を備えたグルタミン酸シナプス末端を選択するには、バリコシティが必要です: (i) 滑らかな紡錘のような形をしています;(ii) 軸索分岐と関連付けられていない。(iii) 「黄色の画像」上の他の構造よりも明るくなる。(iv) 線維路ではなく線条性ニューロピルに存在する。(v) 非常に細い軸索枝に常駐する。(vi) スライスのより深い部分内に存在しない。

3. グルタミン酸放出とクリアランスの可視化

  1. 録音モード
    注:自己蛍光の減算(ステップ2.2)と関心の発作の応答性のいくつかの初期テスト(ステップ2.3)の後、データの取得を開始することができます。単軸索末端からのグルタミン酸放出の電気的活性化に対する応答は、さらなる分析ツールを適用することなく、画像(図2)で直接観察することができる。しかし、シナプス性能の基本的な指標をすぐに抽出するのは非常に便利であることが判明しました(図3)。この情報は、特定の端末タイプの選択、HD関連の変更の迅速な評価、スーパーフュージョンシステムに適用される試験または薬物の数と頻度など、実験の後続のコースに関する決定を下すために必要です。また、最終的に出現するアーティファクトに対処する必要がある場合もあります。まず、データ記録の標準設定について説明します。
    1. 顕微鏡XYドライブを使用して、テストしたiGluu-陽性のバウトンをビューフィールドセンターの近くに置きます。取得中止ボタン で画像の取得を停止します。最後に取得した画像で、マウスの左ボタンでクリックして、静止した吹き出物の中心のXY位置を決定します。セットカーソルのXY座標は、取得ウィンドウの下部ステータスパネルに表示されます。
    2. キャリブレーションデータ(ステップ2.1.6)を用いて、iGluu蛍光の励起のためにレーザー光を送るべき部位の座標を計算する。X レーザー = X カメラ * X ファクター + X オフセット、Y レーザー = Y オフセット – Y カメラ * Y ファクターを使用します。この再計算を実行している間、カメラの垂直または水平フリップ設定に注意してください。
    3. 計算された座標を使用して、レーザー制御ソフトウェアで1点シーケンスを作成します。この目的のために、レーザー制御ソフトウェアのシーケンスページの「シーケンスに追加」ボックスで「点」を選択します。開始する遅延は10 μs、レーザーパルス時間は180ミリ秒を選択します。計算された座標にマウスを移動し、左ボタンをクリックします。
    4. レーザー制御ソフトウェアで次の設定を選択します:実行: 0,実行遅延: 0,シーケンス: TTLで実行します。次に、[シーケンスの開始] をクリックします。
    5. カメラコントロールソフトウェアで、次の設定を選択します:ビニング/ROIページで、画像領域: カスタム、ピクセルビニング: 2x2、高さ:20、幅:20、左:休息iGluu-正のX座標マイナス10px、下:休息iGluu-正のスポットから10px、取得モードのY座標:Kineシリーズ、Kinticシリーズ:Kineシリーズ、キネティックシリーズ:キネティックシリーズ、キネティックシリーズ:キネティックシリーズ、キネティックシリーズ:キネティックシリーズ、キニティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ、キニティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ、キニティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ、キニティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キニティックシリーズ:キナティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キネティックシリーズ:キニティックAcquisition Mode:Exposure Time0.0003744s(最小値)。このような設定では、取得レートは2.48 kHzになります。
    6. [トリガー モード: 外部] を選択します。カメラコントロールソフトウェアで[信号を取る]をクリックします。トリガーデバイス用に配置された実験プロトコルを開始します。
    7. 実験プロトコルトライアルを次のタイムラインで実装します: 0 ms - 開始試験, 1 ms – レーザー照明を開始, 20 ms – カメラで画像取得を開始, 70 ms – 開始電気刺激 1, 120 – 開始電気刺激 2, 181 ms – 試験を終了 (レーザーとカメラオフ).したがって、1回の試行中に、カメラは2.48 kHzの周波数で400フレームを取得します。ステップ 2.3.3 および 2.3.5 を参照してください。電気刺激の詳細については。
    8. シナプス前小胞プールの十分な回復を可能にするために、0.1 Hz以下の繰り返し周波数でプロトコルトライアルを適用します。
  2. 病理学的シナプスの同定のためのグルタミン酸一過性および迅速なグルタミン酸放出およびクリアランスの迅速な評価のオフライン構造
    1. 評価ルーチンをオンにします。ここでは、社内で書かれたソフトウェア SynBout v. 3.2 を使用します。(著者:アントン・ドヴォルザク)。図2のビデオのように、iGlu u蛍光が上昇したピクセルからのΔF/F過渡性を構築するには、以下の手順が必要です。
    2. ブトンサイズを確定するには、刺激開始前に、安静時ROI蛍光強度(F)の平均と標準偏差(SD)を計算する。F>平均 + 3 SD (図 3A)でピクセルで占める領域を決定し、ボックス化します。超閾値領域の円形形式を想定して仮想直径(μm)を決定します。
    3. ΔFをピーク強度値とFとの差として決定し、時間に対する刺激電流とΔF/Fをプロットする(図3B)。休養時ΔF/FのSD(刺激開始前)と「ピーク振幅」を計算します。ピークからの減衰に対してモノポエタクティポエタクティフィタフィッティングを実行するには、ΔF/Fの3SDを超えるピーク振幅を持つピクセルを使用します。ΔF/Fの減衰タウDの時定数を決定します。
    4. 特定のシナプスで「最大振幅」を推定するには、ΔF/F 値が最も高いピクセルを選択します。これは通常、安静時の吹奏口u蛍光の境界内または隣に位置する。「最大振幅」は、単一シナプスのクリアランス機械に提示されるグルタミン酸負荷の最良の指標であろう。
    5. iGluu信号の空間的な拡張を推定するには、仮想円を形成するために結合されたすべての超閾値ピクセルの面積の直径を決定します。それぞれの直径は「スプレッド」と呼ばれます。「ピークスプレッド」という用語は、次に、平均広がり過渡のピーク値を指します(図3C,点線赤線の差)。
  3. 可能なアーティファクトの修正
    メモ:電気脱分極は、ピペット内溶液の外側の流れに関連付けられます。これは、小さな組織変位をもたらす可能性があります.iGluuの刺激によって引き起こされる変化と画像の焦点外シフトを区別するために、次のアプローチを使用して変位アーティファクトを特定し、除去することができます(図4)。
    1. 変位の兆候を持つROIから得られる超閾値ピクセルの空間特性を解析する(図4F–H)。
    2. 静止時の最初に決定された境界の外側にあるピクセルを見つけます (図 4F–H、赤でボックス化)。
    3. 最終的に既存の負のピクセル強度値を特定します(図4I, J)。刺激前平均±3SDより大きい振幅を有する負方向のΔF/Fは、アーティファクトとみなされ、レコードは廃棄されるべきである。
    4. 焦点外のアーティファクトを避けるために、シナプス・ブトンの前部側側に刺激電極を置き、二相性電気刺激を使用し、刺激強度/持続時間を最小限に抑えます。
      注: フォーカス外のアーティファクトは、カメラから派生させることもできます。後者が顕微鏡に最適に固定されていない場合、それは振動を生成することができます, ほとんどのカメラ冷却システムの小さな振動に起因します.このような振動は、50 Hzの周波数で回転するΔF/F画像に「陰陽」パターンを作成します。振動は、蛍光信号から数学的に差し引くことができますが、測定の最終的な品質は記録時間に大きく依存します。
    5. 振動が存在しないような顕微鏡にカメラを固定します。後者が残っている場合は、カメラと顕微鏡アダプターの間にゴム製のガスケットを置きます。
      注:興味のあるシナプスの周りの線条体神経毛がiGluuを発現せず、したがって目に見えないままのグルタミン酸静脈瘤が含まれている可能性を無視することはできません。それらの共活性化の場合(TTXが存在しない場合にはより可能性が高い)、関心のあるブットンから得られた過渡は、こぼれ落ちる影響を受ける可能性があります。同じことが、焦点が合っていないuiGlu u-expressing端末にも当てはまります。この場合、蛍光過渡期は、より広い領域に由来する現象が特徴的です。この応答はTTXによって排除されるので、非不当な多繊維活性化によって誘発される非特異的応答として解釈することができる。
    6. この非特異的なマルチファイバ応答を修正するには、図 5に示す手順に従います。ビューフィールド境界でピクセルの蛍光信号を使用します。バックグラウンド応答を最小限に抑えるには、刺激の強度と持続時間を最小限に抑えるか、TTXを使用してください。

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結果

2種類のコルチコストリアタール酸筋性静脈瘤の同定
IT および PT の afferent は、それぞれレイヤ 2/3 と 5 に由来し、イプシラショナルおよび逆側 (IT 端末のみ) 線条体に差異的な影響と終了パターンを示します。運動の開始の間に観察される反復的な活性化条件下でのグルタミン酸放出およびクリアランスの特性についてはまだほとんど知られていないが、それぞれのグルタミン?...

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ディスカッション

実験は、シナプス依存性と神経変性の過程におけるシナプスの損失の可能性という一般的な関心の問題に関するものであり、我々は、老化した(>1年)マウスからの急性脳切片の影響を受けたシナプスを同定するための新しいアプローチを記述する。最近導入されたグルタミン酸センサiGluuの改善された運動特性を利用して、シナプスグルタミン酸放出と取り込みとの関係を以前は不可?...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、CHDI(A-12467)、ドイツ研究財団(Exc 257/1およびDFGプロジェクトID 327654276 - SFB 1315)、シャリテの壁内研究基金によって支援されました。K.テレク、セントジョージズ、ロンドン大学、N.ヘラッサ(リバプール大学)に感謝します。uD.ベタンスとA.シェーンヘルは優れた技術支援を提供しました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Stereo microsopeWPIPZMIIIPrecision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frameStoelting51500DDigital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipmentStoelting514439VForedom K1070 cromoter Kit
Injection systemStoelting53311Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µlHamilton8793075RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning systemRapp OptoElectronicUGA-40UGA-40
Blue laser for iGluu excitationRapp OptoElectronicDL-473-020-S473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nmRapp OptoElectronicROE TB-355-405-473Dichroic
1P upright microscopeCarl Zeiss000000-1066-600Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0Carl Zeiss421480-9900W Plan-Apochromat
4x objectiveCarl Zeiss44-00-20Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluuOmega opticalXF2030
Emission filter for iGluuOmega opticalXF3086
Dichroic mirrorOmega opticalQMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr.Omega opticalQMAX EM600-650
sCMOS cameraAndorZYLA4.2PCL10ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition softwareAndor4.30.30034.0Solis
AD/DA converterHEKA Elektronik895035InstruTECH LIH8+8
Aquisition softwareHEKA Elektronik895153TIDA5.25
Electrode positioning systemSutter InstrumentMPC-200Micromanipulator
Electrical stimulatorCharite workshopsSTIM-26
SlicerLeicaVT1200 SVibrotome
Brown/Flaming-type pullerSutter InstrSU-P1000P-1000
Glass tubes for injection pipettesWPI1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettesWPIR100-F3
TetrodotoxinAbcamab120054TTX
iGluu plasmidAddgene106122pCI-syn-iGluu
Q175 miceJackson Lab27410Z-Q175-KI

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