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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La presente relazione evidenzia i requisiti cronologici per l'isolamento delle vesciche extracellulari (EV) da microglia o macrofagi di sangue. Gli EV derivati dalla microglia sono stati valutati come regolatori dell'escrescenza di neurite, mentre gli EV derivati dai macrofaci di sangue sono stati studiati nel controllo dell'invasione delle cellule glioma C6 nei saggi in vitro. L'obiettivo è comprendere meglio queste funzioni EV come mediatori immunitari in microambienti specifici.

Abstract

Lo stato neuroinfiammatorio del sistema nervoso centrale (SNC) svolge un ruolo chiave nelle condizioni fisiologiche e patologiche. La microglia, le cellule immunitarie residenti nel cervello, e talvolta i macrofagi derivati dal midollo osseo (BMSDM), regolano il profilo infiammatorio del loro microambiente nel SNC. Ora è accettato che le popolazioni di vescicoli extracellulari (EV) provenienti da cellule immunitarie agiscano come mediatori immunitari. Pertanto, la loro raccolta e isolamento sono importanti per identificare il loro contenuto, ma anche valutare i loro effetti biologici sulle cellule riceventi. I dati attuali evidenziano i requisiti cronologici per l'isolamento degli EV dalle cellule della microglia o dai macrofagi del sangue, compresi i passi di ultracentrifugazione e cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC). Un'analisi proteomica non mirata ha permesso la convalida delle firme delle proteine come marcatori EV e ha caratterizzato il contenuto di EV biologicamente attivo. Gli EV derivati dalla microglia sono stati utilizzati anche funzionalmente sulla coltura primaria dei neuroni per valutarne l'importanza come mediatori immunitari nella escrescenza di neurite. I risultati hanno mostrato che i veicoli elettrici derivati dalla microglia contribuiscono a facilitare la escrescenza di neurite in vitro. Parallelamente, gli EV derivati dai macrofaci del sangue sono stati usati funzionalmente come mediatori immunitari nelle colture sferoidi delle cellule glioma C6, i risultati mostrano che questi EV controllano l'invasione delle cellule glioma in vitro. La presente relazione evidenzia la possibilità di valutare le funzioni delle cellule immunitarie mediate da EV, ma anche di comprendere le basi molecolari di tale comunicazione. Questa decifrazione potrebbe promuovere l'uso di vesciche naturali e/o la preparazione in vitro di vescicoli terapeutici al fine di imitare le proprietà immunitarie nel microambiente delle patologie del SNC.

Introduzione

Molte neuropatologie sono legate allo stato neuroinfiammatorio che è un meccanismo complesso che è sempre più considerato, ma ancora poco compreso perché i processi immunitari sono diversi e dipendono dall'ambiente cellulare. Infatti, i disturbi del SNC non comportano sistematicamente gli stessi segnali di attivazione e le stesse popolazioni di cellule immunitarie e quindi le risposte pro o antinfiammatorie sono difficili da valutare come cause o conseguenze delle patologie. I macrofagi residenti nel cervello chiamati "microglia" sembrano essere all'interfaccia tra il sistema nervoso e il sistema immunitario1. La microglia ha un'origine mieloide e deriva dal sacco di tuorlo durante l'ematopoiesi primitiva per colonizzare il cervello, mentre i macrofagi periferici sono derivati dal fegato fetale durante l'ematopoiesi definitiva per diventare macrofagi periferici2. Le cellule di microglia comunicano con neuroni e cellule gliali derivate da neuroni come astrociti e oligodendrociti3. Diversi studi recenti hanno dimostrato che le microglia sono coinvolte nella plasticità neuronale durante lo sviluppo del SNC e l'omeostasi del tessuto adulto, e anche nello stato infiammatorio associato alle malattie neurodegenerative4,5. In caso contrario, l'integrità della barriera ematoence-encefalica può essere compromessa in altre patologie CNS. Le risposte immunitarie, soprattutto nel cancro del glioblastoma multiforme, non sono supportate solo dalle microglia come la barriera elica viene riorganizzata attraverso processi angiogenici e la presenza di vasi linfatici6,7. Pertanto, un'infiltrazione di macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) si verifica nel tumore cerebrale durante i meccanismi di angiogenesi dipendenti dal tumore8. Le cellule tumorali esercitano un'influenza significativa sui BMM infiltrati che portano alle proprietà immunosoppressive e alla crescita del tumore9. Così la comunicazione tra le cellule immunitarie e il loro microambiente cerebrale è difficile da capire in quanto l'origine cellulare e i segnali di attivazione sono diversi10,11. È quindi interessante comprendere le funzioni delle firme molecolari associate alle cellule immunitarie in condizioni fisiologiche. A questo proposito, la comunicazione cellule-cellule tra cellule immunitarie e microambiente cellulare può essere studiata attraverso il rilascio di vesciche extracellulari (EV).

I VE sono sempre più studiati nella regolazione delle funzioni immunitarie in condizioni sane e patologiche12,13. Due popolazioni, esosomi e microvescicoli, possono essere prese in considerazione. Presentano diverse biogenesi e gamme di dimensioni. Gli esosomi sono vesciche di diametro compreso tra 30 e 150 nm e sono generati dal sistema endosomico e secreti durante la fusione di corpi multivessicolari (MVB) con la membrana plasmatica. I microvescicoli hanno un diametro di circa 100-1.000 nm e sono generati da un germogliamento esteriore dalla membrana plasmatica cellulare14. Poiché la discriminazione esosoma contro microvescicolo è ancora difficile da realizzare in base alle dimensioni e ai modelli molecolari, useremo solo il termine EV nella presente relazione. La comunicazione associata a EV nel SNC rappresenta un meccanismo ancestrale poiché gli studi hanno mostrato il loro coinvolgimento nelle specie invertebrate tra cui nematodi, insetti o annelidi15,16. Inoltre, i risultati che mostrano che i veicoli elettrici possono comunicare con cellule di diverse specie dimostrano che questo meccanismo è un sistema di blocco a chiave, basato prima sul riconoscimento superficie-molecola tra vescicoli e cellule riceventi e quindi consentendo l'assorbimento di mediatori16,17. Infatti, gli EVi contengono molte molecole come proteine (ad esempio, enzimi, trasduzione del segnale, fattore biogenesi), lipidi (ad esempio, ceramide, colesterolo) o acidi nucleici (ad esempio DNA, mRNA o miRNA) che agiscono come regolatori diretti o indiretti delle attività delle cellule riceventi14. Ecco perché sono stati effettuati studi metodologici anche sulle cellule immunitarie per isolare i veicoli elettrici e caratterizzare completamente le loro firme proteiche18,19.

I primi studi hanno dimostrato il rilascio di esosomi dalla microglia primaria di ratti coltivati come meccanismo inducibile dopo un'attivazione Wnt3a- o serotonina-dipendente20,21. Funzionalmente nel SNC, gli EV derivati dalla microglia regolano il rilascio di vesciboli era sinaptiche da terminali pressinaptici nei neuroni che contribuiscono al controllo dell'eccitabilità neuronale22,23. Gli EV derivati dalla microglia potrebbero anche propagare la risposta infiammatoria mediata da citochine nelle grandi regioni cerebrali24,25. È importante sottolineare che i diversi ligandi per la famiglia di recettori a pedaggio potrebbero attivare produzioni specifiche di veicoli elettrici nella microglia26. Ad esempio, studi in vitro mostrano che le linee cellulari microglia BV2 attivate da LPS producono contenuti EV differenziali, tra cui citochine pro-infiammatorie27. Pertanto, la diversità funzionale delle sottopopolazioni di cellule immunitarie nel SNC, nella microglia e nell'infiltrazione di BMM, potrebbe essere valutata attraverso le proprie popolazioni di EV, tra cui l'impatto EV sulle cellule riceventi e l'identificazione del contenuto di EV.

In precedenza abbiamo descritto metodi per valutare le proprietà funzionali degli EV derivati da microglia e BMDM dopo il loro isolamento16,19. Nella presente relazione, proponiamo di valutare in modo indipendente l'effetto dei veicoli elettrici derivati dalla microglia sull'escrescenza dei neuriti e l'effetto dei VE derivati dai macrofaci sul controllo degli aggregati cellulari del glioma. Questo studio propone anche un'ampia analisi proteomica delle frazioni EV al fine di convalidare la procedura di isolamento EV e identificare le firme proteiche biologicamente attive. Gli effetti benefici e la decifrazione molecolare del contenuto di EV potrebbero aiutare la loro possibile manipolazione e uso come agenti terapeutici nei disturbi cerebrali.

Protocollo

1. Cultura primaria di microglia/macrofagi

  1. Cultura primaria della microglia
    1. Microglia primaria di ratto commerciale di coltura (2 x 106 cellule) (vedi la Tabella dei Materiali)nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con 10% di siero senza esosoma, 100 U/mL di penicillina, 100 g/mL streptomicina e 9,0 g/glucosio a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.
    2. Raccogliere il mezzo condizionato dopo una coltura di 48 h e procedere all'isolamento dei veicoli elettrici.
  2. Cultura primaria dei macrofagi
    1. Coltura ratto commerciale macrofaages primario (1 x 106 cellule) nel mezzo fornito dal produttore (vedi la tabella dei materiali) a 37 e 5% CO2, con siero privo di esosomi.
    2. Raccogliere il mezzo condizionato dopo una coltura di 24 h e procedere all'isolamento dei veicoli elettrici.

2. Isolamento dei veicoli elettrici

  1. Pre-isolamento dei veicoli elettrici dal mezzo condizionato
    1. Trasferire il mezzo di coltura condizionato dalle colture microglia o macrofagi (passaggi 1.1.2 o 1.2.2) in un tubo conico.
    2. Centrifuga a 1.200 x g per 10 min a temperatura ambiente (RT) per pellet le cellule.
    3. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo conico. Centrifuga a 1.200 x g per 20 min a RT per eliminare i corpi apoptotici.
    4. Trasferire il supernatante in un tubo in policarbonato da 10,4 mL e trasferire il tubo in un rotore Ti 70.1. Ultracentrifuga a 100.000 x g per 90 min a 4 gradi centigradi per pelletare gli EV.
    5. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente il pellet contenente eV in 200 .ll di 0,20 m filtrato fosfato buffer salina (PBS).
  2. Isolamento dei veicoli elettrici
    1. Preparazione della colonna cromatografia di esclusione delle dimensioni fatta in casa (SEC)
      1. Svuotare una colonna di cromatografia di vetro (lunghezza: 26 cm; diametro: 0,6 cm) (vedere la tabella dei materiali), lavarla e sterilizzarla.
      2. Posizionare un filtro di 60 m nella parte inferiore della colonna.
      3. Impilare la colonna con la matrice di filtrazione gel di agarose cross-linked per creare una fase stazionaria di un diametro di 0,6 cm e un'altezza di 20 cm.
      4. Risciacquare la fase con 50 mL di 0,20 m di PBS filtrato. Conservare a 4 gradi centigradi per essere utilizzati in un secondo momento, se necessario.
    2. Posizionare il pellet EV risospeso sopra la fase stazionaria della colonna SEC.
    3. Raccogliere 20 frazioni sequenziali di 250 gradi l pur continuando ad aggiungere PBS filtrato di 0,20 m sulla parte superiore della fase stazionaria per evitare l'essiccazione della colonna. Se necessario, conservare le frazioni a -20 gradi centigradi.
      NOT: Un'immagazzinamento più lungo di una settimana può essere eseguito a -80 gradi centigradi per mantenere l'integrità di EV per l'analisi molecolare.
  3. Analisi della spettrometria di massa della desorptiazione laser assistita a matrice delle frazioni SEC
    1. Procedere all'isolamento EV come descritto nella sezione 2.2.
    2. Risospendere il pellet EV con 200 l di soluzione di miscela di calibrazione peptide (vedere la Tabella dei Materiali).
    3. Procedere alla raccolta EV come descritto nelle sezioni da 2.2.1 a 2.2.3.
    4. Asciugare completamente la frazione con un concentratore a vuoto.
    5. Ricostituire le frazioni con 10 o L di 0,1% di acido trifluoroacetico (TFA).
    6. Mescolare 1 -L di frazione ricostituita con 1 -L di matrice di acido idrinamomico (HCCA) su una piastra bersaglio in acciaio lucido MALDI.
    7. Analizza tutte le frazioni con uno spettrometro di massa MALDI.
    8. Analizzare gli spettri generati con un software dedicato (vedere Tabella dei materiali).

3. Caratterizzazione dei veicoli elettrici

  1. Analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
    NOTA:     L'analisi NTA viene eseguita con uno strumento di analisi del monitoraggio delle nanoparticelle (vedere la tabella dei materiali) e una pompa di siringa automatizzata.
    1. Effettuare una diluizione (intervallo da 1:50 a 1:500) di ogni frazione SEC dal punto 2.2.3 con PBS filtrato da 0,20 m.
    2. Vorticare la soluzione per eliminare gli aggregati EV.
    3. Mettere la soluzione diluita in una siringa da 1 mL e metterla nella pompa di siringa automatica.
    4. Regolare l'impostazione Fotocamera sul livello di guadagno dello schermo (3) e sul livello della fotocamera (13).
    5. Fare clic su Esegui e avviare lo script seguente.
      1. Caricare il campione nella camera di analisi (tasso di infusione: 1.000 per 15 s).
      2. Diminuire e stabilizzare il flusso di velocità per la registrazione video (velocità di infusione: 25 per 15 s). Cattura tre video da 60 s consecutivi del flusso di particelle.
      3. Regolare il livello della telecamera (13) e la soglia di rilevamento (3) prima dell'analisi dei video. Fare clic su Impostazioni. Ok per avviare l'analisi e fare clic su Esporta quando l'analisi è fatta.
    6. Tra ogni analisi frazionaria, lavare con 1 mL di 0,20 m di PBS filtrato.
  2. Analisi della microscopia elettronica (EM)
    1. Isolare i veicoli elettrici come descritto nella sezione 2.
      NOT: Non sono richieste condizioni sterili.
    2. Ripetere la sezione 3.1 per quantificare i veicoli elettrici.
      NOT: Solo le frazioni positive saranno utilizzate per l'analisi dei risultati.
    3. Utilizzare un filtro centrifugo da 50 kDa (vedere Tabella dei materiali)per concentrare le frazioni SEC contenenti EV.
    4. Risospendere gli EV concentrati in 30 -L del 2% di paraformaldeide (PFA).
    5. Caricare 10 l del campione su una griglia di rame rivestita in carbonio.
    6. Incubare per 20 min in un ambiente umido.
    7. Ripetere i passaggi 3.2.5 e 3.2.6 per un buon assorbimento del campione sulla griglia.
    8. Trasferire la griglia in una goccia di 1% glutaraldeide in PBS per 5 min a RT.
    9. Lavare il campione con acqua ultrapura più volte.
    10. Contrapporre il campione per 10 min sul ghiaccio con una miscela del 4% di acetato uranilo e 2% di metilcellulosa (1:9, v/v). Rimuovere l'eccesso di miscela utilizzando una carta da filtro.
    11. Asciugare il campione e osservarlo al microscopio elettronico a 200 kV (vedere la Tabella dei Materiali).
  3. Analisi delle macchie occidentali
    1. Estrazione di proteine
      1. Ripetere i passaggi da 3.2.1 a 3.2.3 per isolare e concentrare i veicoli elettrici.
      2. Miscelare 50 -L di buffer DI RIPA (150 mM di cloruro di sodio [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N'-tetraacetic acido [EGTA], 2 mM acido etilenedia-tetractica [EDTA], 100 mM di fluoruro di sodio [NaF], 10 mM di pirofafosfato di sodio, 1% Nonidet P-40, 1 mM Phenylmetathanesulfonyl fluoruro [PMSF], 1x inibitore di proteasi) con il campione di EV (25 anni L risultante dalla concentrazione EV sul filtro) per 5 min ghiaccio su proteine.
      3. Sonicare per 5 s (ampiezza: 500 W; frequenza: 20 kHz), 3 volte sul ghiaccio.
      4. Rimuovere i detriti vescicolari con centrifugazione a 20.000 x g per 10 min, a 4 gradi centigradi.
      5. Raccogliere il supernatante e misurare la concentrazione proteica con il metodo di saggio della proteina Bradford.
    2. Sodio dodecyl solfato poliacrilamina gel elettroforesi (SDS-PAGE) e gonfiaggio occidentale
      1. Estraenti proteici mix (30 g) con buffer di campione 5c Laemmli (v/v).
      2. Caricare la miscela proteica su un gel poliacrilammide del 12%.
      3. Migrare le proteine nel gel con tampone TGS (25 mM Tris pH 8.5, 192 mM Glycine, e 0.1% SDS), a 70 V per 15 min e 120 V per 45 min.
      4. Trasferire le proteine sulla membrana della nitrocellulosa con sistema semi-asciutto a 230 V per 30 min.
      5. Saturare la membrana per 1 h a RT con buffer di blocco (0,05% Tween 20 w/v, 5% latte in polvere w/v in PBS 0,1 M, pH 7,4).
      6. Incubare la membrana durante la notte a 4 gradi centigradi con l'anticorpo anti-umano di shock termico monoclonale del topo 90 (HSP90) diluito nel buffer di blocco (1:100).
      7. Lavare la membrana tre volte con PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) per 15 min.
      8. Incubare la membrana per 1 h a RT con anticorpo secondario IgG con coniugato di rafano di capra conossidasi anti-topo diluito diluito nel buffer di blocco (1:10,000).
        NOT: Un controllo negativo viene eseguito utilizzando solo anticorpi secondari.
      9. Ripetere il passaggio di lavaggio (passaggio 3.3.2.7).
      10. Rivelare la membrana con una maggiore chemiluminescenza (ECL) kit di substrato di gonfiazione occidentale (vedere Tabella dei materiali).
  4. Analisi proteomica
    1. Estrazione di proteine e digestione in gel
      1. Ripetere i passaggi da 3.2.1 a 3.2.3 per isolare e concentrare i veicoli elettrici. Ripetere il passaggio 3.3.1 per l'estrazione di proteine EV.
      2. Eseguire la migrazione delle proteine nel gel di impilamento di un gel poliacrilammide 12%.
      3. Fissare le proteine nel gel con coomassie blu per 20 min a RT.
      4. Accisa ogni pezzo di gel colorato e tagliarlo in piccoli pezzi di 1 mm3.
      5. Lavare i pezzi di gel in successione con 300 gradi di ciascuna soluzione: acqua ultrapura per 15 min, 100% acetonitrile (ACN) per 15 min, 100 mm di bicarbonato di ammonio (NH4HCO3) per 15 min, ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) per 15 min e 100% ACN per 5 min con agitazione continua.
      6. Asciugare completamente i pezzi di gel con concentratore a vuoto.
      7. Eseguire la riduzione delle proteine con 100 mL di 100 mM NH4HCO3 contenenti 10 mM dithiothreitol per 1 h a 56oC.
      8. Eseguire l'alchilazione proteica con 100 mL di 100 mM NH4HCO3 contenenti 50 mM iodoacetamide per 45 min al buio a RT.
      9. Lavare i pezzi di gel in successione con 300 l di ogni soluzione: 100 mM di NH4HCO3 per 15 min, ACN:20 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) per 15 min e 100% ACN per 5 min con un agitazione continua.
      10. Asciugare completamente i pezzi di gel con un concentratore a vuoto.
      11. Eseguire la digestione delle proteine con 50 gradi l di trypsin (12,5 g/mL) in 20 mM NH4HCO3 durante la notte a 37 .
      12. Estrarre le proteine digerite dal gel con 50 - L di 100% ACN per 30 min a 37 gradi centigradi e poi 15 min a RT con agitazione continua.
      13. Ripetere due volte le seguenti procedure di estrazione: 50 : L del 5% TFA in 20 mM NH4HCO3 soluzione per 20 min con agitazione continua.
      14. Aggiungere 100 L di 100% ACN per 10 min con agitazione continua.
      15. Proteine digerite a secco con concentratore di vuoto e risospendono in 20 gradi l uno dello 0,1% di TFA.
      16. Desala il campione utilizzando una punta di pipetta da 10 luna con mezzi di deformazione inversa C18 per il desalamento e la concentrazione di peptidi (vedi tabella dei materiali) e peptidi elusi con acido formico ACN:0.1% (FA) (80:20, v/v).
      17. Asciugare completamente il campione con un concentratore di vuoto e risospendere in 20 gradi L di ACN:0.1% FA (2:98, v/v) per la spettrometria di massa tandem di cromato liquida (LC-MS/MS).
    2. LC-MS/MS Analisi
      1. Caricare il peptide digerito nello strumento LC-MS/MS ed eseguire l'analisi dei campioni e dei dati in base ai parametri descritti in dettaglio altrove42.
    3. Analisi dei dati grezzi
      1. Elaborare i dati di spettrometria di massa per identificare le proteine e confrontare le proteine identificate di ogni campione con un pacchetto software proteomico quantitativo utilizzando parametri standard.
      2. Esportare, utilizzando parametri standard, l'elenco delle proteine esclusive e sovrarappresentate da campioni positivi EV in un software che prevede reti proteiche e processi biologici.
      3. Confrontare l'elenco delle proteine identificate nelle frazioni con i primi 100 marcatori EV del database Open Access di Exocarta (vedere la Tabella dei materiali).

4. Analisi degli effetti EV funzionali

  1. Ansaggio delle esocre Neurite sulla linea cellulare PC-12
    1. Coltura PC12 linea cellulare in media DMEM completa (2 mM L-glutamine, 10% siero di cavallo fetale (FHS), 5% siero bovino fetale (FBS), 100 UI / mL penicillina, 100 g / mL streptomycin).
      NOT: I sera sono esosomiliberi in tutta la procedura.
    2. Aggiungere un vetro di copertura (tutti i pozzetti) a una piastra di 24 pozzetti; rivestire la piastra con poli-D-lysina (0,1 mg/mL) e seme 260.000 cellule/bene.
    3. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.
    4. Dopo 24 h di incubazione, cambiare il mezzo in dMEM medio (DMEM con 2 mM L-glutamina, 0.1% FHS, 100 UI/mL penicillina, 100g/mL streptomicina) con 1 x 106 microglia EV (dal punto 1.1.2).
      NOT: La condizione di controllo viene eseguita senza microglia EV nel mezzo di differenziazione.
    5. Al giorno 4 dopo la seeding, caricare tutti i pozze con 100 l di mezzo DMEM completo.
    6. Al giorno 7 dopo la semina, fissare le cellule con 4% PFA per 20 min a RT e risciacquare tre volte (10 min ciascuno) con PBS.
    7. Macchiare le cellule con phalloidinr rhodamina coniugata per 30 min a 4 gradi centigradi e risciacquare 3 volte (10 min ciascuno) con PBS.
    8. Macchiare le cellule con Hoechst 33342 diluito (1:10,000) per 30 min a RT e risciacquare 3 volte (10 min ciascuno) con PBS.
    9. Montare il vetro di copertura su uno scivolo con supporto di montaggio fluorescente (vedere Tabella dei materiali).
    10. Analizzare la diapositiva con un microscopio confocale, prendere 5 immagini casuali di ogni diapositiva.
    11. Misurare la crescita neurite utilizzando un software di quantificazione automatica (lunghezza totale neurite) come descritto in dettaglio altrove43.
  2. Escrescenza di Neurite sui neuroni primari del ratto
    1. Ricoprire un vetrino a 8 pozzetti con poli-D-lysina (0,1 mg/mL) e laminina (20 g/mL).
    2. Coltura ratto neuroni primari commerciali in un mezzo di coltura appropriato (vedi Tabella dei materiali) placcando 50.000 cellule per pozzo e incubando le cellule a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 per 48 h.
      NOT: I sera sono esosomiti nell'intera procedura.
    3. Aggiungere 1 x 106 microglia EV al mezzo di coltura neuronale e incubare a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 per 48 h in più.
      NOT: La condizione di controllo viene eseguita senza microglia EV nel mezzo di coltura del neurone.
    4. Seguire i passaggi da 4.1.6 a 4.1.9 per correggere e macchiare le celle.
    5. Seguire i passaggi 4.1.10 e 4.1.11 per analizzare la diapositiva.
  3. Invasione della cellula Glioma
    1. Risospendere le cellule del glioma del ratto C6 nel mezzo DMEM completo (DMEM con 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1x antibiotici) contenenti il 5% di collagene ad una concentrazione finale di 8.000 cellule in 20.
      NOT: I sera sono esosomiti nell'intera procedura.
    2. Posizionare 5 mL di PBS sul fondo di un piatto di coltura tissutale di 60 mm. Invertire il coperchio e le gocce di deposito di 20 l (8.000 celle) di sospensione cellulare sul fondo del coperchio.
    3. Invertire il coperchio sulla camera inferiore riempita da PBS e incubare la piastra a 37 e 5% DI CO2 per 72 h fino a formare sferoidi cellulari.
    4. Aggiungere 1 x 108 EV macrofalo (dal punto 1.2.2) a una miscela di collagene da 2,2 mg/mL (2 mL di soluzione di collagene bovino I [3 mg/mL] con 250 x 10x minimo mezzo essenziale (MEM) e 500 - L di 0,1 M di idrossido di sodio).
      NOT: La condizione di controllo viene eseguita senza eV macrofaci nella miscela di collagene.
    5. Distribuire la miscela di collagene contenente eV in una piastra di 24 pozze per incorporare sferoidi cellulari.
    6. Impiantare gli sferoidi cellulari appena formati al centro di ogni pozzo.
    7. Incubare la piastra per 30 min a 37oC e 5% CO2 per solidificare il gel.
    8. Successivamente, sovrapporre 400 l di mezzo DMEM completo sulla matrice di collagene in ogni pozzo.
    9. Incubare il sistema completo per un totale di 6 giorni a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2.
      NOT: L'invasione cellulare fuori dallo sferoide è monitorata dalla fotografia digitale utilizzando un microscopio luminoso invertito utilizzando un obiettivo 4x/0.10 N.A.
    10. Acquisire immagini di ogni pozzo ogni giorno.
    11. Elaborare le immagini e quantificare l'invasione delle aree di sferoidi cellulari utilizzando il software come descritto in precedenza nel dettaglio42.
      NOT: Le aree di invasione e sferoide sono state normalizzate per ogni giorno alle aree di invasione e sferoidi misurate il giorno 0.

Risultati

Una delle principali sfide per attribuire gli effetti biologici alle vescicle extracellulari (EV) è la capacità di isolare i veicoli elettrici dall'intero mezzo di coltura. In questo rapporto, presentiamo un metodo che utilizza l'ultracentrifugation (UC) e la cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC) che è accoppiato all'analisi su larga scala delle firme proteiche per convalidare i marcatori EV e identificare i composti bioattivi. I vela di macrofago o microglia sono stati isolati dal mezzo condizionato risp...

Discussione

Il sistema nervoso centrale (CNS) è un tessuto complesso in cui la comunicazione da cellula a cellula regola le normali funzioni neuronali necessarie per l'omeostasi30. I veicoli elettrici sono ora ampiamente studiati e descritti come importanti carichi molecolari per la comunicazione da cellula a cellula31. Essi forniscono specificamente un cocktail di mediatori alle cellule dei destinatari influenzando così le loro funzioni in condizioni sane e patologiche

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Il lavoro presentato è stato sostenuto dalla Ministère de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche e INSERM. Ringraziamo con gratitudine lo strumento BICeL- Campus Scientific City per l'accesso a strumenti e consigli tecnici. Ringraziamo jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard e Isabelle Fournier per l'assistenza alla spettrometria di massa. Ringraziamo con gratitudine Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli e Pierre-Eric Sautière per il loro forte contributo agli sviluppi scientifici e tecnici.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-rad4561045EDU 
AcetonitrileFisher ChemicalsA955-1 
Amicon 50 kDa centrifugal filterMerckUFC505024 
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich9830 
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659)Santa-cruzsc-13119 
B27 Plus supplementGibcoA3582801 
BenchMixer V2 Vortex MixerBenchmark ScientificBV1003 
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)Bio-Rad5000006 
C18 ZipTipsMerck MilliporeZTC18S096 
C6 rat glioma cellATCCATCC CCL-107 
Canonical tubesSarstedt62.554.002 
CentrifugeEppendorf5804000010 
CO2 IncubatorThermoFisher  
Confocal microscope LSM880Carl ZeissLSM880 
Cover glassMarienfeld111580 
Culture Dish (60 mm)Sarstedt82.1473 
DithiothreitolSigma-Aldrich43819 
DMEMGibco41966029 
EASY-nLC 1000 Liquid ChromatographThermoFisher  
Electron microscope JEM-2100JEOL  
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acidSigma-Aldrich03777-10G 
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)  http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine SerumGibco16140071 
Fetal Horse SerumBiowestS0960-500 
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001 
Fisherbrand Q500 Sonicator with ProbeFisherbrand12893543 
FlexAnalysisBrucker  
Fluorescence mounting mediumAgilentS3023 
Formic AcidSigma-Aldrich695076 
Formvar-carbon coated copper gridsAgar scientific LtdAGS162-3 
GlucoseSigma-AldrichG8769 
GlutaraldehydeSigma-Aldrich340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
IdoacetamideSigma-AldrichI1149 
InstantBlue Coomassie Protein StainExpedeonISB1L 
Invert light microscope CKX53Olympus  
L-glutamineGibco25030-024 
LabTek II 8 wells Nunc154534 
Laemmli 2XBio-Rad1610737 
LamininCorning354232 
MaxQuant software (proteins identification software)  https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stellBrucker8268711 
MEM 10XGibco21090-022 
MethylcelluloseSigma-AldrichM6385-100G 
MiliQ waterMerck Millipore  
MilkRegilaitREGILAIT300 
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis CellBio-Rad1658000FC 
MonoP FPLC columnGE Healthcare no longer available
Nanosight NS300Malvern PanalyticalNS300 
NanoSight NTA software v3.2Malvern Panalytical  
NanoSight syringe pumpMalvern Panalytical  
NeurobasalGibco21103-049 
Nitrocellulose membraneGE Healthcare10600007 
Nonidet P-40Fluka56741 
Nunc multidish 24 wellsThermoFisher82.1473 
ParaformaldehydeElectro microscopy Science15713 
PC-12 cell lineATCCATCC CRL-1721 
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122 
Peptide calibration mixLaserBio LabsC101 
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-035-003 
Perseus software (Processing of identified proteins)  https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugateSanta-cruzsc-362065 
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma-Aldrich78830 
Phosphate Buffer SalineInvitrogen14190094no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µmpluriSelect43-50060 
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407 
Polycarbonate centrifuge tubesBeckman Coulter355651 
Protease InhibitorSigma-AldrichS8830-20TAB 
PureColCell Systems5005 
Q-Exactive mass spectrometerThermoFisher  
rapifleX mass spectrometerBrucker  
Rat cortical neuronsCell ApplicationsR882N-20Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture MediumCell ApplicationsR620K-100Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophagesCell ApplicationsR8818-10a 
Rat primary microgliaLonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE Healthcare17014001 
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111 
SlideDustsher100204 
Sodium ChlorideScharlauSO0227 
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL3771 
Sodium FluorideSigma-AldrichS7920-100G 
Sodium hydroxideScharlabSO0420005P 
Sodium pyrophosphateSigma-AldrichS6422-100G 
SpeedVac Vacuum ConcentratorThermoFisher  
String software (functional protein association networks)  https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration SubstrateThermoFisher34075 
Syringe 1.0 mLTerumo8SS01H1 
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cellBio-Rad1703940 
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508 
TrisInterchimUP031657 
Tris-GlycineEuromedexEU0550 
Tween 20Sigma-AldrichP2287 
UltracentrifugeBeckman CoulterA95765 
Ultracentrifuge Rotor 70.1 TiBeckman Coulter342184 
Uranyl acetateAgar Scientific LtdAGR1260A 
Whatman filter paperSigma-AldrichWHA10347510 
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acidSigma-AldrichC2020-25G 

Riferimenti

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
  19. Murgoci, A. -. N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -. M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -. M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

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