Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu rapor, mikroglia veya kan makrofajlarından ekstrasellüler vezikül (EV) izolasyonu için kronolojik gereksinimleri vurgulamaktadır. Mikroglia kaynaklı EV'ler nötral büyümenin düzenleyicisi olarak değerlendirilirken, c6 glioma hücre invazyonunun kontrolünde in vitro tahlillerde kan makrofajlı eV'ler incelendi. Amaç, belirli mikroortamlarda bağışıklık arabulucusu olarak bu EV fonksiyonlarını daha iyi anlamaktır.

Özet

Merkezi sinir sisteminin nöroinflamatuar durumu (CNS) fizyolojik ve patolojik koşullarda önemli bir rol oynar. Mikroglia, beyinde yerleşik bağışıklık hücreleri, ve bazen sızan kemik iliği kaynaklı makrofajlar (KBM), CNS kendi mikroortamının inflamatuar profilini düzenler. Bağışıklık hücrelerinden gelen hücre dışı vezikül (EV) popülasyonlarının immün arabulucu olarak hareket ettiği kabul edilir. Bu nedenle, bunların toplanması ve izolasyonu, içeriklerini tanımlamak için önemlidir, aynı zamanda alıcı hücreler üzerindeki biyolojik etkilerini de değerlendirirler. Bu veriler, ultrasantrifüj ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) adımları da dahil olmak üzere mikroglia hücrelerinden veya kan makrofajlarından EV izolasyonu için kronolojik gereksinimleri vurgulamaktadır. Hedeflenmemiş bir proteomik analiz, protein imzalarının EV belirteçleri olarak doğrulanmasına izin verdi ve biyolojik olarak aktif EV içeriğini karakterize etti. Mikroglia kaynaklı EVs de işlevsel nöronların birincil kültür de nötrit büyüme bağışıklık mediatörler olarak önemini değerlendirmek için kullanılmıştır. Sonuçlar, mikroglia kaynaklı EV'lerin in vitro neurite büyümesini kolaylaştırmaya katkıda olduğunu göstermiştir. Buna paralel olarak, kan makrofaj kaynaklı EVs fonksiyonel C6 glioma hücrelerinin spheroid kültürlerde bağışıklık aracı olarak kullanılmıştır, bu eVs in vitro glioma hücre invazyonu kontrol gösteren sonuçlar. Bu rapor, EV aracılı bağışıklık hücresi fonksiyonlarını değerlendirme olasılığını vurgular ken, aynı zamanda böyle bir iletişimin moleküler temellerini de anlamaktadır. Bu deşifre doğal veziküllerin kullanımını teşvik edebilir ve / veya cns patolojilerin mikroortamda bağışıklık özelliklerini taklit etmek için terapötik veziküllerin in vitro hazırlanması.

Giriş

Birçok nöropatoloji giderek düşünülen karmaşık bir mekanizma dır nöro-inflamatuar devlet ile ilgilidir, ancak bağışıklık süreçleri çeşitli ve hücre ortamına bağlıdır, çünkü hala kötü anlaşılmaktadır. Gerçekten de, CNS bozuklukları sistematik olarak aynı aktivasyon sinyalleri ve bağışıklık hücre popülasyonları içermez ve bu nedenle pro-veya anti-inflamatuar yanıtları patolojilerin nedenleri veya sonuçları olarak değerlendirmek zordur. "Microglia" adı verilen beyin yerleşik makrofajlar sinir ve bağışıklık sistemleri arasındaki arayüz de gibi görünüyor1. Mikroglia bir miyeloid kökenli ve ilkel hematopoiesis sırasında beyin kolonize yumurta kesesi türetilmiştir, periferik makrofajlar periferik makrofajlar olmak için kesin hematopoezis sırasında fetal karaciğertülen türetilmiştir ise2. Mikroglia hücreleri nöronlar ve astrositler ve oligodendrocytes33 gibi nöron kaynaklı glial hücreleri ile iletişim . Birkaç yeni çalışmalar mikroglia CNS gelişimi ve yetişkin doku homeostaz sırasında nöronal plastisite dahil olduğunu göstermiştir, ve aynı zamanda nörodejeneratif hastalıklar ile ilişkili inflamatuar devlet4,5. Aksi takdirde, kan beyin bariyerinin bütünlüğü diğer CNS patolojilerinde tehlikeye olabilir. Bağışıklık yanıtları, özellikle glioblastoma multiforme kanser, kan beyin bariyeri anjiyojenik süreçler ve lenfatik damarların varlığı ile yeniden düzenlenir gibi mikroglia hücreleri tarafından desteklenmez6,7. Bu nedenle tümöre bağlı anjiyogenez mekanizmaları boyunca beyin tümöründe büyük kemik iliği kaynaklı makrofajlar (MBM) infiltrasyonu meydana gelir8. Kanser hücreleri immünsupresif özellikleri ve tümör büyümesi ne kadar opresif özellikleri ve tümör büyümesi ne kadar infiltrasyon lu KBM'ler üzerinde önemli bir etki uygular9. Böylece bağışıklık hücreleri ve beyin mikroçevre arasındaki iletişim hücre kökeni ve aktivasyon sinyalleri çeşitli olduğu gibi anlamak zordur10,11. Bu nedenle fizyolojik koşullarda bağışıklık hücresi ile ilişkili moleküler imzaların işlevlerini yakalamak ilginçtir. Bu bağlamda, bağışıklık hücreleri ve hücre mikroçevre arasındaki hücre-hücre iletişimi ekstrasellüler serbest bırakılması ile incelenebilir (EVs).

EVs sağlıklı yanı sıra patolojik koşullarda bağışıklık fonksiyonlarının düzenlenmesinde daha fazla çalışılmaktadır12,13. İki popülasyon, ekzozomlar ve mikroveziküller dikkate alınabilir. Farklı biyogenez ve boyut aralıkları sunarlar. Ekzozomlar ~30-150 nm çapında veziküllerdir ve endozomal sistemden üretilir ve plazma zarı ile multiveziküler cisimlerin (MVB) füzyonu sırasında salgılanır. Mikroveziküller çapı yaklaşık 100-1.000 nm ve hücre plazmamembran14bir dış tomurcuklanma tarafından oluşturulur. Ekzozom ve mikrovezilem ayrımcılığının boyutuna ve moleküler kalıplarına göre fark etmesi hala zor olduğundan, bu raporda sadece EVs terimini kullanacağız. Çalışmalar nematodlar, böcekler veya annelidler15,16dahil omurgasız türlerde rol lerini gösterdi beri CNS EV ilişkili iletişim atalarının bir mekanizma temsil eder. Ayrıca, EVs farklı türlerden hücrelerle iletişim kurabilir gösteren sonuçlar, ilk veziküller ve alıcı hücreler arasında yüzey molekülü tanıma dayalı ve daha sonra arabulucuların alımı na izin bir anahtar kilit sistemi olarak bu mekanizma göstermek16,17. Gerçekten de, EVs proteinler (örneğin, enzimler, sinyal transdüksiyonu, biyogenez faktörü), lipidler (örneğin, ceramid, kolesterol) veya nükleik asitler (örneğin, DNA, mRNA veya miRNA veya miRNA veya miRNA) gibi birçok molekül içeren alıcı hücre faaliyetlerinin doğrudan veya dolaylı düzenleyicileri olarak hareket14. Bu nedenle evs izole etmek ve tam olarak protein imzaları karakterize bağışıklık hücreleri üzerinde metodolojik çalışmalar yapıldı18,19.

İlk çalışmalar bir Wnt3a aşağıdaki indükedilemez bir mekanizma olarak birincil kültürlü sıçan mikroglia ekzozomların serbest olduğunu gösterdi- veya serotonine bağlı aktivasyon20,21. Fonksiyonel CNS, mikroglia türetilmiş EVs nöronlarda presinaptik terminalleri tarafından nöronal eksitilat kontrolüne katkıda bulunan sinaptik vezikül salınımını düzenleyen22,23. Mikroglia kaynaklı EVs de büyük beyin bölgelerinde sitokinler aracılı inflamatuar yanıt yaymak olabilir24,25. Daha da önemlisi, toll benzeri reseptör ailesi için çeşitli ligands microglia26EVs belirli üretimleri etkinleştirmek olabilir. Örneğin, in vitro çalışmalar LPS aktive mikroglia BV2 hücre hatları pro-inflamatuar sitokinler27dahil diferansiyel EV içeriği üretmek olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, CNS bağışıklık hücresi alt popülasyonlarının fonksiyonel çeşitliliği, mikroglia ve bmdm'ler infiltrasyon, alıcı hücreler ve EV içeriğinin belirlenmesi üzerinde EV etkisi de dahil olmak üzere kendi EV popülasyonları ile değerlendirilebilir.

Daha önce mikroglia ve BMDM kaynaklı EVs onların izolasyon16,19sonra fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için yöntemler açıklanmıştır. Bu raporda, mikroglia kaynaklı EV'lerin nörit büyüme üzerindeki etkisini ve makrofaj kaynaklı EV'lerin glioma hücre agregalarının kontrolü üzerindeki etkisini bağımsız olarak değerlendirmeyi öneriyoruz. Bu çalışma aynı zamanda EV izolasyon prosedürünü doğrulamak ve biyolojik olarak aktif protein imzalarını belirlemek için EV fraksiyonlarının geniş bir proteomik analizini önermektedir. Yararlı etkileri ve EV içeriğinin moleküler deşifre onların olası manipülasyon yardımcı olabilir ve beyin bozukluklarında terapötik ajanlar olarak kullanmak.

Protokol

1. Mikroglia/Makrofajların Birincil Kültürü

  1. Mikroglia birincil kültür
    1. Kültür ticari sıçan birincil mikroglia (2 x 106 hücreleri) (Malzemeler Tablosubakınız) Dulbecco modifiye Kartal orta (DMEM) ile takviye 10% ekzozozomiçermeyen serum, 100 U/ mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, ve 9.0 g/L glikoz at 37 °C ve% 5 CO2.
    2. 48 saatlik bir kültürden sonra şartlandırılmış ortamı toplayın ve EVs'lerin izolasyonuna devam edin.
  2. Makrofajların birincil kültürü
    1. Kültür ticari sıçan birincil makrofajlar (1 x 106 hücreleri) üretici tarafından sağlanan ortamda (Malzemeler Tablosubakınız) 37 °C ve% 5 CO2, ekzozomsuz serum ile.
    2. 24 saatlik bir kültürden sonra şartlandırılmış ortamı toplayın ve EVs'lerin izolasyonuna devam edin.

2. EV'lerin İzolasyon

  1. EVs'nin klimalı ortamdan önceden izolasyonu
    1. Koşullu kültür ortamını mikroglia veya makrofaj kültürlerinden (adım 1.1.2 veya 1.2.2) konik bir tüpe aktarın.
    2. Hücre peletiçin oda sıcaklığında 10 dakika (RT) için 1.200 x g santrifüj.
    3. Supernatant'ı yeni bir konik tüpe aktarın. Apoptotik organları ortadan kaldırmak için RT 20 dakika için 1.200 x g santrifüj.
    4. Supernatant'ı 10,4 mL'lik polikarbonat tüpe aktarın ve tüpü 70,1 Ti rotora aktarın. Ultracentrifuge 100.000 x g için 90 dk 4 °C'de EVs pelet.
    5. Supernatant atın ve 0.20 μm filtrelenmiş fosfat tampon salin (PBS) 200 μL içinde EVs içeren pelet resuspend.
  2. EV'lerin İzolasyon
    1. Ev yapımı boyut dışlama kromatografisi sütununun (SEC) hazırlanması
      1. Bir cam kromatografi sütunu boşaltın (uzunluk: 26 cm; çap: 0,6 cm) (Malzeme Tablosunabakın), yıkayın ve sterilize edin.
      2. Sütunun altına 60 μm filtre yerleştirin.
      3. 0,6 cm çapında ve 20 cm yüksekliğinde sabit bir faz oluşturmak için çapraz bağlı agarose jel filtrasyon taban matris ile sütun yığını.
      4. 0,20 m filtrelenmiş PBS 50 mL ile faz duruleyin. Gerekirse daha sonra kullanılmak üzere 4 °C'de saklayabilirsiniz.
    2. Yeniden askıya alınan EV peletini SEC sütununun sabit fazının üzerine yerleştirin.
    3. Sütunun kurumasını önlemek için sabit fazın üstüne 0,20 m filtrelenmiş PBS eklemeye devam ederken 250 μL'lik 20 ardışık kesir toplayın. Kesirleri gerekirse -20 °C'de saklayın.
      NOT: Moleküler analiz için EV bütünlüğünü korumak için -80 °C'de bir haftadan uzun bir depolama yapılabilir.
  3. SEC fraksiyonlarının matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu (MALDI) kütle spektrometresi analizi
    1. Bölüm 2.2'de açıklandığı gibi EV yalıtımına devam edin.
    2. 200 μL peptit kalibrasyon karışımı çözeltisi ile EV peletini yeniden askıya alın (Malzeme Tablosu'nabakın).
    3. Bölüm 2.2.1 ile 2.2.3 bölümlerinde açıklandığı gibi EV koleksiyonuna devam edin.
    4. Tamamen bir vakum konsantratörü ile fraksiyonu kuru.
    5. Kesirleri %0,1 trifloroasetik asit (TFA) ile 10 μL ile yeniden oluşturur.
    6. Maldi cilalı çelik hedef plaka üzerinde 1 μL α-siyano-4-hidroksinnamik asit (HCCA) matrisi ile yeniden oluşturulmuş fraksiyonun 1 μL'sini karıştırın.
    7. Maldi kütle spektrometresi ile tüm kesirleri analiz edin.
    8. Özel yazılımla oluşturulan spektrumları analiz edin (bkz. Malzeme Tablosu).

3. EV'lerin karakterizasyonu

  1. Nanopartikül izleme analizi (NTA)
    NOT:     NTA analizi bir nanopartikül izleme analiz cihazı (Malzeme Tablosunabakınız) ve otomatik şırınga pompası ile gerçekleştirilir.
    1. 0,20 μm filtrelenmiş PBS ile adım 2.2.3 her SEC fraksiyonu bir seyreltme (1:50-1:500 aralığı) olun.
    2. Vortex ev agregaları ortadan kaldırmak için çözüm.
    3. Seyreltilmiş çözeltiyi 1 mL şırıngaya koyun ve otomatik şırınga pompasına yerleştirin.
    4. Kamera ayarını ekran kazanç düzeyi (3) ve kamera düzeyine (13) ayarlayın.
    5. Çalıştır'a tıklayın ve aşağıdaki komut dosyasını başlatın.
      1. Numuneyi analiz odasına yükleyin (infüzyon hızı: 15 s için 1.000).
      2. Video kaydı için hız akışını azaltın ve stabilize edin (infüzyon hızı: 15 s için 25). Parçacık akışının art arda üç 60 s video yakalayın.
      3. Video analizinden önce kamera düzeyini (13) ve algılama eşiğini (3) ayarlayın. Ayarlar' a tıklayın| Analizi başlatmak için tamam ve analiz yapıldığında Dışa Aktar'a tıklayın.
    6. Her kesir analizi arasında, 0,20 μm filtrelenmiş PBS 1 mL ile yıkayın.
  2. Elektron mikroskobu (EM) analizi
    1. Bölüm 2'de açıklandığı gibi EVs'leri yalıtın.
      NOT: Steril koşullar gerekli değildir.
    2. EVs ölçmek için bölüm 3.1 tekrarlayın.
      NOT: EM analizi için sadece pozitif kesirler kullanılacaktır.
    3. EV içeren SEC fraksiyonlarını yoğunlaştırmak için 50 kDa santrifüj filtre (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın.
    4. Konsantre EV'leri %2 paraformaldehitin (PFA) 30 μL'sinde yeniden askıya alın.
    5. Numunenin 10 μL'sini karbon kaplı bakır ızgaraya yükleyin.
    6. Islı bir ortamda 20 dakika kuluçka.
    7. Izgara üzerindeki numunenin iyi bir emilimi için 3.2.5 ve 3.2.6 adımlarını tekrarlayın.
    8. RT 5 dakika için PBS% 1 glutaraldehit bir damla içine ızgara aktarın.
    9. Numuneyi ultra saf suyla birkaç kez yıkayın.
    10. %4 uranyl asetat ve %2 metilselüloz (1:9, v/v) karışımı yla 10 dk buz üzerinde numuneyi kontrast. Bir filtre kağıdı kullanarak karışımın fazlalıkkaldırın.
    11. Numuneyi kurulayın ve 200 kV'da bir iletim elektron mikroskobu altında gözlemleyin (Bkz. Malzemeler Tablosu).
  3. Batı leke analizi
    1. Protein ekstraksiyonu
      1. EVs izole etmek ve konsantre 3.2.1 için 3.2.3 adımları tekrarlayın.
      2. Mix 50 μL RIPA tampon (150 mM sodyum klorür [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Etilen glikol-bis(2-aminoetitillether)-N,N,N′,-tetraasetik asit [EGTA], 2 mM Etilenedanin-tetraasetik asit [EDTA], 100 mM sodyum florür [NaF], 10 mM sodyum pirofosfat, %1 Nonidet P-40, 1 mM Feniltansülsülfonil florür [PMSF], 1x proteaz inhibitörü) ev numunesi (filtredeki EV konsantrasyonundan kaynaklanan 25 μL) ile proteinleri ayıklamak için 5 dk.
      3. Sonicate için 5 s (genlik: 500 W; frekans: 20 kHz), buz üzerinde 3 kez.
      4. 4 °C'de, 10 dakika boyunca 20.000 x g'de vesiküler enkazları santrifüj ile çıkarın.
      5. Supernatant toplamak ve Bradford protein analiz yöntemi ile protein konsantrasyonu ölçmek.
    2. Sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve batı lekeleme
      1. Protein ekstrelerini (30 μg) 5c Laemmli örnek tampon (v/v) ile karıştırın.
      2. Protein karışımını %12 poliakrilamid jelüzerine yükleyin.
      3. Jeldeki proteinleri TGS tamponu (25 m Tris pH 8.5, 192 mM Glisin ve %0.1 SDS), 70 V'de 15 dakika ve 120 V 45 dakika ile geçirin.
      4. Proteinleri 30 dk boyunca 230 V'de yarı kuru sistemle nitroselüloz membrana aktarın.
      5. Membranı RT'de 1 saat boyunca bloke edici tamponile doygunlaştırın (%0.05 Ara 20 w/v, 0.1 M PBS içinde %5 süt tozu w/v, pH 7.4).
      6. Membranı bir gecede 4 °C'de fare monoklonal insan şoku önleyici protein 90 (HSP90) antikor bloke tamponu (1:100) ile inkübe edin.
      7. Membranı PBS-Tween (PBS, %0,05 Ara 20 w/v) ile 15 dakika boyunca üç kez yıkayın.
      8. Membranı RT'de 1 saat boyunca keçi horseradish peroksidaz-konjuge anti-fare IgG ikincil antikor bloke tampon (1:10,000) seyreltilmiş ile inkübe.
        NOT: Negatif kontrol tek başına ikincil antikor kullanılarak yapılır.
      9. Yıkama adımını tekrarlayın (adım 3.3.2.7).
      10. Gelişmiş kemilüminesans (ECL) batı lekealt tabaka kiti ile membran ortaya (Malzemeler Tablosubakınız).
  4. Proteomik analiz
    1. Protein ekstraksiyonu ve jel içi sindirim
      1. EVs izole etmek ve konsantre 3.2.1 için 3.2.3 adımları tekrarlayın. EV protein ekstraksiyonu için adım 3.3.1'i tekrarlayın.
      2. %12 poliakrilamid jelin istifleme jelinde protein göçü yapın.
      3. RT 20 dakika için coomassie mavi ile jel proteinleri düzeltin.
      4. Her renkli jel parça excise ve 1 mm3küçük parçalar halinde kesilmiş.
      5. Jel parçalarını her çözeltiden 300 μL ile art arda yıkayın: 15 dk ultra saf su, 15 dakika için %100 asetonnitil (ACN), 15 dakika için 100 mM amonyum bikarbonat (NH4HCO3),ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) 15 dakika boyunca 100% ACN ve 5 dakika boyunca sürekli karıştırma ile %100 ACN.
      6. Vakum konsantratörü ile tamamen jel parçaları kurulayın.
      7. 100 μL 100 mM NH4HCO3 içeren 100 mM dithiothreitol ile 56°C'de 1 saat protein azaltımı yapın.
      8. RT'de karanlıkta 45 dakika boyunca 50 mM iodoacetamide içeren 100 mM NH4HCO3 ile protein alkiliyasyonu yapın.
      9. Jel parçalarını her çözeltiden 300 μL ile art arda yıkayın: 100 mM NH4HCO3 15 dakika, ACN:20 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) 15 dakika boyunca ve %100 ACN 5 dakika boyunca sürekli karıştırma ile.
      10. Tamamen bir vakum konsantratörü ile jel parçaları kuru.
      11. Protein sindirimini 20 mM NH4HCO3 gecede 37 °C'de 50 μL tripsin (12,5 g/mL) ile gerçekleştirin.
      12. 37 °C'de 30 dakika boyunca %100 ACN 50 000 ACN ve rt'de 15 dk sürekli karıştırarak sindirilmiş proteinleri jelden çıkarın.
      13. Aşağıdaki ekstraksiyon prosedürlerini iki kez tekrarlayın: 20 mM NH4HCO3 çözeltisinde %5'lik TFA'nın 50 μL'si 20 dk sürekli karıştırma ile.
      14. 10 dakika boyunca %100 ACN 100 μL'lik sürekli karıştırarak ekleyin.
      15. Bir vakum konsantratörü ile kuru sindirilmiş proteinler ve 20 μL% 0.1 TFA resuspend.
      16. Tatsuzlaştırma ve konsantre peptidler için C18 ters faz ortamına sahip 10 μL pipet ucu kullanarak numuneyi tuzdan arındırın (Malzeme Tablosunabakın) ve ACN:0.1% formik asit (FA) (80:20, v/v) ile elute peptidler.
      17. Sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) için numuneyi vakum konsantratörü ile tamamen kurutun ve %20'lik ACN:0.1% FA (2:98, v/v) oranında yeniden askıya alın.
    2. LC-MS/MS Analizi
      1. Sindirilmiş peptidi LC-MS/MS aletine yükleyin ve başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanan parametrelere göre numune ve veri analizi yapın42.
    3. Ham veri analizi
      1. Proteinleri tanımlamak ve her numunenin tanımlanmış proteinlerini standart parametreleri kullanarak nicel proteomik yazılım paketiyle karşılaştırmak için kütle spektrometresi verilerini işleyin.
      2. İhracat, standart parametreleri kullanarak, protein ağları ve biyolojik süreçleri tahmin eden bir yazılım EV pozitif örneklerden özel ve aşırı temsil proteinlerin listesi.
      3. Kesirlerde tanımlanan proteinlerin listesini Exocarta açık erişim veritabanındaki en iyi 100 EV belirteçleriyle karşılaştırın (Bkz. Malzemeler Tablosu).

4. Fonksiyonel EVs Etkileri Tsası

  1. PC-12 hücre hattında neurite outgrowth tsay
    1. Tam DMEM orta kültür PC12 hücre hattı (2 mM L-glutamin, 10% fetal at serumu (FHS), 5% fetal sığır serumu (FBS), 100 UI/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin).
      NOT: Sera tüm prosedürde exosome ücretsizdir.
    2. 24 kuyulu bir tabağa bir kapak camı (tüm kuyular) ekleyin; poli-D-lizin (0.1 mg/mL) ve tohum 260.000 hücreleri / iyi ile plaka kat.
    3. Hücreleri %5 CO2'ninaltında 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    4. 24 saat kuluçkadan sonra orta yı DMEM farklılaştırma ortamına (DMEM ile 2 mM L-glutamin, %0.1 FHS, 100 UI/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin) 1 x 106 mikroglia EV (adım 1.1.2) değiştirin.
      NOT: Kontrol durumu diferansiyasyon ortasında mikroglia EVs olmadan yapılır.
    5. Tohumlamadan sonra 4.
    6. Tohumlamadan sonra 7.
    7. 4 °C'de 30 dakika rodamin konjuge phalloidin ile hücreleri lekelayın ve PBS ile 3 kez (her biri 10 dakika) durulayın.
    8. Hücreleri seyreltilmiş Hoechst 33342 (1:10,000) ile RT'de 30 dakika boyunca lekelendirin ve PBS ile 3 kez (her biri 10 dakika) durulayın.
    9. Kapak camı floresan montaj ortamına sahip bir slaytüzerine monte edin (bkz. Malzemeler Tablosu).
    10. Bir konfokal mikroskop ile slayt analiz, her slayt 5 rasgele görüntü almak.
    11. Başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi otomatik bir niceliklendirme yazılımı (toplam neurite uzunluğu) kullanarak ölçü nötrit outgrowth43.
  2. Sıçan primer nöronlar üzerinde neurite outgrowth
    1. Poli-D-lizin (0.1 mg/mL) ve laminin (20 μg/mL) içeren 8 kuyulu cam kaydırağı katlayın.
    2. Uygun kültür ortamındaki kültür sıçanı ticari birincil nöronlar (bkz.2
      NOT: Sera tüm prosedürde ekzozomiçermez.
    3. Nöron kültürü ortamına 1 x 106 mikroglia EVs ekleyin ve 37 °C'de %5 CO2 altında 48 saat daha fazla kuluçkaya yatırın.
      NOT: Kontrol durumu nöron kültür orta mikroglia EVs olmadan yapılır.
    4. Hücreleri düzeltmek ve lekelemek için 4.1.6 ile 4.1.9 adımlarını izleyin.
    5. Slaytı analiz etmek için 4.1.10 ve 4.1.11 adımlarını izleyin.
  3. Glioma hücre istilası
    1. Tam DMEM ortamda C6 sıçan glioma hücreleri resuspend (DMEM ile 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1x antibiyotikler) içeren 5% kollajen içeren 8,000 hücrelerin son konsantrasyonda 20 μL.
      NOT: Sera tüm prosedürde ekzozomiçermez.
    2. 60 mm'lik doku kültürü kabının dibine 5 mL PBS yerleştirin. 20 μL (8.000 hücre) hücre süspansiyonunun kapağının kapağını ve tortu damlalarını kapağın altına ters çevirin.
    3. Kapağı PBS dolu alt haznesine ters çevirin ve hücre küreselleri oluşana kadar plakayı 37 °C ve %5 CO2'de 72 saat inkübüne çevirin.
    4. 2.2 mg/mL kollajen karışımına (2 mL büyükbaş kollajen tip I çözeltisi [3 mg/mL] 250 μL 10x minimum esansiyel ortam (MEM) ve 0,1 M sodyum hidroksit 500 μL) ile 1 x 108 makrofaj EVs (adım 1.2.2) ekleyin.
      NOT: Kontrol durumu kollajen karışımında makrofaj EV'ler olmadan gerçekleştirilir.
    5. Hücre küresellerini gömmek için 24 kuyuluk bir plaka içinde EVs içeren kollajen karışımı dağıtın.
    6. Her kuyunun ortasına yeni oluşan hücre spheroidlerini yerleştirin.
    7. Jeli katılaştırmak için 37°C'de 30 dakika ve %5 CO2'de plakayı kuluçkaya yatırın.
    8. Daha sonra, her kuyudaki kollajen matrisinüzerine 400 μL'lik tam DMEM ortamı nı kaplayın.
    9. 37 °C ve %5 CO2'detoplam 6 gün boyunca komple sistemi kuluçkaya yatırın.
      NOT: Küresel hücre istilası 4x/0.10 N.A. hedefi kullanılarak ters ışık mikroskobu kullanılarak dijital fotoğrafçılık tarafından izlenir.
    10. Her kuyunun her gün görüntülerini edinin.
    11. Görüntüleri işlemek ve daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi yazılım kullanarak hücre küresel alanların işgali ölçmek42.
      NOT: İstila ve küresel alanlar her gün invazyon ve 0.gün ölçülen küresel bölgelere normalleştirildi.

Sonuçlar

Biyolojik etkilerin hücre dışı veziküllere (EVs) atflanmasının önündeki en büyük zorluklardan biri, EV'leri tüm kültür ortamından izole edebilme yeteneğidir. Bu raporda, EV belirteçlerini doğrulamak ve biyoaktif bileşikleri tanımlamak için protein imzalarının büyük ölçekli analizine bağlı olarak ultracentrifugation (UC) ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) kullanılarak bir yöntem salıyoruz. Makrofaj veya mikroglia kaynaklı EV'ler sırasıyla 24 saat veya 48 h kültüründen sonra şart...

Tartışmalar

Merkezi sinir sistemi (CNS) hücre-hücre iletişimi homeostaz için gerekli normal nöronal fonksiyonları düzenleyen karmaşık birdokudur 30. EVs şimdi yaygın olarak incelenmiş ve hücre-hücre iletişimi için önemli moleküler kargolar olarak tanımlanan31. Özellikle alıcı hücrelere aracıbir kokteyl teslim ederek sağlıklı ve patolojik koşullarda işlevlerini etkileyen32. Son çalışmalar EVs CNS önemli bir rol oynadığını gös...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Sunulan çalışma Ministère de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche ve INSERM tarafından desteklendi. BiCeL-Campus Scientific City Facility'i enstrümanlara ve teknik tavsiyelere erişim için takdir ediyoruz. Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard ve Isabelle Fournier'i Kitle spektrometresi yardımı için minnetle kabul ediyoruz. Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli ve Pierre-Eric Sautière'i bilimsel ve teknik gelişmelere olan güçlü katkılarından dolayı minnetle kabul ediyoruz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-rad4561045EDU 
AcetonitrileFisher ChemicalsA955-1 
Amicon 50 kDa centrifugal filterMerckUFC505024 
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich9830 
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659)Santa-cruzsc-13119 
B27 Plus supplementGibcoA3582801 
BenchMixer V2 Vortex MixerBenchmark ScientificBV1003 
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)Bio-Rad5000006 
C18 ZipTipsMerck MilliporeZTC18S096 
C6 rat glioma cellATCCATCC CCL-107 
Canonical tubesSarstedt62.554.002 
CentrifugeEppendorf5804000010 
CO2 IncubatorThermoFisher  
Confocal microscope LSM880Carl ZeissLSM880 
Cover glassMarienfeld111580 
Culture Dish (60 mm)Sarstedt82.1473 
DithiothreitolSigma-Aldrich43819 
DMEMGibco41966029 
EASY-nLC 1000 Liquid ChromatographThermoFisher  
Electron microscope JEM-2100JEOL  
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acidSigma-Aldrich03777-10G 
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)  http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine SerumGibco16140071 
Fetal Horse SerumBiowestS0960-500 
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001 
Fisherbrand Q500 Sonicator with ProbeFisherbrand12893543 
FlexAnalysisBrucker  
Fluorescence mounting mediumAgilentS3023 
Formic AcidSigma-Aldrich695076 
Formvar-carbon coated copper gridsAgar scientific LtdAGS162-3 
GlucoseSigma-AldrichG8769 
GlutaraldehydeSigma-Aldrich340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
IdoacetamideSigma-AldrichI1149 
InstantBlue Coomassie Protein StainExpedeonISB1L 
Invert light microscope CKX53Olympus  
L-glutamineGibco25030-024 
LabTek II 8 wells Nunc154534 
Laemmli 2XBio-Rad1610737 
LamininCorning354232 
MaxQuant software (proteins identification software)  https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stellBrucker8268711 
MEM 10XGibco21090-022 
MethylcelluloseSigma-AldrichM6385-100G 
MiliQ waterMerck Millipore  
MilkRegilaitREGILAIT300 
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis CellBio-Rad1658000FC 
MonoP FPLC columnGE Healthcare no longer available
Nanosight NS300Malvern PanalyticalNS300 
NanoSight NTA software v3.2Malvern Panalytical  
NanoSight syringe pumpMalvern Panalytical  
NeurobasalGibco21103-049 
Nitrocellulose membraneGE Healthcare10600007 
Nonidet P-40Fluka56741 
Nunc multidish 24 wellsThermoFisher82.1473 
ParaformaldehydeElectro microscopy Science15713 
PC-12 cell lineATCCATCC CRL-1721 
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122 
Peptide calibration mixLaserBio LabsC101 
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-035-003 
Perseus software (Processing of identified proteins)  https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugateSanta-cruzsc-362065 
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma-Aldrich78830 
Phosphate Buffer SalineInvitrogen14190094no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µmpluriSelect43-50060 
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407 
Polycarbonate centrifuge tubesBeckman Coulter355651 
Protease InhibitorSigma-AldrichS8830-20TAB 
PureColCell Systems5005 
Q-Exactive mass spectrometerThermoFisher  
rapifleX mass spectrometerBrucker  
Rat cortical neuronsCell ApplicationsR882N-20Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture MediumCell ApplicationsR620K-100Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophagesCell ApplicationsR8818-10a 
Rat primary microgliaLonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE Healthcare17014001 
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111 
SlideDustsher100204 
Sodium ChlorideScharlauSO0227 
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL3771 
Sodium FluorideSigma-AldrichS7920-100G 
Sodium hydroxideScharlabSO0420005P 
Sodium pyrophosphateSigma-AldrichS6422-100G 
SpeedVac Vacuum ConcentratorThermoFisher  
String software (functional protein association networks)  https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration SubstrateThermoFisher34075 
Syringe 1.0 mLTerumo8SS01H1 
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cellBio-Rad1703940 
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508 
TrisInterchimUP031657 
Tris-GlycineEuromedexEU0550 
Tween 20Sigma-AldrichP2287 
UltracentrifugeBeckman CoulterA95765 
Ultracentrifuge Rotor 70.1 TiBeckman Coulter342184 
Uranyl acetateAgar Scientific LtdAGR1260A 
Whatman filter paperSigma-AldrichWHA10347510 
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acidSigma-AldrichC2020-25G 

Referanslar

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
  19. Murgoci, A. -. N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -. M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -. M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 160mm n fonksiyonlarmikrogliamakrofajlarn ronlarglioma h crelerih cre d vezik ller

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır