Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يسلط هذا التقرير الضوء على المتطلبات الزمنية لعزل الحويصلات خارج الخلية (EV) عن الميكروجليا أو الضامة الدموية. تم تقييم المركبات الكهربائية المشتقة من Microglia كجهات تنظيمية للنمو النيوريفي في حين تمت دراسة المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة الدم في السيطرة على غزو خلايا الدبقي C6 في الاختبارات المختبرية. والهدف هو فهم أفضل لهذه الوظائف EV كوسطاء المناعة في بيئات دقيقة محددة.

Abstract

تلعب الحالة العصبية العصبية للجهاز العصبي المركزي (CNS) دورًا رئيسيًا في الحالات الفسيولوجية والمرضية. Microglia، والخلايا المناعية المقيمة في الدماغ، وأحيانا الضامة المشتقة من نخاع العظم التسلل (BMDMs)، وتنظيم الشخصية الالتهابية من بيئتها الدقيقة في الجهاز العصبي المركزي. ومن المسلم به الآن أن الحويصلات خارج الخلية (EV) السكان من الخلايا المناعية بمثابة وسطاء المناعة. وبالتالي، فإن جمعها وعزلها مهمان لتحديد محتوياتها ولكن أيضا تقييم آثارها البيولوجية على الخلايا المتلقية. تسلط البيانات الحالية الضوء على المتطلبات الزمنية لعزل EV من خلايا microglia أو الضامة الدموية بما في ذلك خطوات الترفيع والكروماتوغرافيا للحجم الاستبعاد (SEC). وسمح تحليل بروتوميلي غير مستهدف بالتحقق من صحة توقيعات البروتين كعلامات EV ووصف محتويات EV النشطة بيولوجياً. كما استخدمت المركبات الكهربائية المشتقة من الميكروجليا وظيفيا على الثقافة الأولية للخلايا العصبية لتقييم أهميتها كوسطاء المناعة في نمو neurite. وأظهرت النتائج أن المركبات الكهربائية المشتقة من الميكروغليا تساهم في تسهيل نمو النيورايت في المختبر. في موازاة ذلك، تم استخدام المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة الدم وظيفيا كوسطاء مناعية في الثقافات الكروية لخلايا الورم الدبقي C6، وتظهر النتائج أن هذه المركبات الكهربائية تتحكم في غزو خلايا الورم الدبقي في المختبر. يسلط هذا التقرير الضوء على إمكانية تقييم وظائف الخلايا المناعية بوساطة EV ولكن أيضًا فهم الأسس الجزيئية لمثل هذا الاتصال. يمكن أن يعزز هذا فك التشفير استخدام الحويصلات الطبيعية و / أو الإعداد في المختبر للحويصل العلاجية من أجل تقليد الخصائص المناعية في البيئة الدقيقة لباثولوجيا CNS.

Introduction

ترتبط العديد من الأمراض العصبية بحالة الالتهاب العصبي وهي آلية معقدة يتم النظر فيها بشكل متزايد ، ولكنها لا تزال غير مفهومة بشكل جيد لأن العمليات المناعية متنوعة وتعتمد على بيئة الخلية. في الواقع ، لا تنطوي اضطرابات الجهاز العصبي المركزي بشكل منهجي على نفس إشارات التنشيط وخلايا الخلايا المناعية ، وبالتالي يصعب تقييم الاستجابات المؤيدة أو المضادة للالتهابات كأسباب أو عواقب للأمراض. الضامة المقيمين في الدماغ ودعا "microglia" ويبدو أن في واجهة بين الجهاز العصبي والجهاز المناعي1. Microglia لها أصل النخاع وتستمد من كيس صفار خلال الهيماتوبوسيات البدائية لاستعمار الدماغ، في حين يتم اشتقاق الضامة المحيطية من الكبد الجنيني خلال الهيماتوبوسيات النهائية لتصبح الضامة الطرفية2. الخلايا microglia التواصل مع الخلايا العصبية والخلايا الدبقية المستمدة من الخلايا العصبية مثل الخلايا الفلكية وoligodendrocytes3. وقد أظهرت العديد من الدراسات الحديثة أن microglia تشارك في اللدونة العصبية خلال تطوير الجهاز العصبي المركزي وتناط الأنسجة الكبار، وأيضا في حالة التهابية المرتبطة الأمراض العصبية التنكسية4,,5. خلاف ذلك ، يمكن أن تتعرض سلامة حاجز الدم في الدماغ للخطر في أمراض CNS الأخرى. الاستجابات المناعية، وخاصة في سرطان الورم الأرومي الدبقي المتعدد، لا تدعمها فقط خلايا microglia كما يتم إعادة تنظيم حاجز الدم في الدماغ من خلال العمليات الوعائية ووجود الأوعية اللمفاوية6,7. لذلك ، يحدث تسلل كبير مشتق من نخاع العظم (BMDMs) في ورم الدماغ في جميع أنحاء آليات تولد الأوعية المعتمدة على الورم8. الخلايا السرطانية ممارسة تأثير كبير على BMDMs تسلل مما يؤدي إلى خصائص مثبطة للمناعة ونمو الورم9. وبالتالي فإن الاتصال بين الخلايا المناعية والبيئة الدقيقة في الدماغ من الصعب فهمه حيث أن أصل الخلية وإشارات التنشيط متنوعة10،11. ومن ثم فمن المثير للاهتمام للقبض على وظائف التوقيعات الجزيئية المرتبطة بالخلايا المناعية في الظروف الفسيولوجية. في هذا الصدد ، يمكن دراسة الاتصال بين الخلية بين الخلايا المناعية والبيئة الدقيقة للخلايا من خلال إطلاق الحويصلات خارج الخلية (EVs).

ويجري دراسة المركبات الكهربائية أكثر وأكثر في تنظيم وظائف المناعة في الظروف الصحية وكذلك المرضية12,13. يمكن أن تؤخذ في الاعتبار اثنين من السكان، الاكسوسومات وmicrovesicles. أنها تقدم مختلف biogenesis وحجم النطاقات. الاكسوزوات هي الحويصلات من ~ 30-150 نانومتر القطر ويتم إنشاؤها من النظام endosomal ويفرز ها خلال الانصهار من الهيئات متعددة المركبات (MVBs) مع غشاء البلازما. يبلغ قطر الميكروفيكسيخ حوالي 100-1000 نانومتر ويتم إنشاؤها من قبل الخارج الناشئة من غشاء بلازما الخلية14. لأن التمييز الخارجية مقابل الميكروفيكجل لا يزال من الصعب تحقيقه وفقا للحجم والأنماط الجزيئية، فإننا سوف تستخدم فقط مصطلح المركبات الكهربائية في هذا التقرير. يمثل الاتصال المرتبط بـ EV في الجهاز الوطني للأمراض الآلية الموروثة منذ أن أظهرت الدراسات مشاركتها في الأنواع اللافقارية بما في ذلك الديدان الخيطية أو الحشرات أو الأنليد15،16. وعلاوة على ذلك، فإن النتائج التي تبين أن المركبات الكهربائية يمكن التواصل مع الخلايا من أنواع مختلفة تثبت هذه الآلية لتكون نظام قفل المفتاح، على أساس أولا على التعرف على الجزيء السطحي بين الحويصلات والخلايا المتلقية ومن ثم السماح للاستفادة من الوسطاء16،17. في الواقع ، تحتوي المركبات الكهربائية على العديد من الجزيئات مثل البروتينات (على سبيل المثال ، الإنزيمات ، نقل الإشارة ، عامل التكوين الحيوي) ، الدهون (على سبيل المثال ، السيراميد ، الكوليسترول) أو الأحماض النووية (على سبيل المثال ، الحمض النووي ، مرنا أو ميرنا) التي تعمل كجهات تنظيمية مباشرة أو غير مباشرة لأنشطة الخلية المتلقية14. هذا هو السبب في إجراء دراسات منهجية أيضا على الخلايا المناعية لعزل المركبات الكهربائية وتوصيف تماما توقيعاتالبروتين18,19.

أظهرت الدراسات الأولى الإفراج عن الاكسوزوات من الميكروجليا الفئران المستزرعة الأولية كآلية لا يمكن اختزالها بعد تفعيل Wnt3a- أو السيروتونين المعتمدة20,21. وظيفيا في CNS, microglia المستمدة من المركبات الكهربائية تنظيم الإفراج عن الحويصلات متشابك من قبل المحطات presynaptic في الخلايا العصبية التي تسهم في السيطرة على الخلايا العصبية excitability22,23. يمكن أن تنشر المركبات الكهربائية المشتقة من Microglia أيضًا استجابة التهابية بوساطة السيتوكينات في مناطق الدماغ الكبيرة24،25. الأهم من ذلك، قد ligands متنوعة لعائلة مستقبلات مثل حصيلة تنشيط إنتاجات محددة من السيارات الكهربائية في microglia26. على سبيل المثال، في الدراسات المختبرية تظهر أن LPS تنشيط microglia BV2 خطوط الخلية تنتج محتويات EV التفاضلية بما في ذلك السيتوكينات الموالية للالتهابات27. ولذلك، فإن التنوع الوظيفي للمجموعات الفرعية للخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي، والميكروغليا وأجهزة إدارة المباني المتسللة، يمكن تقييمه من خلال مجموعاتهم EV الخاصة بما في ذلك تأثير EV على الخلايا المتلقية وتحديد محتويات EV.

لقد وصفنا سابقا طرق لتقييم الخصائص الوظيفية لـ microglia - و BMDM المشتقة من المركبات الكهربائية بعد عزلتها16،19. في هذا التقرير، نقترح إجراء تقييم مستقل لتأثير المركبات الكهربائية المشتقة من الميكروغليا على نمو النيورايت، وتأثير المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة على التحكم في مجاميع خلايا الورم الدبقي. تقترح هذه الدراسة أيضًا تحليلًا واسعًا للبروتوميميك لكسور EV من أجل التحقق من صحة إجراء عزل EV بالإضافة إلى تحديد توقيعات البروتين النشط بيولوجيًا. يمكن أن تساعد الآثار المفيدة وفك الرموز الجزيئية لمحتويات EV في التلاعب المحتمل واستخدامها كعوامل علاجية في اضطرابات الدماغ.

Protocol

1. الثقافة الأولية من Microglia / الضامة

  1. الثقافة الأولية للميكروجليا
    1. الاستزراع التجاري للفئران الميكروجليا الأولية (2 × 106 خلايا) (انظر جدول المواد)في متوسط النسر المعدل في دولبيككو (DMEM) المكمل بمصل خال من الاكسوسوم بنسبة 10٪، و 100 U/mL من البنسلين، و 100 ميكروغرام/مل العقدية، و9.0 جرام/لتر عند 37 درجة مئوية و5% CO2.
    2. جمع المتوسطة مشروطة بعد ثقافة 48 ح والمضي قدما في عزلة المركبات الكهربائية.
  2. الثقافة الأساسية للالضامة
    1. الاستزراع التجاري للفئران الضامة الأولية (1 × 106 خلايا) في الوسط الذي توفره الشركة المصنعة (انظر جدول المواد)عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2، مع مصل خال من الاكسوسوم.
    2. جمع المتوسطة مشروطة بعد ثقافة 24 ساعة والمضي قدما إلى عزل المركبات الكهربائية.

2- عزل المركبات الكهربائية

  1. ما قبل العزل ة للمركبات الكهربائية من المتوسط المكيف
    1. نقل وسيط الثقافة المكيفة من الثقافات microglia أو الضامة (الخطوات 1.1.2 أو 1.2.2) إلى أنبوب مخروطي.
    2. الطرد المركزي في 1200 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لبيليه الخلايا.
    3. نقل supernatant إلى أنبوب مخروطي جديد. الطرد المركزي في 1200 × غرام لمدة 20 دقيقة في RT للقضاء على الأجسام المبرمجة.
    4. نقل supernatant إلى أنبوب البولي 10.4 مل ونقل الأنبوب إلى 70.1 تي الدوار. Ultraالطرد المركزي في 100،000 × ز لمدة 90 دقيقة في 4 درجة مئوية لبيليه المركبات الكهربائية.
    5. تخلص من supernatant وإعادة تعليق بيليه التي تحتوي على المركبات الكهربائية في 200 ميكرولتر من 0.20 ميكرومتر تصفية الفوسفات المالحة المخزنة (PBS).
  2. عزل المركبات الكهربائية
    1. إعداد العمود اللوني للحجم المحلي (SEC)
      1. إفراغ عمود كروماتوغرافي زجاجي (الطول: 26 سم؛ قطره: 0.6 سم) (انظر جدول المواد)،اغسله وتعقيمه.
      2. ضع فلتر 60 ميكرومتر في أسفل العمود.
      3. قم بتكديس العمود بمصفوفة قاعدة الترشيح لهلام agarose المترابطة لإنشاء مرحلة ثابتة قطرها 0.6 سم وارتفاع 20 سم.
      4. شطف المرحلة مع 50 مل من 0.20 ميكرون تصفية PBS. تخزين في 4 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق إذا لزم الأمر.
    2. ضع بيليه EV المُعيد تعليقه فوق المرحلة الثابتة لعمود SEC.
    3. جمع 20 كسور متتابعة من 250 ميكرولتر مع الاستمرار في إضافة 0.20 ميكرومتر تصفية PBS على الجزء العلوي من المرحلة الثابتة لمنع تجفيف العمود. تخزين الكسور في -20 درجة مئوية إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: يمكن إجراء تخزين أطول من أسبوع واحد عند -80 درجة مئوية للحفاظ على سلامة EV للتحليل الجزيئي.
  3. مصفوفة بمساعدة الليزر التأيوّت التأيّم (MALDI) تحليل الطيف الكتلي للكسور SEC
    1. انتقل إلى العزلEV كما هو موضح في القسم 2.2.
    2. إعادة تعليق بيليه EV مع 200 ميكرولتر من محلول مزيج معايرة الببتيد (انظر جدول المواد).
    3. انتقل إلى جمع EV كما هو موضح في الأقسام 2.2.1 إلى 2.2.3.
    4. تجفيف تماما كسر مع مكثف فراغ.
    5. إعادة تشكيل الكسور مع 10 ميكرولتر من 0.1٪ حمض تريفلورواسيك (TFA).
    6. اخلط 1 ميكرولتر من الكسر المعاد تشكيله مع 1 ميكرولتر من مصفوفة حمض α-cyano-4-hydroxycinnamic (HCCA) على لوحة هدف فولاذمصقول MALDI.
    7. تحليل جميع الكسور مع مطياف كتلة MALDI.
    8. تحليل الطيف المتولد مع برامج مخصصة (انظر جدول المواد).

3- توصيف المركبات الكهربائية

  1. تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)
    ملاحظة:     يتم إجراء تحليل NTA باستخدام أداة تحليل تتبع الجسيمات النانوية (انظر جدول المواد)ومضخة حقنة آلية.
    1. جعل تخفيف (نطاق 1:50 إلى 1:500) من كل كسر SEC من الخطوة 2.2.3 مع 0.20 ميكرون تصفية PBS.
    2. دوامة الحل للقضاء على المجاميع EV.
    3. وضع الحل المخفف في حقنة 1 مل ووضعه في مضخة حقنة الآلي.
    4. ضبط إعداد الكاميرا إلى مستوى كسب الشاشة (3) ومستوى الكاميرا (13).
    5. انقر على تشغيل وإطلاق السيناريو التالي.
      1. تحميل العينة في غرفة التحليل (معدل التسريب: 1000 ل15 سنة).
      2. تقليل واستقرار تدفق السرعة لتسجيل الفيديو (معدل التسريب: 25 لـ 15 s). التقاط ثلاثة أشرطة فيديو متتالية 60 s من تدفق الجسيمات.
      3. ضبط مستوى الكاميرا (13) وعتبة الكشف (3) قبل تحليل مقاطع الفيديو. انقر على الإعدادات| موافق لبدء التحليل وانقر على تصدير عندما يتم التحليل.
    6. بين كل تحليل كسر، يغسل مع 1 مل من 0.20 ميكرون تصفية PBS.
  2. تحليل المجهر الإلكتروني (EM)
    1. عزل المركبات الكهربائية كما هو موضح في القسم 2.
      ملاحظة: الشروط العقيمة غير مطلوبة.
    2. كرر القسم 3.1 لتحديد المركبات الكهربائية.
      ملاحظة: سيتم استخدام الكسور الإيجابية فقط لتحليل EM.
    3. استخدم فلتر 50 kDa centrifugal (انظر جدول المواد)لتركيز كسور SEC المحتوية على EV.
    4. إعادة تعليق المركبات الكهربائية المركزة في 30 ميكرولتر من 2٪ من بارافورمالديهايد (PFA).
    5. قم بتحميل 10 ميكرولتر من العينة على شبكة نحاسية مغلفة بالكربون.
    6. احتضان لمدة 20 دقيقة في بيئة مبللة.
    7. كرر الخطوات 3.2.5 و 3.2.6 لامتصاص جيد للعينة على الشبكة.
    8. نقل الشبكة إلى انخفاض 1٪ غلوتارالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقيقة في RT.
    9. غسل العينة بالماء الترافيس عدة مرات.
    10. تباين العينة لمدة 10 دقيقة على الجليد مع خليط من خلات uranyl 4٪ و 2٪ ميثيل سيلولوز (1:9، v/v). إزالة فائض من الخليط باستخدام ورقة تصفية.
    11. تجفيف العينة ومراقبتها تحت المجهر الإلكتروني ناقل الحركة في 200 كيلو فولت (انظر جدول المواد).
  3. تحليل لطخة الغربية
    1. استخراج البروتين
      1. كرر الخطوات 3.2.1 إلى 3.2.3 لعزل المركبات الكهربائية وتركيزها.
      2. مزيج 50 ميكرولتر من العازلة RIPA (150 mm كلوريد الصوديوم [NaCl], 50 mM تريس, 5 mM الإيثيلين غليكول-بيس (2-أمينوثليتر)-N, N, N′, N′-حمض tetraacetic [EGTA], 2 mM حمض Ethylenediamine-tetraacetic [EDTA], 100 mM فلوريد الصوديوم [NaF], 10 mm الصوديوم بيروفوسفات, 1% Nonidet P-40, 1 mM Phenylmethanesulfonyl فلوريد [PMSF], 1x مثبط البروتياز) مع عينة EV (25 ميكرولتر الناتجة عن تركيز EV على مرشح) لمدة 5 دقائق على الجليد
      3. Sonicate لمدة 5 ق (السعة: 500 W؛ التردد: 20 كيلو هرتز)، 3 مرات على الجليد.
      4. إزالة حطام المركبات عن طريق الطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 10 دقيقة، في 4 درجات مئوية.
      5. جمع supernatant وقياس تركيز البروتين مع برادفورد طريقة قياس البروتين.
    2. الصوديوم dodecyl كبريتات البولياكريلاميد هلام electrophoresis (SDS-PAGE) والنشاف الغربي
      1. خلط مستخلصات البروتين (30 ميكروغرام) مع 5c Laemmli عينة عازلة (v / v).
      2. تحميل مزيج البروتين على هلام البولياكريلاميد 12٪.
      3. قم بترحيل البروتينات في الجل مع حاجز TGS (25 mM Tris pH 8.5 و 192 mM Glycine و 0.1٪ SDS) ، بسعر 70 V لمدة 15 دقيقة و 120 V لمدة 45 دقيقة.
      4. نقل البروتينات على غشاء النيتروسيللوز مع نظام شبه جاف في 230 V لمدة 30 دقيقة.
      5. تشبع الغشاء لمدة 1 ساعة في RT مع حظر المخزن المؤقت (0.05٪ Tween 20 ث / في، 5٪ مسحوق الحليب ث / في في 0.1 M PBS، درجة الحموضة 7.4).
      6. احتضان الغشاء بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع الماوس أحادي النسيلة المضادة للحرارة صدمة البروتين 90 (HSP90) الأجسام المضادة المخففة في سد العازلة (1:100).
      7. غسل الغشاء ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني-Tween (PBS، 0.05٪ Tween 20 ث / v) لمدة 15 دقيقة.
      8. احتضان الغشاء لمدة 1 ساعة في RT مع الفجل الماعز peroxidase-الاقتران المضادة للفأرة الأجسام المضادة للفأرة الأجسام المضادة الثانوية IgG المخفف في منع العازلة (1:10,000).
        ملاحظة: يتم إجراء عنصر تحكم سلبي باستخدام الأجسام المضادة الثانوية وحدها.
      9. كرر خطوة الغسيل (الخطوة 3.3.2.7).
      10. الكشف عن الغشاء مع تعزيز chemiluminescence (ECL) مجموعة الركيزة النشاف الغربية (انظر جدول المواد).
  4. تحليل البروتينات
    1. استخراج البروتين والهضم في هلام
      1. كرر الخطوات 3.2.1 إلى 3.2.3 لعزل المركبات الكهربائية وتركيزها. كرر الخطوة 3.3.1 لاستخراج البروتين EV.
      2. إجراء هجرة البروتين في هلام التراص من هلام البولياكريلاميد 12٪.
      3. إصلاح البروتينات في هلام مع الأزرق coomassie لمدة 20 دقيقة في RT.
      4. استئصال كل قطعة هلام ملونة وقطع عليه إلى قطع صغيرة من 1 ملم3.
      5. غسل قطع هلام على التوالي مع 300 ميكرولتر من كل الحلول: المياه فائقة النقاء لمدة 15 دقيقة، 100٪ أسيتونتريل (ACN) لمدة 15 دقيقة، 100 mm بيكربونات الأمونيوم (NH4HCO3)لمدة 15 دقيقة، ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1، v/v) لمدة 15 دقيقة، و 100٪ ACN لمدة 5 دقيقة مع التحريك المستمر.
      6. الجافة تماما هلام القطع مع فراغ المكثف.
      7. إجراء تخفيض البروتين مع 100 ميكرولتر من 100 mM NH4HCO3 تحتوي على 10 mm dithiothreitol لمدة 1 ساعة في 56 درجة مئوية.
      8. إجراء الألكيلية البروتين ية مع 100 ميكرولتر من 100 mM NH4HCO3 تحتوي على 50 mm iodoacetamide لمدة 45 دقيقة في الظلام في RT.
      9. غسل قطع هلام على التوالي مع 300 ميكرولتر من كل حل: 100 mM من NH4HCO3 لمدة 15 دقيقة، ACN:20 mM NH4HCO3 (1:1، v/v) لمدة 15 دقيقة، و 100٪ ACN لمدة 5 دقيقة مع التحريك المستمر.
      10. تجفيف تماما قطع هلام مع مكثف فراغ.
      11. إجراء هضم البروتين مع 50 ميكرولتر من التربسين (12.5 ميكروغرام / مل) في 20 mM NH4HCO3 بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
      12. استخراج البروتينات المهضومة من هلام مع 50 ميكرولتر من 100٪ ACN لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية ثم 15 دقيقة في RT مع التحريك المستمر.
      13. كرر إجراءات الاستخراج التالية مرتين: 50 ميكرولتر من 5٪ TFA في 20 mNH4HCO3 حل لمدة 20 دقيقة مع التحريك المستمر.
      14. أضف 100 ميكرولتر من ACN 100% لمدة 10 دقيقة مع التحريك المستمر.
      15. البروتينات الجافة المهضومة مع مكثف فراغ وإعادة تعليق في 20 ميكرولتر من 0.1٪ TFA.
      16. Desalt العينة باستخدام تلميح ماصة 10 ميكرولتر مع C18 وسائط المرحلة العكسية لإزالة الملح وتركيز الببتيدات (انظر جدول المواد)والببتيدات الملتلة مع حمض الفورميك ACN:0.1٪ (FA) (80:20، v/v).
      17. تجفيف العينة تماما مع مكثف فراغ وإعادة تعليق في 20 ميكرولتر من ACN:0.1٪ FA (2:98، v/v) لكروماوغرافيا الطيفية الكتلة جنبا إلى جنب السائل (LC-MS/MS).
    2. تحليل LC-MS/MS
      1. تحميل الببتيد المهضوم في أداة LC-MS/MS وإجراء تحليل العينة والبيانات وفقا للمعلمات الموضحة بالتفصيل في مكان آخر42.
    3. تحليل البيانات الخام
      1. معالجة بيانات قياس الطيف الكتلي لتحديد البروتينات ومقارنة البروتينات المحددة لكل عينة مع حزمة برامج proteomics الكمية باستخدام المعلمات القياسية.
      2. التصدير ، وذلك باستخدام المعايير القياسية ، وقائمة من البروتينات الحصرية والممثلة تمثيلا زائدا من عينات إيجابية EV في برنامج التنبؤ شبكات البروتين والعمليات البيولوجية.
      3. قارن قائمة البروتينات المحددة في الكسور مع أعلى 100 علامات EV من قاعدة بيانات الوصول المفتوح Exocarta (انظر جدول المواد).

4. الكهربائية الفنية آثار القول

  1. Neurite outgrowth القول على خط الخلية PC-12
    1. ثقافة PC12 خط الخلية في كامل DMEM المتوسطة (2 mM L-الجلوتامين, 10% مصل حصان الجنين (FHS), 5% مصل البقر الجنين (FBS), 100 UI/mL البنسلين, 100 ميكروغرام/مل العقديات).
      ملاحظة: السيرا هي exosome الحرة في الإجراء كله.
    2. إضافة كوب غطاء (جميع الآبار) إلى لوحة 24 بئر؛ معطف لوحة مع بولي د-ليسين (0.1 ملغ / مل) والبذور 260،000 الخلايا / جيدا.
    3. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
    4. بعد 24 ساعة من الحضانة، قم بتغيير متوسط التمايز المتوسط إلى DMEM (DMEM مع 2 mM L-الجلوتامين، 0.1٪ FHS، 100 UI/mL البنسلين، 100 ميكروغرام/مل العقدية) مع 1 × 106 ميكروجليا EVs (من الخطوة 1.1.2).
      ملاحظة: يتم تنفيذ حالة التحكم بدون أجهزة السيارات الكهربائية الدقيقة في وسط التمايز.
    5. في اليوم 4 بعد البذر، تحميل جميع الآبار مع 100 ميكرولتر من المتوسط DMEM كاملة.
    6. في اليوم 7 بعد البذر، إصلاح الخلايا مع 4٪ PFA لمدة 20 دقيقة في RT وشطف ثلاث مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع برنامج تلفزيوني.
    7. وصمال الخلايا بالرودامين المترافق ة بالبالويدين لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية وشطف 3 مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع برنامج تلفزيوني.
    8. وصمال الخلايا مع هويشت المخفف 33342 (1:10,000) لمدة 30 دقيقة في RT وشطف 3 مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع برنامج تلفزيوني.
    9. قم بتركيب زجاج الغطاء على شريحة مع متوسط تصاعد الفلورسنت (انظر جدول المواد).
    10. تحليل الشريحة مع المجهر confocal، واتخاذ 5 صور عشوائية من كل شريحة.
    11. قياس نمو النيوتنيباستخدام برنامج قياس كمي آلي (إجمالي طول النيوريت) كما هو موضح بالتفصيل في مكان آخر43.
  2. نيوريت خارج النمو على الخلايا العصبية الأولية الفئران
    1. معطف شريحة زجاجية 8 بئر مع بولي د-ليسين (0.1 ملغ/مل) واللامينين (20 ميكروغرام/مل).
    2. الخلايا العصبية الأولية التجارية الثقافة الفئران في الثقافة المناسبة المتوسطة (انظر جدول المواد)عن طريق الطلاء 50،000 الخلايا لكل بئر واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 ل 48 ساعة.
      ملاحظة: السيرا خالية من الاكسوسوم في الإجراء بأكمله.
    3. إضافة 1 × 106 microglia EVs إلى الخلايا العصبية ثقافة المتوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة أكثر.
      ملاحظة: يتم تنفيذ حالة التحكم دون microglia EVs في وسط ثقافة الخلايا العصبية.
    4. اتبع الخطوات 4.1.6 إلى 4.1.9 لإصلاح ووصمة عار الخلايا.
    5. اتبع الخطوات 4.1.10 و 4.1.11 لتحليل الشريحة.
  3. غزو خلية غليوما
    1. إعادة تعليق خلايا الدبقي للفئران C6 في متوسط DMEM الكامل (DMEM مع FBS 10٪، 2 mM L-الجلوتامين، 1x المضادات الحيوية) تحتوي على الكولاجين 5٪ بتركيز نهائي من 8000 خلية في 20 ميكرولتر.
      ملاحظة: السيرا خالية من الاكسوسوم في الإجراء بأكمله.
    2. ضع 5 مل من PBS في الجزء السفلي من طبق زراعة الأنسجة 60 مم. عكس قطرات الغطاء والإيداع من 20 ميكرولتر (8000 خلية) من تعليق الخلية على الجزء السفلي من الغطاء.
    3. عكس الغطاء على غرفة أسفل PBS مليئة واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 72 ساعة حتى يتم تشكيل spheroids الخلية.
    4. أضف 1 × 108 وحدات EVs الضامة (من الخطوة 1.2.2) إلى خليط الكولاجين 2.2 ملغم/مل (2 مل من محلول الكولاجين البقري من النوع الأول [3 ملغ/مل] مع 250 ميكرولتر من الحد الأدنى المتوسط الأساسي 10x (MEM) و500 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M.
      ملاحظة: يتم تنفيذ حالة التحكم بدون أجهزة EVs الضامة في خليط الكولاجين.
    5. توزيع خليط الكولاجين الذي يحتوي على EVs في لوحة 24 بئر لتضمين spheroids الخلية.
    6. زرع الخلايا التي شكلت حديثا spheroids في وسط كل بئر.
    7. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لترسيخ هلام.
    8. بعد ذلك ، تراكب 400 ميكرولتر من متوسط DMEM الكامل على مصفوفة الكولاجين في كل بئر.
    9. احتضان النظام الكامل لما مجموعه 6 أيام في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      ملاحظة: يتم رصد غزو الخلية للخروج من spheroid عن طريق التصوير الرقمي باستخدام المجهر الخفيف المقلوب باستخدام هدف 4x/0.10 N.A.
    10. الحصول على صور كل بئر كل يوم.
    11. معالجة الصور وكمية غزو مناطق الخلايا spheroid باستخدام البرنامج كما وصفت سابقا في التفاصيل42.
      ملاحظة: تم تطبيع مناطق الغزو والسفيرويد لكل يوم للغزو ومناطق السفيرويد التي تم قياسها في اليوم 0.

النتائج

أحد التحديات الرئيسية لعزو الآثار البيولوجية إلى الحويصلات خارج الخلية (EVs) هو القدرة على عزل المركبات الكهربائية من وسط الثقافة بأكملها. في هذا التقرير، نقدم طريقة باستخدام ultracentrifugation (UC) والكروماتوغرافيا حجم الاستبعاد (SEC) التي يقترن التحليل على نطاق واسع من توقيعات البروتين للتحقق من عل...

Discussion

الجهاز العصبي المركزي (CNS) هو نسيج معقد ينظم فيه الاتصال من خلية إلى خلية وظائف الخلايا العصبية العادية اللازمة لـ التوازن30. تتم الآن دراسة المركبات الكهربائية على نطاق واسع ووصفها بأنها شحنات جزيئية مهمة للاتصال من الخلية إلى الخلية31. أنها توفر على وجه التحديد م?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ودعمت الأعمال المقدمة كل من المجلس الوطني للتعليم، وشركة "إنسيرينمنت" و"دي لا ريتشرشي"، و"إنسيرم". ونحن ننوه بامتنان لمنشأة المدينة العلمية BICeL- الحرم الجامعي للوصول إلى الأدوات والنصائح التقنية. ونعترف بامتنان بجان - باسكال جيمينو، وسليمان أبووار، وإيزابيل فورنييه على المساعدة في قياس الطيف الجماهيري. ونحن ننوه بامتنان لتانينا عرب، وكريستيل فان كامب، وفرانسواز لو ماريك - كروك، وجاكوبو فيزيولي، وبيير إريك ساوتيير لمساهمتهم القوية في التطورات العلمية والتقنية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-rad4561045EDU 
AcetonitrileFisher ChemicalsA955-1 
Amicon 50 kDa centrifugal filterMerckUFC505024 
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich9830 
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659)Santa-cruzsc-13119 
B27 Plus supplementGibcoA3582801 
BenchMixer V2 Vortex MixerBenchmark ScientificBV1003 
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)Bio-Rad5000006 
C18 ZipTipsMerck MilliporeZTC18S096 
C6 rat glioma cellATCCATCC CCL-107 
Canonical tubesSarstedt62.554.002 
CentrifugeEppendorf5804000010 
CO2 IncubatorThermoFisher  
Confocal microscope LSM880Carl ZeissLSM880 
Cover glassMarienfeld111580 
Culture Dish (60 mm)Sarstedt82.1473 
DithiothreitolSigma-Aldrich43819 
DMEMGibco41966029 
EASY-nLC 1000 Liquid ChromatographThermoFisher  
Electron microscope JEM-2100JEOL  
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acidSigma-Aldrich03777-10G 
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)  http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine SerumGibco16140071 
Fetal Horse SerumBiowestS0960-500 
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001 
Fisherbrand Q500 Sonicator with ProbeFisherbrand12893543 
FlexAnalysisBrucker  
Fluorescence mounting mediumAgilentS3023 
Formic AcidSigma-Aldrich695076 
Formvar-carbon coated copper gridsAgar scientific LtdAGS162-3 
GlucoseSigma-AldrichG8769 
GlutaraldehydeSigma-Aldrich340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
IdoacetamideSigma-AldrichI1149 
InstantBlue Coomassie Protein StainExpedeonISB1L 
Invert light microscope CKX53Olympus  
L-glutamineGibco25030-024 
LabTek II 8 wells Nunc154534 
Laemmli 2XBio-Rad1610737 
LamininCorning354232 
MaxQuant software (proteins identification software)  https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stellBrucker8268711 
MEM 10XGibco21090-022 
MethylcelluloseSigma-AldrichM6385-100G 
MiliQ waterMerck Millipore  
MilkRegilaitREGILAIT300 
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis CellBio-Rad1658000FC 
MonoP FPLC columnGE Healthcare no longer available
Nanosight NS300Malvern PanalyticalNS300 
NanoSight NTA software v3.2Malvern Panalytical  
NanoSight syringe pumpMalvern Panalytical  
NeurobasalGibco21103-049 
Nitrocellulose membraneGE Healthcare10600007 
Nonidet P-40Fluka56741 
Nunc multidish 24 wellsThermoFisher82.1473 
ParaformaldehydeElectro microscopy Science15713 
PC-12 cell lineATCCATCC CRL-1721 
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122 
Peptide calibration mixLaserBio LabsC101 
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-035-003 
Perseus software (Processing of identified proteins)  https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugateSanta-cruzsc-362065 
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma-Aldrich78830 
Phosphate Buffer SalineInvitrogen14190094no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µmpluriSelect43-50060 
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407 
Polycarbonate centrifuge tubesBeckman Coulter355651 
Protease InhibitorSigma-AldrichS8830-20TAB 
PureColCell Systems5005 
Q-Exactive mass spectrometerThermoFisher  
rapifleX mass spectrometerBrucker  
Rat cortical neuronsCell ApplicationsR882N-20Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture MediumCell ApplicationsR620K-100Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophagesCell ApplicationsR8818-10a 
Rat primary microgliaLonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE Healthcare17014001 
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111 
SlideDustsher100204 
Sodium ChlorideScharlauSO0227 
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL3771 
Sodium FluorideSigma-AldrichS7920-100G 
Sodium hydroxideScharlabSO0420005P 
Sodium pyrophosphateSigma-AldrichS6422-100G 
SpeedVac Vacuum ConcentratorThermoFisher  
String software (functional protein association networks)  https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration SubstrateThermoFisher34075 
Syringe 1.0 mLTerumo8SS01H1 
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cellBio-Rad1703940 
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508 
TrisInterchimUP031657 
Tris-GlycineEuromedexEU0550 
Tween 20Sigma-AldrichP2287 
UltracentrifugeBeckman CoulterA95765 
Ultracentrifuge Rotor 70.1 TiBeckman Coulter342184 
Uranyl acetateAgar Scientific LtdAGR1260A 
Whatman filter paperSigma-AldrichWHA10347510 
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acidSigma-AldrichC2020-25G 

References

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
  19. Murgoci, A. -. N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -. M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -. M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160 microglia

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved