АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем докладе освещаются хронологические требования к внеклеточной изоляции везикулы (EV) от микроглии или макрофагов крови. Микроглии полученных EVs были оценены как регуляторы неврит нарастания в то время как кровь макрофаг полученных EVs были изучены в контроле C6 глиомы ячейки вторжения в пробирке анализов. Цель состоит в том, чтобы лучше понять эти функции EV в качестве иммунных посредников в конкретных микросредах.

Аннотация

Нейровоспалительное состояние центральной нервной системы (ЦНС) играет ключевую роль в физиологических и патологических состояниях. Микроглия, резидентиммунные клетки в головном мозге, а иногда и проникновение макрофагов из костного мозга (BMDMs), регулируют воспалительный профиль их микроокружения в ЦНС. В настоящее время принято, что внеклеточные везикулы (EV) популяций из иммунных клеток выступают в качестве иммунных посредников. Таким образом, их сбор и изоляция имеют важное значение для определения их содержания, но и для оценки их биологического воздействия на клетки-реципиента. В настоящее время данные подчеркивают хронологические требования к изоляции EV от клеток микроглии или макрофагов крови, включая ультрацентрифугацию и хроматографию размеров (SEC). Нецелевой протеомный анализ позволил валидации белковых подписей в качестве маркеров EV и охарактеризовал биологически активное содержание EV. Микроглии полученных EVs были также функционально использованы на первичной культуре нейронов, чтобы оценить их важность в качестве иммунных посредников в неврит роста. Результаты показали, что микроглии полученных EVs способствовать облегчению неврита рост в пробирке. Параллельно, кровь макрофагов полученных EVs были функционально использованы в качестве иммунных посредников в сфероидных культур клеток глиомы C6, результаты, показывающие, что эти ЭВ контролировать вторжение глиомы клеток в пробирке. В настоящем докладе подчеркивается возможность оценки функций иммунных клеток, опосредованных ЕВ, а также понимания молекулярных основ такой связи. Это расшифровка может способствовать использованию природных пузырьков и/или экстракорпорного приготовления терапевтических пузырьков для имитации иммунных свойств в микроокружении патологий ЦНС.

Введение

Многие нейропатологии связаны с нейровоспалительным состоянием, которое является сложным механизмом, который все чаще рассматривается, но все еще плохо понимается, потому что иммунные процессы разнообразны и зависят от клеточной среды. Действительно, расстройства ЦНС систематически не связаны с теми же сигналами активации и популяциями иммунных клеток, и, таким образом, про- или противовоспалительные реакции трудно оценить как причины или последствия патологий. Мозг резидентов макрофаги называется "микроглии", как представляется, на стыке нервной и иммуннойсистемы 1. Микроглия имеют миелоидное происхождение и являются производными от желток мешок во время примитивных hematopoiesis колонизировать мозг, в то время как периферийные макрофаги являются производными от печени плода во время окончательного hematopoiesis стать периферийных макрофагов2. Клетки микроглии общаются с нейронами и нейронами, полученными глиальными клетками, такими как астроциты и олигодендроциты3. Несколько недавних исследований показали, что микроглии участвуют в нейронной пластичности во время развития ЦНС и взрослых тканей гомеостаза, а также в воспалительном состоянии, связанном с нейродегенеративными заболеваниями4,5. В противном случае, целостность гематоэнцефалического барьера может быть нарушена в других патологиях ЦНС. Иммунные реакции, особенно при мультиформе рака глиобластомы, не поддерживаются только клетками микроглии, так как гематоэнцефалический барьер реорганизуется через ангиогенные процессы и наличие лимфатических сосудов6,,7. Таким образом, большой костного мозга полученных макрофагов (BMDMs) инфильтрация происходит в опухоли головного мозга через опухолевых механизмов ангиогенеза8. Раковые клетки оказывают значительное влияние на проникнутые БМДМ, что приводит к иммуносупрессивным свойствам и росту опухоли9. Таким образом, связь между иммунными клетками и их микроокружения мозга трудно понять, как происхождение клеток и активации сигналы разнообразны10,11. Таким образом, интересно задержать функции иммунных клеток, связанных молекулярных подписей в физиологических условиях. В связи с этим, клеточная связь между иммунными клетками и микроокружением клеток может быть изучена путем высвобождения внеклеточных пузырьков (ЭВ).

EVs изучаются все больше и больше в регуляции иммунных функций в здоровых, а также патологических условиях12,13. Можно принимать во внимание две популяции, экзосомы и микровезички. Они представляют различные биогенеза и диапазоны размеров. Экзосомы представляют собой пузырьки диаметром от 30 до 150 нм и генерируются из эндозомальной системы и выделяются при слиянии многопузырьковых тел (МВБ) с плазменной мембраной. Микровезики около 100-1000 нм в диаметре и генерируются внешним почками из мембраны плазмы клетки14. Поскольку экзосома против микровесикла дискриминации по-прежнему трудно реализовать в соответствии с размером и молекулярными моделями, мы будем использовать только термин EVs в настоящем докладе. EV-ассоциированных связи в ЦНС представляет собой механизм предков, поскольку исследования показали их участие в беспозвоночных видов, включая нематод, насекомых или аннелид15,16. Кроме того, результаты, показывающие, что EVs может общаться с клетками из разных видов, демонстрируют этот механизм, чтобы быть системой блокировки ключей, основанной сначала на распознавании поверхностных молекул между пузырьками и клетками-реципиентами, а затем позволяющим поглощению посредников16,17. Действительно, EVs содержат много молекул, как белки (например, ферменты, трансдукция сигнала, биогенез фактор), липиды (например, керамид, холестерин) или нуклеиновых кислот (например, ДНК, мРНК или miRNAs), действующих в качестве прямых или косвенных регуляторов деятельности клеток-реципиентов14. Именно поэтому были проведены методические исследования на иммунных клетках для изоляции ЭВ и полной характеристики их белковых подписей18,19.

Самые ранние исследования продемонстрировали высвобождение экзосом из первичной культивируемой крысиной микроглии в качестве индуцируемого механизма после wnt3a- или серотонина-зависимой активации20,21. Функционально в ЦНС, микроглии полученных EVs регулируют синаптический везикул релиз пресинаптических терминалов в нейронах, способствующих контролю возбудимости нейронов22,23. Микроглии полученных EVs может также размножаться цитокинов опосредошной воспалительной реакции в больших областях мозга24,25. Важно отметить, что разнообразные лиганды для платных рецепторов семьи может активировать конкретные производства EVs в микроглии26. Например, исследования in vitro показывают, что LPS-активированные микроглии BV2 клеточные линии производят дифференциальное содержание EV, включая провоспалительные цитокины27. Таким образом, функциональное разнообразие субпопуляций иммунных клеток в ЦНС, микроглии и проникновения BMDMs, могут быть оценены через свои собственные популяции EV, включая воздействие EV на клетки-реципиента и идентификации содержимого EV.

Ранее мы описали методы оценки функциональных свойств микроглии и БМДМ полученных EVs после их изоляции16,19. В настоящем докладе мы предлагаем самостоятельно оценить влияние микроглий полученных ЭВ на невритный рост, а также влияние эвакуированных макрофагов на контроль агрегатов клеток глиомы. Это исследование также предлагает широкий протеомный анализ фракций EV для того, чтобы проверить процедуру изоляции EV, а также определить биологически активные подписи белка. Благотворное воздействие и молекулярной расшифровки содержимого EV может помочь их возможные манипуляции и использования в качестве терапевтических агентов в расстройства мозга.

протокол

1. Первичная культура микроглии/макрофагов

  1. Первичная культура микроглии
    1. Культура коммерческих крыс первичной микроглии (2 х 106 клеток) (см. Таблица материалов) в Dulbecco в модифицированных Eagle среды (DMEM) дополнены 10% экзосомы свободной сыворотки, 100 U /mL пенициллина, 100 мкг /мл streptomycin, и 9,0 г / л при 37 c и5%.
    2. Соберите кондиционированную среду после 48 h культуры и перейти к изоляции EVs.
  2. Первичная культура макрофагов
    1. Культура коммерческих крыс первичных макрофагов (1 х 106 клеток) в среде, предоставляемой производителем (см. Таблица материалов) на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2, с экзосомой свободной сыворотки.
    2. Соберите кондиционированную среду после 24 h культуры и перейти к изоляции EVs.

2. Изоляция ЭВ

  1. Предварительная изоляция ЭВ от кондиционированной среды
    1. Перенесите кондиционированную среду культуры из микроглии или макрофагов (шаги 1.1.2 или 1.2.2) в коническую трубку.
    2. Центрифуга при 1200 х г в течение 10 мин при комнатной температуре (RT) для гранулы клеток.
    3. Перенесите супернатант в новую коническую трубку. Центрифуга при 1200 х г в течение 20 мин на RT для устранения апоптотических тел.
    4. Перенесите супернатант в поликарбонатную трубку 10,4 мл и перенесите трубку в ротор 70,1 Ti. Ультрацентрифуге при 100 000 х г в течение 90 мин при 4 градусах По Цельсию, чтобы гранулировать ЭВ.
    5. Откажитесь от супернатанта и отдохните гранулы, содержащие ЭВ в 200 л отфильтрованного фосфатного буфера солине (PBS).
  2. Изоляция EVs
    1. Подготовка домашней колонки хроматографии размера (SEC)
      1. Пустая стеклянная хроматографическая колонка (длина: 26 см; диаметр: 0,6 см) (см. таблицу материалов),промойте и стерилизуют его.
      2. Поместите фильтр 60 мкм в нижней части столбца.
      3. Стек колонки с перекрестным связаны агарозный гель фильтрации базы матрицы для создания стационарной фазы диаметром 0,6 см и 20 см высотой.
      4. Промыть фазу 50 мл 0,20 мкм фильтрованных PBS. Храните при 4 градусах По Цельсия, которые будут использоваться позже, если это необходимо.
    2. Поместите повторно ежевику на неподвижной фазе столбца SEC.
    3. Соберите 20 последовательных фракций по 250 л, продолжая добавлять 0,20 мкм отфильтрованного PBS в верхней части стационарной фазы, чтобы предотвратить высыхание столбца. При необходимости храните фракции при -20 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное хранение, чем одна неделя, может быть выполнено при -80 градусах по Цельсию для поддержания целостности EV для молекулярного анализа.
  3. Матрица помогает лазерной ионизации десорбции (MALDI) анализ масс-спектрометрии фракций SEC
    1. Переход к изоляции EV, как описано в разделе 2.2.
    2. Приостановите действие гранул EV с 200 зл пептидным калибровозационным раствором (см. Таблицу Материалов).
    3. Приступить к коллекции EV, как описано в разделах 2.2.1 до 2.2.3.
    4. Полностью высушите фракцию с вакуумным концентратором.
    5. Восстановите фракции с 10 зл и 0,1% трифтороацетической кислоты (TFA).
    6. Смешайте 1 зл и восстановленную фракцию с 1 qL из матрицы q-cyano-4-гидроксициннамической кислоты (HCCA) на полированной стальной целевой пластине MALDI.
    7. Проанализируйте все фракции с помощью масс-спектрометра MALDI.
    8. Анализ генерируемых спектров с помощью специального программного обеспечения (см. Таблицу Материалов).

3. Характеристика ЭВ

  1. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Анализ NTA выполняется с помощью инструмента анализа наночастиц (см. таблицу материалов)и автоматизированного шприца насоса.
    1. Сделайте разбавление (диапазон от 1:50 до 1:500) каждой фракции SEC от шага 2.2.3 с 0.20 мкм фильтруемых PBS.
    2. Vortex решение для устранения EV агрегатов.
    3. Положите разбавленный раствор в шприц 1 мл и поместите его в автоматический шприц насос.
    4. Отрегулируйте настройку камеры до уровня увеличения экрана (3) и уровня камеры (13).
    5. Нажмите на Run и запустите следующий сценарий.
      1. Загрузите образец в камеру анализа (скорость инфузии: 1000 на 15 с).
      2. Уменьшение и стабилизация скоростного потока для видеозаписи (скорость вливания: 25 на 15 с). Захват три последовательных 60 s видео потока частиц.
      3. Отрегулируйте уровень камеры (13) и порог обнаружения (3) перед анализом видео. Нажмите на настройки Ok, чтобы начать анализ и нажмите на экспорт, когда анализ сделан.
    6. Между каждым анализом фракции, мыть с 1 мл 0,20 мкм фильтруется PBS.
  2. Анализ электронной микроскопии (EM)
    1. Изолировать ЭВ, как описано в разделе 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные условия не требуются.
    2. Повторите раздел 3.1 для количественной оценки ЭВ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Только положительные фракции будут использоваться для анализа EM.
    3. Используйте центробежный фильтр 50 kDa (см. Таблицу Материалов),чтобы сконцентрировать ev-содержащие фракции SEC.
    4. Приостановить концентрированные ЭВ в 30 Л к 2% параформальдегида (PFA).
    5. Загрузите 10 зл образца на медную сетку с углеродным покрытием.
    6. Инкубировать в течение 20 минут во влажной среде.
    7. Повторите шаги 3.2.5 и 3.2.6 для хорошего поглощения образца на сетке.
    8. Передача сетки в падение 1% глютаральдегида в PBS в течение 5 минут на RT.
    9. Вымойте образец ультрачистой водой несколько раз.
    10. Сравните образец в течение 10 минут на льду со смесью 4% уранил ацетата и 2% метилцеллюлозы (1:9, v/v). Удалите избыток смеси с помощью фильтровальной бумаги.
    11. Высушите образец и наблюдайте его под трансмиссионным электронным микроскопом при 200 кВ (см. таблицу материалов).
  3. Западный анализ пометки
    1. Экстракция белка
      1. Повторите шаги 3.2.1 до 3.2.3, чтобы изолировать и сконцентрировать ЭВ.
      2. Смешайте 50 л буфера RIPA (150 мм хлорида натрия ,NaCl), 50 мМ Трис, 5 мм этилен гликоль-бис (2-аминоэтилетхер)-N,N,N,N,-тетраацетической кислоты «EGTA», 2 мМ этилэндиамин-тетраацетика Фтор натрия 100 мМ (NAF), 10 мм пирофосфат натрия, 1% Нонидет Р-40, 1 мМ фенилметанесульфонил фторид «PMSF», 1x ингибитор протеазы) с протеизором EV (25 мл в результате концентрации EV на фильтре) на 5 минут на льду для экстрактов.
      3. Соникат на 5 с (амплитуда: 500 Вт; частота: 20 кГц), 3 раза на льду.
      4. Удалите везикулярный мусор центрифугированием при 20 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
      5. Соберите супернатант и измерьте концентрацию белка методом протеинового ассирования Брэдфорда.
    2. Натрий додецил сульфат полиакриламид гель электрофорез (SDS-PAGE) и западного blotting
      1. Смешайте экстракты белка (30 мкг) с 5c буфером образца Laemmli (v/v).
      2. Загрузите белковую смесь на 12% полиакриламидный гель.
      3. Мигрируйте белки в гель с буфером TGS (25 мм Tris pH 8.5, 192 mM Глицин, и 0.1% SDS), при 70 V за 15 мин и 120 В в течение 45 мин.
      4. Перенесите белки на мембрану нитроцеллюлозы с полусухой системой при 230 В в течение 30 мин.
      5. Насыщенный мембраны в течение 1 ч на RT с блокирующим буфером (0.05% Tween 20 w/v, 5% сухого молока w/v в 0.1 M PBS, pH 7.4).
      6. Инкубировать мембрану на ночь при температуре 4 градусов С с помощью мыши моноклонального античеловеческого теплошокового белка 90 (HSP90) антитела, разбавленного в блокирующем буфере (1:100).
      7. Вымойте мембрану три раза с PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) в течение 15 мин.
      8. Инкубировать мембрану в течение 1 ч на RT с козьим хреном пероксидаза-конъюгированных анти-мыш IgG вторичного антитела разбавленной в блокирующем буфере (1:10,000).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательный контроль выполняется с использованием вторичных антител в одиночку.
      9. Повторите шаг стирки (шаг 3.3.2.7).
      10. Выявить мембрану с усиленной химилюминесценции (ECL) западный набор поместья субстрата (см. Таблица материалов).
  4. Протеомный анализ
    1. Экстракция белка и переваривание в геле
      1. Повторите шаги 3.2.1 до 3.2.3, чтобы изолировать и сконцентрировать EVs. Повторите шаг 3.3.1 для экстракции белка EV.
      2. Выполните белковую миграцию в укладке геля 12% полиакриламидного геля.
      3. Зафиксировать белки в геле с coomassie синий в течение 20 мин на RT.
      4. Акциз каждый цветной кусок геля и разрезать его на мелкие кусочки 1 мм3.
      5. Вымойте кусочки геля последовательно с 300 зл и l каждого раствора: ультрачистая вода в течение 15 мин, 100% ацетонитрил (ACN) на 15 мин, 100 мМ аммоний бикарбонат (NH4HCO3) за 15 мин, ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) в течение 15 мин, и 100% ACN в течение 5 минут с непрерывным перемешиванием.
      6. Высушите полностью гелевые кусочки с вакуумным концентратором.
      7. Выполните сокращение белка с 100 мм NH4HCO3, содержащим 10 мМ дитиотрейтол на 1 ч при 56 градусах Цельсия.
      8. Выполните алкилирование белка с 100 мкм 100 мм NH4HCO3, содержащим 50 мМ йодоацетамида в течение 45 минут в темноте на RT.
      9. Вымойте гель кусочки последовательно с 300 мл каждого раствора: 100 мМ NH4HCO3 для 15 мин, ACN:20 мМ NH4HCO3 (1:1, v/v) в течение 15 мин, и 100% ACN в течение 5 минут с непрерывным перемешиванием.
      10. Полностью высушите кусочки геля вакуумным концентратором.
      11. Выполните переваривание белка с 50 зл трипсина (12,5 мкг/мл) в 20 мМ NH4HCO3 ночь при 37 градусах Цельсия.
      12. Извлекайте переваренные белки из геля с 50 qL 100% ACN в течение 30 минут при 37 градусах По Цельсию, а затем 15 мин на RT с непрерывным перемешиванием.
      13. Повторите следующие процедуры экстракции дважды: 50 л 5% TFA в 20 мМ NH4HCO3 раствор для 20 минут с непрерывным перемешиванием.
      14. Добавьте 100 л 100% ACN в течение 10 минут с непрерывным перемешиванием.
      15. Сухие переваренные белки с вакуумным концентратором и повторно применяемые в 20 Л л 0,1% TFA.
      16. Осальт образец с помощью 10 л пипетки отзыв с C18 обратной фазы средств для опреснения и концентрации пептидов (см. Таблица материалов) и elute пептидов с ACN:0.1% для меновой кислоты (FA) (80:20, v/v).
      17. Полностью высушите образец с вакуумным концентратором и повторно приостановите в 20 ЗЛ ACN:0.1% FA (2:98, v/v) для жидкой хроматографии тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS).
    2. Анализ LC-MS/MS
      1. Загрузите переваренный пептид в инструмент LC-MS/MS и выполните анализ проб и данных в соответствии с параметрами, подробно описанными в другом месте42.
    3. Анализ необработанных данных
      1. Обработка данных масс-спектрометрии для идентификации белков и сравнения идентифицированных белков каждого образца с пакетом программного обеспечения количественной протеомики с использованием стандартных параметров.
      2. Экспорт, используя стандартные параметры, список эксклюзивных и чрезмерно представленных белков из положительных образцов EV в программном обеспечении, предсказывая белковые сети и биологические процессы.
      3. Сравните список идентифицированных белков в фракциях с 100 верхними маркерами EV из базы данных открытого доступа Exocarta (см. Таблицу Материалов).

4. Функциональные EVs Эффекты Асса

  1. Нейритный рост на линии ячейки PC-12
    1. Культура PC12 клеточной линии в полной среде DMEM (2 мМ L-глютамин, 10% фетальной сыворотки лошади (FHS), 5% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 100 UI/mL пенициллин, 100 мкг/мл streptomycin).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сера экзосомы бесплатно в целом процедуры.
    2. Добавьте крышку (все колодцы) в 24-хорошую тарелку; покрыть тарелку поли-D-лизином (0,1 мг/мл) и семенами 260 000 клеток/хорошо.
    3. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия под 5% CO2.
    4. После 24 ч инкубации, изменить среднюю среду дифференциации DMEM (DMEM с 2 мМ L-глютамин, 0,1% FHS, 100 UI/mL пенициллин, 100 мкг/мЛ стрептомицин) с 1 х 106 микроглии EVs (от шага 1.1.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние управления выполняется без микроглии EVs в среде дифференциации.
    5. На 4-й день после посева загрузите все скважины 100 л полного средства DMEM.
    6. На 7-й день после посева, исправить клетки с 4% PFA в течение 20 минут на RT и промыть три раза (10 мин каждый) с PBS.
    7. Пятно клеток с родамин-конъюгированный фаллоидин в течение 30 мин при 4 КС и промыть 3 раза (10 мин каждый) с PBS.
    8. Пятно клеток с разбавленной Hoechst 33342 (1:10000) в течение 30 минут на RT и промыть 3 раза (10 мин каждый) с PBS.
    9. Установите крышку стекла на слайд с флуоресцентной средой крепления (см. Таблица материалов).
    10. Проанализируйте слайд с помощью конфокального микроскопа, возьмите 5 случайных изображений каждого слайда.
    11. Измерьте невритный рост с помощью автоматизированного программного обеспечения количественной оценки (общая длина неврита), как подробно описано в другом месте43.
  2. Нейритный рост на крысических первичных нейронах
    1. Пальто 8-хорошо стеклянная горка с поли-D-лизин (0,1 мг/мл) и ламинин (20 мкг/мл).
    2. Культура крысы коммерческих первичных нейронов в соответствующей среде культуры (см. Таблица материалов) путем покрытия 50000 клеток на хорошо и инкубации клеток при 37 КС под 5% CO2 для 48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сера без экзосомного во всей процедуре.
    3. Добавьте 1 x 106 микроглии EVs к среде культуры нейрона и инкубировать на 37 c под 5% CO2 для 48 h больше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние управления выполняется без микроглии EVs в нейронной культуры среды.
    4. Выполните шаги 4.1.6 до 4.1.9, чтобы исправить и испачкать клетки.
    5. Выполните шаги 4.1.10 и 4.1.11 для анализа слайда.
  3. Вторжение клеток глиомы
    1. Resuspend C6 клетки глиомы крысы в полной среде DMEM (DMEM с 10% FBS, 2 мМ L-глютамин, 1x антибиотики), содержащие 5% коллагена при окончательной концентрации 8000 клеток в 20 Л.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сера без экзосомного во всей процедуре.
    2. Поместите 5 мл PBS на дно 60 мм ткани культуры блюдо. Переворачивать крышку и депозитные капли в размере 20 кЛ (8000 клеток) клеточной суспензии на дно крышки.
    3. Переворачивать крышку на заполненную PBS нижнюю камеру и инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 72 ч до образования клеточных сфероидов.
    4. Добавьте 1 х 108 эва-макрофагов (от шага 1.2.2) к коллагеновой смеси 2,2 мг/мл (2 мл раствора коллагена i крупного рогатого скота( 3 мг/мл) с 250 л из 10-х минимальных основных средств (MEM) и 500 мл коллагена 0,1 М гидроксида натрия).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние контроля осуществляется без макрофагов EVs в коллагеновой смеси.
    5. Распределите коллагеновые смеси, содержащие ЭВ, в 24-хорошую пластину для встраивания клеточных сфероидов.
    6. Имплантация вновь образованных клеточных сфероидов в центре каждого колодца.
    7. Инкубировать пластину в течение 30 мин при 37 и 5% CO2, чтобы затвердеть гель.
    8. После этого, наложение 400 л полной среде DMEM на коллагеновой матрицы в каждой скважине.
    9. Инкубировать полную систему в общей сложности 6 дней при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вторжение клеток из сфероида контролируется цифровой фотографией с помощью перевернутого светового микроскопа с помощью цели 4x/0.10 N.A.
    10. Приобретайте изображения каждого колодца каждый день.
    11. Обработка изображений и количественно вторжения клеток сфероидных областях с помощью программного обеспечения, как ранее описано в деталях42.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вторжение и сфероидных областях были нормализованы за каждый день вторжения и сфероидных областях измеряется на день 0.

Результаты

Одной из основных проблем, связанных с приписыванием биологических эффектов внеклеточным пузырьками (ЭВ), является способность изолировать ЭВ от всей среды культуры. В этом отчете мы представляем метод с использованием ультрацентрифюгации (UC) и хроматографии для исключения размера (SEC...

Обсуждение

Центральная нервная система (ЦНС) представляет собой сложную ткань, в которой связь от клеток к клетке регулирует нормальные нейронные функции, необходимые для гомеостаза30. EVs в настоящее время широко изучены и описаны как важные молекулярные грузы для клеточной связи

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Представленная работа была поддержана Национальным министерством образования, де Л'Энсеньмент-Супьерии и ИНСЕРМ. Мы с благодарностью отмечаем BICeL- Кампус Научный городской фонд за доступ к инструментам и техническим консультациям. Мы с благодарностью признательны за помощь в масс-спектрометрии, в которой были с благодарностью юан-Паскаль Химено, Сулейман Абулуар и Изабель Фурнье. Мы с благодарностью признательны Танине Араб, Кристель ван Камп, Франсуазе ле Мартрек-Крок, Якопо Визиоли и Пьеру-Эрику Сотьеру за их значительный вклад в научно-технические разработки.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-rad4561045EDU 
AcetonitrileFisher ChemicalsA955-1 
Amicon 50 kDa centrifugal filterMerckUFC505024 
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich9830 
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659)Santa-cruzsc-13119 
B27 Plus supplementGibcoA3582801 
BenchMixer V2 Vortex MixerBenchmark ScientificBV1003 
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)Bio-Rad5000006 
C18 ZipTipsMerck MilliporeZTC18S096 
C6 rat glioma cellATCCATCC CCL-107 
Canonical tubesSarstedt62.554.002 
CentrifugeEppendorf5804000010 
CO2 IncubatorThermoFisher  
Confocal microscope LSM880Carl ZeissLSM880 
Cover glassMarienfeld111580 
Culture Dish (60 mm)Sarstedt82.1473 
DithiothreitolSigma-Aldrich43819 
DMEMGibco41966029 
EASY-nLC 1000 Liquid ChromatographThermoFisher  
Electron microscope JEM-2100JEOL  
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acidSigma-Aldrich03777-10G 
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)  http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine SerumGibco16140071 
Fetal Horse SerumBiowestS0960-500 
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001 
Fisherbrand Q500 Sonicator with ProbeFisherbrand12893543 
FlexAnalysisBrucker  
Fluorescence mounting mediumAgilentS3023 
Formic AcidSigma-Aldrich695076 
Formvar-carbon coated copper gridsAgar scientific LtdAGS162-3 
GlucoseSigma-AldrichG8769 
GlutaraldehydeSigma-Aldrich340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
IdoacetamideSigma-AldrichI1149 
InstantBlue Coomassie Protein StainExpedeonISB1L 
Invert light microscope CKX53Olympus  
L-glutamineGibco25030-024 
LabTek II 8 wells Nunc154534 
Laemmli 2XBio-Rad1610737 
LamininCorning354232 
MaxQuant software (proteins identification software)  https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stellBrucker8268711 
MEM 10XGibco21090-022 
MethylcelluloseSigma-AldrichM6385-100G 
MiliQ waterMerck Millipore  
MilkRegilaitREGILAIT300 
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis CellBio-Rad1658000FC 
MonoP FPLC columnGE Healthcare no longer available
Nanosight NS300Malvern PanalyticalNS300 
NanoSight NTA software v3.2Malvern Panalytical  
NanoSight syringe pumpMalvern Panalytical  
NeurobasalGibco21103-049 
Nitrocellulose membraneGE Healthcare10600007 
Nonidet P-40Fluka56741 
Nunc multidish 24 wellsThermoFisher82.1473 
ParaformaldehydeElectro microscopy Science15713 
PC-12 cell lineATCCATCC CRL-1721 
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122 
Peptide calibration mixLaserBio LabsC101 
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-035-003 
Perseus software (Processing of identified proteins)  https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugateSanta-cruzsc-362065 
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma-Aldrich78830 
Phosphate Buffer SalineInvitrogen14190094no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µmpluriSelect43-50060 
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407 
Polycarbonate centrifuge tubesBeckman Coulter355651 
Protease InhibitorSigma-AldrichS8830-20TAB 
PureColCell Systems5005 
Q-Exactive mass spectrometerThermoFisher  
rapifleX mass spectrometerBrucker  
Rat cortical neuronsCell ApplicationsR882N-20Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture MediumCell ApplicationsR620K-100Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophagesCell ApplicationsR8818-10a 
Rat primary microgliaLonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE Healthcare17014001 
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111 
SlideDustsher100204 
Sodium ChlorideScharlauSO0227 
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL3771 
Sodium FluorideSigma-AldrichS7920-100G 
Sodium hydroxideScharlabSO0420005P 
Sodium pyrophosphateSigma-AldrichS6422-100G 
SpeedVac Vacuum ConcentratorThermoFisher  
String software (functional protein association networks)  https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration SubstrateThermoFisher34075 
Syringe 1.0 mLTerumo8SS01H1 
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cellBio-Rad1703940 
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508 
TrisInterchimUP031657 
Tris-GlycineEuromedexEU0550 
Tween 20Sigma-AldrichP2287 
UltracentrifugeBeckman CoulterA95765 
Ultracentrifuge Rotor 70.1 TiBeckman Coulter342184 
Uranyl acetateAgar Scientific LtdAGR1260A 
Whatman filter paperSigma-AldrichWHA10347510 
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acidSigma-AldrichC2020-25G 

Ссылки

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
  19. Murgoci, A. -. N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -. M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -. M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

160

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены