Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הדו ח הנוכחי מדגיש את הדרישות כרונולוגי לחילוץ שלפוחית לפוחית (EV) בידוד מ מיקרוגלייה או דם מקרופאגים. Microglia-EVs נגזר הוערכו כרגולטורים של neurite מוצלח בעוד דם מקרופאג-נגזר EVs נחקרו בשליטה של הפלישה C6 glioma תא ב מבחנה. המטרה היא להבין טוב יותר אלה פונקציות EV כמו מגשרים החיסונית במיקרו סביבות מסוימות.

Abstract

מצב הנוירודלקתי של מערכת העצבים המרכזית (CN) ממלא תפקיד מרכזי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. Microglia, התאים החיסוניים תושב במוח, ולפעמים את מח עצם החדירה מקרופאגים (BMDMs), לווסת את הפרופיל הדלקתי של המיקרוסביבה שלהם ב-CN. עכשיו זה מקובל כי החילוץ שלפוחית הזרע (EV) אוכלוסיות מתאי החיסון לפעול כמגשרים החיסונית. לפיכך, האיסוף והבידוד שלהם חשובים לזיהוי תוכנם, אך גם להערכת ההשפעות הביולוגיות שלהם על תאי הנמען. הנתונים הנוכחיים להדגיש דרישות כרונולוגי עבור EV בידוד מתאי מיקרוגלייה או דם מקרופאגים כולל ביטול הקוד הכולל ואת גודל ההדרה כרומטוגרפיה (SEC) צעדים. ניתוח פרוטמית לא ממוקד התיר את האימות של חתימות חלבון כמו סמנים EV והתאפיין את תוכן EV פעיל ביולוגית. Microglia-EVs נגזר היו גם בשימוש פונקציונלי על התרבות העיקרית של נוירונים כדי להעריך את החשיבות שלהם כמגשרים החיסונית neurite outgrowth. התוצאות הראו כי מיקרוגליה נגזר EVs לתרום כדי להקל על neurite מוצלח בתוך מבחנה. במקביל, דם מקרופאג נגזר EVs היו בשימוש פונקציונלי כמגשרים החיסונית בתרבויות ספרואיד של התאים C6 glioma, התוצאות מראה כי אלה EVs שלוט הפלישה התאים glioma בתוך מבחנה. דו ח זה מדגיש את האפשרות להעריך את הפונקציות של תא החיסון EV-בתיווך, אך גם להבין את הבסיסים המולקולריים של תקשורת כזו. פענוח זה יכול לקדם את השימוש בשלפוחיות טבעיות ו/או בהכנת הפריה חוץ גופית של שלפוחיות טיפוליות כדי לחקות את התכונות החסינות של המיקרו-סביבה של הפתווגיות של ה-CN.

Introduction

נוירופתוגיות רבות קשורות למצב הנוירו-דלקתי שהוא מנגנון מורכב שנחשב יותר ויותר, אך עדיין מובן בצורה גרועה משום שהתהליכים החיסוניים מגוונים ותלויים בסביבת התא. אכן, הפרעות ה-CN לא מערבת בשיטתיות את אותם אותות הפעלה ואוכלוסיות תאים החיסונית ולכן התגובות pro-או אנטי דלקתיות קשה להעריך כסיבות או השלכות של הפתווגיות. מקרופאגים תושב המוח בשם "microglia" נראה להיות בממשק בין מערכת העצבים והחיסונית1. Microglia יש מוצא מיאלואידית ונגזר שק החלמון במהלך המטפיאה פרימיטיבי ליישב את המוח, ואילו מקרופאגים היקפיים נגזרות הכבד עובר במהלך המטפיאה הסופית להפוך מקרופאגים היקפיים2. התאים מיקרוגלייה לתקשר עם נוירונים ותאי העצב-הנגזרים הנגזרות גליה כגון אסטרוציטים ו oligodendrocytes הפוך3. מספר מחקרים שנעשו לאחרונה הוכיחו כי מיקרוגלייה מעורבים בפלסטיות העצבית במהלך פיתוח המוח והומאוסטזיס רקמות למבוגרים, וגם במצב דלקתי הקשורים עם מחלות ניווניות4,5. אחרת, את היושרה של מכשול המוח בדם ניתן להתפשר על הפתווגיות אחרות. התגובות החיסונית, במיוחד בסרטן gliנובלסטומה מרובה, אינם נתמכים רק על ידי תאים מיקרוגלייה כמו מכשול המוח בדם הוא מאורגן מראש דרך תהליכים אנגיוגנטית ונוכחות של כלי הלימפה6,7. לכן, מח עצם גדול הנגזר מקרופאגים (BMDMs) הסתננות מתרחשת בגידול במוח ברחבי הגידול תלויי מנגנוני אנגיוגנזה8. התאים הסרטניים להפעיל השפעה משמעותית על מסכת BMDMs המובילה לתכונות מדכאים חיסוני וצמיחה גידול9. לפיכך, התקשורת בין התאים החיסוניים לבין מיקרואקולוגיה המוחית קשה להבנה כאשר מקור התאים ואותות ההפעלה מגוונים ב-10,11. ולכן מעניין לעצור את התפקודים של חתימות מולקולריות הקשורות לתאי החיסון בתנאים פיסיולוגיים. בהקשר זה, התקשורת תא התא בין תאים חיסוניים לבין מיקרוסביבה התא ניתן ללמוד באמצעות שחרור של שלפוחיות ושלפוחית (EVs).

הEVs מתוחקר יותר ויותר בוויסות התפקודים החיסוניים בריאים ובתנאים פתולוגיים12,13. ניתן לקחת בחשבון שתי אוכלוסיות, אקזומים ומיקרוטיבים. הם מציגים טווחי ביוגנזה וגדלים שונים. האקסוזומים הם שלפוחיות של ~ 30 – 150 בקוטר nm והם מופקים ממערכת אנדוזוממית מופרש במהלך המיזוג של גופים multivesicular (MVBs) עם קרום פלזמה. המיקרושלפוחיות הם כ-100 – 1000 ננומטר בקוטר והם מופקים על ידי החוצה מתוך ממברנה פלזמה תא14. מכיוון שהאקסוחלק לעומת האפליה המיקרובעית עדיין קשה להבין לפי הגודל והדפוסים המולקולריים, נשתמש רק במונח EVs בדו ח הנוכחי. התקשורת המשויכת EV המייצגת את מנגנון האבות הקדמון מאז המחקרים הראו את מעורבותם במינים חסרי חוליות, כולל נמטודס, חרקים או annelids15,16. יתר על כן, התוצאות מראות כי EVs יכול לתקשר עם תאים ממינים שונים להפגין מנגנון זה להיות מערכת נעילת מפתח, מבוסס על הראשון על פני השטח מולקולה זיהוי בין שלפוחיות ותאי הנמען ולאחר מכן מאפשר את ספיגת המגשרים16,17. אכן, EVs מכילים מולקולות רבות כמו חלבונים (למשל, אנזימים, התמרה אותות, ביוגנזה פקטור), שומנים (g., ceramide, כולסטרול) או חומצות גרעין (g., DNA, mRNA או miRNAs) מתנהג כמו הרגולטורים ישיר או עקיף של פעילויות תא הנמען14. זו הסיבה מחקרים מתודולוגיים נערכו גם על תאים חיסוניים כדי לבודד EVs ולאפיין במלואו את חתימות החלבון שלהם18,19.

המחקרים המוקדמים ביותר הפגינו שחרורו של אקסוזומים מיקרוגליה הראשי של חולדה תרבותית כמנגנון inducible בעקבות הפעלה התלויה Wnt3a או סרוטונין20,21. מבחינה פונקציונלית בתוך המוח, microglia-נגזר EVs להסדיר את השחרור שלפוחית סינפטית על ידי מסופים טרום סינפטיות בנוירונים תורמים לשליטה של היכולת העצבית הנוירולית22,23. Microglia-נגזר EVs יכול גם להפיץ את התגובה הדלקתית ציטוקינים בתיווך באזורים גדולים במוח24,25. חשוב מכך, ליגניות מגוונות עבור משפחת הקולטן כמו אגרה עשוי להפעיל הפקות ספציפיות של EVs ב מיקרוגלייה26. לדוגמה, במחקרים חוץ גופית מראים כי lps-הופעל מיקרוגלייה BV2 תאים קווי לייצר תוכן EV דיפרנציאלי כולל הפרו-דלקתיות ציטוקינים27. לכן, המגוון הפונקציונלי של אוכלוסיות משנה של תאים חיסוניים ב-cn, מיקרוגלייה והחדירה bmdms, עשוי להיות מוערך דרך אוכלוסיות ev שלהם כולל ההשפעה EV על תאי הנמען וזיהוי של תוכן EV.

בעבר תיארנו שיטות כדי להעריך את המאפיינים הפונקציונליים של microglia-ו-bmdm נגזר EVs לאחר בידוהם16,19. בדוח הנוכחי, אנו מציעים להעריך באופן עצמאי את ההשפעה של microglia-נגזר EVs על neurite outgrowth, ואת ההשפעה של מקרופאג-נגזר EVs על השליטה של אגרגטים תא glioma. מחקר זה מציע גם ניתוח הפרוטאומית רחב של שברים EV כדי לאמת את ההליך בידוד EV, כמו גם לזהות את חתימות החלבון הפעיל ביולוגית. ההשפעות מועילות הפענוח המולקולרי של תוכן EV יכול לעזור מניפולציה אפשרי שלהם להשתמש כמו סוכנים טיפוליים בהפרעות במוח.

Protocol

1. התרבות הראשית של Microglia/מקרופאגים

  1. התרבות הראשית של מיקרוגלייה
    1. תרבות מסחרית חולדה מיקרוגליה ראשונית (2 x 106 תאים) (לראות את הטבלה של חומרים) ב-בינונית שונה של הנשר מאוד (dmem) שיושלם עם 10% אקסוזום הסרום, 100 U/mL של פניצילין, 100 μg/mL סטרפטומיצין, ו 9.0 g/L גלוקוז ב 37 ° c ו 5% CO2.
    2. לאסוף את המדיום הממוזג אחרי תרבות 48 h ולהמשיך לבידוד של EVs.
  2. התרבות העיקרית של מקרופאגים
    1. תרבות מסחרי חולדה הראשי מקרופאגים ראשוניים (1 x 106 תאים) במדיום המסופקים על ידי היצרן (לראות את טבלת חומרים) ב 37 ° צ' ו 5% CO2, עם הסרום אקסוזום חינם.
    2. לאסוף את המדיום הממוזג לאחר התרבות 24 h ולהמשיך לבידוד של EVs.

2. בידוד של EVs

  1. טרום בידוד של EVs מבינוני ממוזג
    1. העבר את מדיום התרבות הממוזגת מ-מיקרוגלייה או תרבויות מקרופאג (שלבים 1.1.2 או 1.2.2) לתוך צינור חרוט.
    2. צנטריפוגה ב 1,200 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי לצנפה את התאים.
    3. העבר את הסופרנטנט לצינור חרוט חדש. צנטריפוגה ב 1,200 x g עבור 20 דקות ב-RT כדי לחסל גופים אפוטוטיים.
    4. העבר את supernatant לתוך צינור פוליקרבונט 10.4 mL ולהעביר את הצינור לתוך הרוטור מ70.1 Ti. Ultracentrifuge ב 100,000 x g עבור 90 דקות ב 4 ° c כדי גלולה EVs.
    5. להיפטר supernatant ולהשעות את הגלולה המכילה EVs ב 200 μl של 0.20 יקרומטר מסוננים מאגר פוספט מלח (PBS).
  2. בידוד של EVs
    1. הכנת עמודת כרומטוגרפיה בגודל תוצרת בית (SEC)
      1. רוקן כרומטוגרפית זכוכית (אורך: 26 ס"מ; קוטר: 0.6 ס מ) (ראה את הטבלה של חומרים), לשטוף ולעקר אותו.
      2. הצב מסנן של 60 יקרומטר בתחתית העמודה.
      3. מחסנית העמודה עם מטריצה בסיס סינון ג'ל מקושרת בין העמודים ליצירת שלב נייח של קוטר 0.6 ס מ וגובה של 20 ס מ.
      4. לשטוף את השלב עם 50 mL של 0.20 יקרומטר מסוננים PBS. במקרה הצורך, ניתן להשתמש בחנות ב-4 ° צ'.
    2. הניחו את הגלולה EV הושעה מחדש על גבי השלב הנייח של העמודה SEC.
    3. לאסוף 20 שברים רציפים של 250 μl כאשר ממשיכים להוסיף 0.20 יקרומטר מסוננים PBS בחלק העליון של השלב הנייח כדי למנוע ייבוש של העמודה. אחסן את השברים ב-20 ° c במידת הצורך.
      הערה: אחסון ארוך יותר משבוע אחד ניתן לבצע ב-80 ° צ' כדי לשמור על תקינות EV לניתוח מולקולרי.
  3. מטריקס סייעה בניתוח הספקטרומטר המסה של השברים ב-SEC
    1. המשך לבידוד EV כמתואר בסעיף 2.2.
    2. להשעות מחדש את הגלולה EV עם 200 μL של פתרון ערבוב של כיול פפטיד (לראות את הטבלה של חומרים).
    3. המשך לאוסף EV כפי שמתואר בסעיפים 2.2.1 כדי 2.2.3.
    4. יבש לחלוטין את השבר עם מרכז ואקום.
    5. מרכיבים מחדש את השברים עם 10 μL של 0.1% החומצה trifluoroacetic (TFA).
    6. מערבבים 1 μL של שבר מחדש עם 1 μL של α-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (מטריצות) על צלחת פלדה MALDI מלוטש היעד.
    7. לנתח את כל השברים עם ספקטרומטר מסה של MALDI.
    8. ניתוח ספקטרום שנוצר עם תוכנה ייעודית (ראה טבלת חומרים).

3. אפיון EVs

  1. ננו-חלקיק ניתוח מעקב (נ. ת. ע)
    הערה:     ניתוח נ. ת. ע מבוצע עם מכשיר לניתוח מעקב ננו-חלקיק (ראה טבלת חומרים) ומשאבת מזרק אוטומטית.
    1. לעשות דילול (טווח של 1:50 עד 1:500) של כל שבר שניה משלב 2.2.3 עם 0.20 יקרומטר מסוננים PBS.
    2. מערבולת הפתרון כדי לחסל אגרגטים EV.
    3. לשים את הפתרון מדולל ב 1 מזרק mL ולמקם אותו משאבת מזרק אוטומטי.
    4. התאם את הגדרת המצלמה לרמת הרווח (3) ולרמת המצלמה (13).
    5. לחץ על הפעלה והפעל את הסקריפט הבא.
      1. העמיסו את המדגם בתא ניתוח (שיעור אינפוזיה: 1,000 עבור 15 s).
      2. הקטן והצב את זרימת המהירות להקלטת וידאו (שיעור אינפוזיה: 25 עבור 15 s). לכידת שלושה קטעי וידאו רצופים 60 s של זרימת החלקיקים.
      3. כוונן את רמת המצלמה (13) ואת סף הזיהוי (3) לפני ניתוח סרטי וידאו. לחץ על הגדרות | אישור כדי להתחיל את הניתוח ולחץ על ייצוא כאשר הניתוח מתבצע.
    6. בין כל ניתוח שבר, לשטוף עם 1 mL של 0.20 יקרומטר מסוננים PBS.
  2. ניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני (EM)
    1. בודד EVs כפי שמתואר בסעיף 2.
      הערה: אין צורך בתנאים סטריליים.
    2. חזור על סעיף 3.1 לכמת EVs.
      הערה: רק שברים חיוביים ישמשו עבור ניתוח EM.
    3. השתמש במסנן צנטריפוגלי 50 kDa (ראה טבלת חומרים) כדי לרכז שברים מכילים EV.
    4. השעיית מחדש מרוכז EVs ב 30 μL של 2% פאראמפורמלדהיד (בתחתית).
    5. טען 10 μL של המדגם אל רשת נחושת מצופה פחמן.
    6. דגירה של 20 דקות בסביבה רטובה.
    7. חזור על הצעדים ה3.2.5 וה3.2.6 לספיגה טובה של המדגם ברשת.
    8. להעביר את הרשת לתוך טיפה של 1% גלוטאלדהיד ב-PBS עבור 5 דקות ב-RT.
    9. לשטוף את המדגם עם מים באולטרסאונד מספר פעמים.
    10. בניגוד למדגם עבור 10 דקות על הקרח עם תערובת של 4% uranyl אצטט ו 2% מתילצלולוזה (1:9, v/v). הסרת עודפי התערובת באמצעות נייר סינון.
    11. נגב את המדגם ולהתבונן בו תחת מיקרוסקופ אלקטרוני שידור ב 200 kV (לראות את הטבלה של חומרים).
  3. אנליזה מערבית של כתמי אבן
    1. עקירת חלבון
      1. חזור על השלבים ה3.2.1 ל3.2.3 כדי לבודד ולרכז את EVs.
      2. מערבבים 50 μL של מאגר ריפה (150 מ"מ נתרן כלוריד [הנאל], 50 mM טריס, 5 מ"מ אתילן גליקול-bis (2-עמינח)-N, n, N, N′-הטטראצטט חומצה [EGTA], 2 מ"מ מתוך החומצה הטאצנבית [EDTA], 100 מילימטר נתרן פלואוריד [NaF], 10 מילימטר מנתרן פירופוספט, 1% Nonidet P-40, 1 מ"מ פנילמתיונין פלופקסיל [PMSF], 1x מעכב פרוטאז) עם מדגם EV (25 μL כתוצאה מריכוז EV על מסנן) עבור 5 דקות על הקרח כדי לחלץ חלבונים.
      3. Sonicate עבור 5 s (משרעת: 500 W; תדירות: 20 kHz), 3 פעמים על קרח.
      4. הסרת פסולת vesicular על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 10 דקות, ב 4 ° c.
      5. לאסוף את supernatant ולמדוד את הריכוז חלבון עם שיטת ברדפורד החלבון שיטה.
    2. Dodecyl סולפט נתרן פוליאקרילמיד ג'ל לג (SDS-PAGE) ובלוק מערבי
      1. מערבבים חלבון תמציות (30 μg) עם מאגר לדוגמה 5c Laemmli (v/v).
      2. העמיסו את תערובת החלבון ב-12% פוליאקרילאמיד ג'ל.
      3. להעביר את החלבונים ב ג'ל עם מאגר ה-, התכנית (25 מ"מ 8.5 Tris pH, 192 מ"מ גליצין, ו 0.1% SDS), ב 70 V עבור 15 דקות ו-120 V עבור 45 min.
      4. העבר את החלבונים אל ממברנה ניטרוצלולוזה עם מערכת חצי יבשה ב 230 V עבור 30 דקות.
      5. רוויה הקרום עבור 1 h ב RT עם חסימת מאגר (0.05% רצף 20 w/v, 5% אבקת חלב w/v ב 0.1 M PBS, pH 7.4).
      6. מעכלת את הקרום לילה ב 4 ° צ' עם העכבר מונושבטיים נגד האדם בהלם חום אנושי חלבון 90 (HSP90) הנוגדן מדולל במאגר חסימת (1:100).
      7. לשטוף את הקרום שלוש פעמים עם הערוץ הPBS (PBS, 0.05% רצף 20 w/v) עבור 15 דקות.
      8. מארג הממברנה עבור 1 h ב RT עם חזרת עז peroxidase-מעלה מעלה אנטי עכבר משני הנוגדן מדולל בתוך חסימת מאגר (1:10000).
        הערה: שליטה שלילית מבוצעת באמצעות נוגדנים משניים בלבד.
      9. חזור על שלב הכביסה (שלב 3.3.2.7).
      10. לחשוף את הקרום עם משופר כימובסנס (ECL) ערכת המצע בלוק מערבי (ראה טבלת חומרים).
  4. אנליזה פרוטאומית
    1. מיצוי החלבונים והעיכול בתוך ג'ל
      1. חזור על השלבים ה3.2.1 ל3.2.3 כדי לבודד ולרכז את EVs. חזור על שלב 3.3.1 עבור חילוץ חלבון EV.
      2. לבצע הגירה חלבון בערימת ג'ל של 12% פוליאקרילאמיד ג'ל.
      3. תקן את החלבונים ג'ל עם כחול coomassie עבור 20 דקות ב RT.
      4. בבלו כל פיסת ג'ל צבעוני וחותכים אותו חתיכות קטנות של 1 מ"מ3.
      5. לשטוף את חתיכות ג'ל ברציפות עם 300 μl של כל פתרון: מים אלקטרופורזה עבור 15 דקות, 100% acetonitrile (acn) עבור 15 דקות, 100 mM אמוניום ביקרבונט (NH4hco3) עבור 15 דקות, acn: 100 מ"מ NH4hco3 (1:1, v/v) עבור 15 דקות, ו 100% acn עבור 5 דקות עם ערבוב רציפה.
      6. יבש חתיכות ג'ל לגמרי עם מרכז ואקום.
      7. לבצע הפחתת חלבון עם 100 μL של 100 mM NH4hco3 המכיל 10 מילימטר dithioitol עבור 1 h ב 56 ° c.
      8. לבצע האלקיללציה חלבון עם 100 μL של 100 mM NH4hco3 המכיל 50 mm iodoamide עבור 45 מינימום בחשיכה ב-RT.
      9. לשטוף את חתיכות ג'ל ברציפות עם 300 μL של כל פתרון: 100 mM של NH4hco3 עבור 15 דקות, Acn: 20 מ"מ nh4hco3 (1:1, v/v) עבור 15 דקות, ו 100% acn עבור 5 דקות עם ערבוב רציפה.
      10. יבש לחלוטין את חתיכות ג'ל עם מרכז ואקום.
      11. לבצע עיכול חלבון עם 50 μL של טריפסין (12.5 μg/mL) ב 20 מ"מ NH4hco3 לילה ב 37 ° c.
      12. לחלץ את החלבונים מתעכל מן הג עם 50 μL של 100% ACN עבור 30 דקות ב 37 ° צ' ולאחר מכן 15 דקות ב-RT עם ערבוב רציפה.
      13. חזור על הליכי החילוץ הבאים פעמיים: 50 μL של 5% TFA ב 20 מ"מ NH4hco3 פתרון עבור 20 דקות עם ערבוב רציף.
      14. הוסף 100 μL של 100% ACN עבור 10 דקות עם ערבוב רציף.
      15. יבש חלבונים מתעכל עם מרכז ואקום ולהשעות מחדש 20 μL של 0.1% TFA.
      16. Desalt המדגם באמצעות טיפ 10 μl הפיפטה עם סי18 בשלב הפוך מדיה להתפלת ולהתרכז פפטידים (לראות את הטבלה של חומרים) ופפטידים elute עם acn: 0.1% החומצה פורמית (ה-FA) (80:20, v/v).
      17. יבש לחלוטין את המדגם עם מרכז ואקום ולהשעות מחדש 20 μL של ACN: 0.1% פא (2:98, v/v) עבור כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריה ספקטרומטר מסה (LC-MS/MS).
    2. ניתוח-MS/MS-מחקר
      1. טען את הפפטיד מתעכל לתוך כלי LC-MS/MS ולבצע דגימה וניתוח נתונים על פי פרמטרים המתוארים בפירוט במקום אחר42.
    3. ניתוח נתונים גולמיים
      1. עבד נתונים ספקטרומטר מסה כדי לזהות חלבונים ולהשוות חלבונים מזוהים של כל מדגם עם חבילת תוכנה פרוטאומניקס כמותית באמצעות פרמטרים סטנדרטיים.
      2. ייצוא, שימוש בפרמטרים סטנדרטיים, רשימה של חלבונים בלעדיים ומיוצגים מחדש מ-EV דגימות חיוביות בתוכנה חיזוי רשתות חלבונים ותהליכים ביולוגיים.
      3. השוו את רשימת החלבונים המזוהים בשברים עם החלק העליון 100 EV סמנים ממסד הנתונים הפתוח אקסוכרטה (לראות את הטבלה של חומרים).

4. שיטת השפעות EVs פונקציונלית

  1. Neurite מוצלח שיטת הצמיחה על PC-12 קו התא
    1. התרבות PC12 קו התא בינונית DMEM דיום מלאה (2 מ"מ L-גלוטמין, 10% סרום הסוס העוברי (FHS), 5% סרום בפרה העובר (FHS), 100 UI/משתמש/למשתמש הפניצילין, 100 μg/mL סטרפטומיצין).
      הערה: הסרה בחינם. בתהליך כולו
    2. להוסיף זכוכית כיסוי (כל הבארות) לצלחת 24-טוב; מעיל את הצלחת עם פולי-D-ליזין (0.1 mg/mL) ו seed 260,000 תאים/גם.
    3. מודיית את התאים ב 37 ° c תחת 5% CO2.
    4. לאחר 24 שעות של דגירה, לשנות את המדיום לבידול dmem דיום בינונית (dmem עם 2 מ"מ L-גלוטמין, 0.1% fhs, 100 UI/ml פניצילין, 100 μg/ml סטרפטומיצין) עם 1 x 106 מיקרוגלייה EVs (משלב 1.1.2).
      הערה: תנאי הבקרה מבוצע ללא מיקרוגלייה EVs במדיום בידול.
    5. ביום 4 לאחר זריעה, לטעון את כל הבארות עם 100 μL של מדיום מלאה DMEM.
    6. ביום 7 לאחר זריעה, לתקן את התאים עם 4% בכיוון הערוץ 20 דקות ב RT ולשטוף שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם PBS.
    7. הכתם את התאים עם מעלה מעלה phalloidin עבור 30 דקות ב 4 ° צ' ולשטוף 3 פעמים (10 דקות כל אחד) עם PBS.
    8. כתם את התאים עם מדולל Hoechst 33342 (1:10000) עבור 30 דקות ב RT ולשטוף 3 פעמים (10 דקות כל אחד) עם PBS.
    9. הבהר את זכוכית המכסה בשקופית עם הרכבה בינונית (ראה טבלת חומרים).
    10. לנתח את השקופית עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, לקחת 5 תמונות אקראיות של כל שקופית.
    11. מדידת neurite מוצלח באמצעות תוכנת קוונפיקציה אוטומטית (סה כ neurite אורך) כפי שמתואר בפירוט במקום אחר43.
  2. Neurite מוצלח על הנוירונים הראשי חולדה
    1. מעיל a 8-הבאר זכוכית שקופית עם פולי-D-ליזין (0.1 mg/mL) ו-למינציה (20 μg/mL).
    2. התרבות עכברוש מסחרי הנוירונים הראשי במדיום התרבות המתאימה (ראה טבלת חומרים) על ידי ציפוי 50,000 תאים לכל טוב והוא דגירה את התאים ב 37 ° צ' תחת 5% CO2 עבור 48 h.
      הערה: . ההליך הינו חופשי בתהליך כולו
    3. הוסף 1 x 106 מיקרוגלייה EVs כדי בינוני תרבות העצב ו דגירה ב 37 ° צ' תחת 5% CO2 עבור 48 h יותר.
      הערה: תנאי הבקרה מבוצע ללא מיקרוגלייה EVs במדיום תרבות העצב.
    4. בצע את השלבים 4.1.6 כדי 4.1.9 לתקן ולהכתים את התאים.
    5. בצע את השלבים 4.1.10 ו-4.1.11 כדי לנתח את השקופית.
  3. הפלישה לתאים glioma
    1. השעיה מחדש C6 בתאי glioma עכברוש בינונית DMEM דיום מלאה (DMEM עם 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1x אנטיביוטיקה) המכיל 5% קולגן בריכוז הסופי של 8,000 תאים ב 20 μL.
      הערה: . ההליך הינו חופשי בתהליך כולו
    2. מקום 5 מ ל של PBS בתחתית הצלחת התרבות 60 מ"מ הרקמה. היפוך המכסה ואת טיפות הפקדה של 20 μL (8,000 תאים) של התא ההשעיה על החלק התחתון של המכסה.
    3. היפוך המכסה על החדר התחתון ממולא PBS ו מודקת את הצלחת ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 72 h עד spheroids התאים נוצרות.
    4. הוסף 1 x 108 מקרופאג EVs (משלב 1.2.2) כדי 2.2 Mg/ml תערובת קולגן (2 מ ל של סוג קולגן של שור אני פתרון [3 מ"ג/ml] עם 250 μl של 10x בינוני חיוני מינימלי (זיכרון) ו 500 μl של 0.1 M נתרן הידרוקסיד).
      הערה: תנאי הבקרה מבוצע ללא מקרופאג EVs בתערובת הקולגן.
    5. הפץ את תערובת הקולגן המכילה EVs בצלחת 24-היטב להטבעת spheroids תאים.
    6. השתל את מספרי הטלפון החדשים שנוצרו במרכז כל באר.
    7. מודקת את הצלחת 30 דקות ב 37 ° צ' ו 5% CO2 כדי לחזק את ג'ל.
    8. לאחר מכן, כיסוי 400 μL של מדיום מלאה DMEM על מטריצת הקולגן בכל באר.
    9. מודטה את המערכת המלאה עבור סך של 6 ימים ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
      הערה: הפלישה התא מחוץ ספרואיד הוא מנוטר על ידי צילום דיגיטלי באמצעות מיקרוסקופ אור הפוכה באמצעות מטרה 4x/0.10 N.A..
    10. השיגו תמונות של כל. אחד מהם כל יום
    11. לעבד תמונות ולכמת הפלישה של אזורי תא ספרואיד באמצעות התוכנה כפי שתוארה בעבר בפירוט42.
      הערה: הפלישה ואזורים ספרואיד היו מנורמל עבור כל יום לפלישה ואזורים ספרואיד למדוד ביום 0.

תוצאות

אחד האתגרים העיקריים לייחוס השפעות ביולוגים לEVs ושלפוחיות (מידה) היא היכולת לבודד את EVs מתוך מדיום התרבות כולה. בדוח זה, אנו מציגים שיטה המשתמשת בשיטת ultracentto (UC) וגודל כרומטוגרפיה להדרה (SEC) אשר מצמידים לניתוח בקנה מידה גדול של חתימות חלבונים כדי לאמת סמנים EV ולזהות תרכובות אקטיביים. מקרופאג-?...

Discussion

מערכת העצבים המרכזית (CN) היא רקמה מורכבת שבה תקשורת תא לתא מסדיר פונקציות נוירואליות נורמליות הדרושות לומאוסטזיס30. EVs הם כיום נחקרו נרחב ותיאר מטענים מולקולרי חשוב עבור תקשורת תא אל התא31. הם מעבירים במפורש קוקטייל של מגשרים לתאי המקבל ומשפיעים על התפקודים שלהם בת...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

העבודה המוצגת הייתה נתמכת על ידי המיניסטייר דה ל'חינוך הלאלה, דה L'Enseignement, et la Recherche ו-INSERM. אנו מכירים בהכרת העיר במרכז המדעי בקמפוס לגישה למכשירים ועצות טכניות. אנו מכירים בהכרת ז'אן-פסקל גיסימנו, Soulaimane Aboulouard ואיזבל פורנייר לסיוע בספקטרומטר המסה. אנו מכירים בהכרת הערב את טאננה הערבי, כריסטול ואן קאמפ, פרנסואז le Marrec-Croq, יאקופו ויזייולי ופייר-אריק סוטיץ ' על תרומתו החזקה להתפתחויות המדעיות והטכניות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-rad4561045EDU 
AcetonitrileFisher ChemicalsA955-1 
Amicon 50 kDa centrifugal filterMerckUFC505024 
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich9830 
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659)Santa-cruzsc-13119 
B27 Plus supplementGibcoA3582801 
BenchMixer V2 Vortex MixerBenchmark ScientificBV1003 
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)Bio-Rad5000006 
C18 ZipTipsMerck MilliporeZTC18S096 
C6 rat glioma cellATCCATCC CCL-107 
Canonical tubesSarstedt62.554.002 
CentrifugeEppendorf5804000010 
CO2 IncubatorThermoFisher  
Confocal microscope LSM880Carl ZeissLSM880 
Cover glassMarienfeld111580 
Culture Dish (60 mm)Sarstedt82.1473 
DithiothreitolSigma-Aldrich43819 
DMEMGibco41966029 
EASY-nLC 1000 Liquid ChromatographThermoFisher  
Electron microscope JEM-2100JEOL  
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acidSigma-Aldrich03777-10G 
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)  http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine SerumGibco16140071 
Fetal Horse SerumBiowestS0960-500 
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001 
Fisherbrand Q500 Sonicator with ProbeFisherbrand12893543 
FlexAnalysisBrucker  
Fluorescence mounting mediumAgilentS3023 
Formic AcidSigma-Aldrich695076 
Formvar-carbon coated copper gridsAgar scientific LtdAGS162-3 
GlucoseSigma-AldrichG8769 
GlutaraldehydeSigma-Aldrich340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
IdoacetamideSigma-AldrichI1149 
InstantBlue Coomassie Protein StainExpedeonISB1L 
Invert light microscope CKX53Olympus  
L-glutamineGibco25030-024 
LabTek II 8 wells Nunc154534 
Laemmli 2XBio-Rad1610737 
LamininCorning354232 
MaxQuant software (proteins identification software)  https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stellBrucker8268711 
MEM 10XGibco21090-022 
MethylcelluloseSigma-AldrichM6385-100G 
MiliQ waterMerck Millipore  
MilkRegilaitREGILAIT300 
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis CellBio-Rad1658000FC 
MonoP FPLC columnGE Healthcare no longer available
Nanosight NS300Malvern PanalyticalNS300 
NanoSight NTA software v3.2Malvern Panalytical  
NanoSight syringe pumpMalvern Panalytical  
NeurobasalGibco21103-049 
Nitrocellulose membraneGE Healthcare10600007 
Nonidet P-40Fluka56741 
Nunc multidish 24 wellsThermoFisher82.1473 
ParaformaldehydeElectro microscopy Science15713 
PC-12 cell lineATCCATCC CRL-1721 
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122 
Peptide calibration mixLaserBio LabsC101 
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-035-003 
Perseus software (Processing of identified proteins)  https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugateSanta-cruzsc-362065 
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma-Aldrich78830 
Phosphate Buffer SalineInvitrogen14190094no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µmpluriSelect43-50060 
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407 
Polycarbonate centrifuge tubesBeckman Coulter355651 
Protease InhibitorSigma-AldrichS8830-20TAB 
PureColCell Systems5005 
Q-Exactive mass spectrometerThermoFisher  
rapifleX mass spectrometerBrucker  
Rat cortical neuronsCell ApplicationsR882N-20Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture MediumCell ApplicationsR620K-100Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophagesCell ApplicationsR8818-10a 
Rat primary microgliaLonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE Healthcare17014001 
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111 
SlideDustsher100204 
Sodium ChlorideScharlauSO0227 
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL3771 
Sodium FluorideSigma-AldrichS7920-100G 
Sodium hydroxideScharlabSO0420005P 
Sodium pyrophosphateSigma-AldrichS6422-100G 
SpeedVac Vacuum ConcentratorThermoFisher  
String software (functional protein association networks)  https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration SubstrateThermoFisher34075 
Syringe 1.0 mLTerumo8SS01H1 
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cellBio-Rad1703940 
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508 
TrisInterchimUP031657 
Tris-GlycineEuromedexEU0550 
Tween 20Sigma-AldrichP2287 
UltracentrifugeBeckman CoulterA95765 
Ultracentrifuge Rotor 70.1 TiBeckman Coulter342184 
Uranyl acetateAgar Scientific LtdAGR1260A 
Whatman filter paperSigma-AldrichWHA10347510 
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acidSigma-AldrichC2020-25G 

References

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
  19. Murgoci, A. -. N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -. M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -. M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160microgliaglioma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved