قياس الإيقاعات اليومية في التدفق التلقائي والبروتياسومال

Summary

نحن نصف بروتوكولنا لقياس الإيقاعات البيولوجية في تقويض البروتين عن طريق autophagy وبروتياسوم في كبد الماوس.

Abstract

تستخدم الخلايا عدة طرق لإعادة تدوير البروتينات غير المرغوب فيها وغيرها من المواد، بما في ذلك مسارات الليسوسومال وغير الليسوسومال. ويسمى المسار الرئيسي تعتمد على الليسوسوم autophagy، في حين أن الطريقة الأولية غير الليسوسومل لتقويض البروتين هو نظام فيوكويتين بروتياسوم. وتشير الدراسات الحديثة في الكائنات الحية النموذجية إلى أن نشاط كل من الأوتوفاجي ونظام يوبيكويتين بروتياسوم ليس ثابتاً طوال اليوم ولكنه يختلف بدلاً من ذلك وفقاً لإيقاع يومي (سيركاديان). القدرة على قياس الإيقاعات البيولوجية في دوران البروتين مهم لفهم كيفية تحقيق مراقبة الجودة الخلوية ولفهم ديناميات بروتينات محددة ذات أهمية. هنا نقدم بروتوكول موحد لتحديد كمية التدفق الذاتي والبروتياسومال في الجسم الحي الذي يلتقط المكون circadian من دوران البروتين. يتضمن بروتوكولنا تفاصيل لمناولة الماوس، ومعالجة الأنسجة، والكسر، والقياس الكمي للتدفق التلقائي باستخدام كبد الماوس كمادة البداية.

Introduction

تشير إيقاعات Circadian إلى الاختلافات اليومية التي يمكن التنبؤ بها في الوظيفة البيولوجية التي تظهر في جميع أنحاء الطبيعة. وهي موجودة في كل مقياس بيولوجي، من السلوكيات العيانية مثل دورات النوم والاستيقاظ، إلى الظواهر الجزيئية مثل الوفرة الإيقاعية للجزيئات الحيوية. في السنوات الأخيرة، تم تحويل البحوث في إيقاعات circadian من خلال اكتشاف "الجينات على مدار الساعة" التي هي حاسمة لتوليد إيقاع circadian. وقد كشفت الدراسات في الفئران الجينات على مدار الساعة خروج المغلوب دورا مركزيا لإيقاعات circadian في تنظيم العمليات الخلوية الأساسية زمنيا مثل التمثيل الغذائي¹. من بين الطرق إيقاعات circadian جعل هذا يحدث عن طريق نقل بنية زمنية لتقويض البروتين.

وقد أظهرت عدة مجموعات بما في ذلك بلدنا أن اثنين من السبل الرئيسية لتقويض البروتين الخلوي، autophagy ونظام ubiquitin-بروتياسوم، تخضع لإيقاعات اليومية^2،3،4،5. يمثل Autophagy الذراع تعتمد على اللعيب من تقويض البروتين الذي يتم تسليم البروتينات ذات الأهمية إلى هذا organelle المهينة إما من خلال بناء حويصلة جديدة (macroautophagy) أو من خلال نقل مباشرة على الرغم من قناة (chaperone بوساطة autophagy)⁶. نظام ubiquitin-proteasome هو المسار الرئيسي غير الليسوسوم، حيث البروتينات هي بولي في كل مكان ومن ثم تغذية في بروتياسوم، وهو آلة مهينة الجزيئية الكلية وجدت في جميع أنحاء السيتوبلازم والنواة^7،8. الإيقاعات في النشاط الذاتي وproteasomal مهمة لأنها من المرجح أن تلعب دورا في التدبير المنزلي الخلوية. ونتيجة لذلك، فمن المفيد أن يكون لديك إجراء موحد يمكن الكشف عن التذبذبات اليومية في تقويض البروتين الذي يتوافق مع نماذج الأمراض ما قبل السريرية.

هنا، ونحن نقدم بروتوكولنا لتحديد كمية الاختلافات اليومية في تدفق autophagic في كبد الماوس، والتي كانت بمثابة أساس للعمل في مختبرنا^3،9. وتصنف طريقتنا على أنها "قياس دوران"¹⁰، وهو نهج تستخدمه العديد من المجموعات لقياس النشاط البروتيوليتيك (أو تدفق). في هذا النهج، يتم إعطاء مثبطات البروتياز الخاصة بالليسوسوم أو بروتياسومس للفئران ومن ثم يتم الحصول على عينات الأنسجة بعد فترة زمنية محددة. وفي موازاة ذلك، يتم الحصول على عينات من الأنسجة من الفئران التي تتعرض لحقن الشام. عينات الأنسجة متجانسة ومن ثم فصل كيميائيا بيولوجيا للحصول على الكسور الليسوم المخصب والسيتوبلازمية. ثم يتم تحليل هذه الكسور بالتوازي عبر النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بعلامات الماكرووتفاجي (LC3b و p62) أو ركائز بروتياسومال (بروتين متعدد الكل شيء). مع مرور الوقت، الحيوانات التي يتم حقنها بمثبطات البروتياز تتراكم البروتينات التي عادة ما يتم إعادة تدويرها. ونتيجة لذلك، يتم الاستدلال على معدل دوران عن طريق مقارنة وفرة البروتينات علامة في العينات المعالجة مثبطات البروتياز إلى العينات المعالجة بالشام. من خلال تكرار هذه الطريقة في فترات زمنية محددة عبر اليوم فمن الممكن لإعادة بناء الاختلافات circadian في proteolysis(الشكل 1A).

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول الموضح هنا من قبل جامعة واشنطن في سانت لويس العناية بالحيوان واستخدامها لجنة (IACUC).

1. الماوس الإسكان والتصميم التجريبي

1. للكشف عن الإيقاعات اليومية في دوران البروتين، الفئران المنزلية (الذكور أو الإناث C57BL/6J، 4−8 الأسبوع من العمر، 20-25 غرام) تحت معيار 12 ساعة دورات الضوء / الظلام مع الغذاء المقدمة ad libitum. لتجنب التشديد على الحيوانات، والحيوانات تكييف لمدة أسبوع واحد على الأقل في المرفق قبل استخدام وتجنب السكن واحد. لإثبات أن الإيقاعات في تقويض البروتين هي circadian حقا (أي، مدفوعا على مدار الساعة البيولوجية الداخلية للحيواني)، والفئران منزل في ظل ظروف مظلمة مستمرة، مع الحرص على تجنب تعريض الفئران للضوء الخارجي.
   ملاحظة: لمزيد من التفاصيل حول السكن الماوس لتجارب إيقاع circadian انظر المرجع التالي¹¹.
2. لكل نقطة زمنية، تخصيص ثلاثة فئران كضوابط الشام وثلاثة فئران على الأقل لكل نوع من مثبطات البروتياز المستخدمة (ليوبيبين للتدفق التلقائي وbortezomib لقياسات التدفق البروتياسومال). خطة لست نقاط زمنية متباعدة بالتساوي على فترات 4 ساعة عبر دورة اليوم / الليل للحصول على عينات الأنسجة.
   ملاحظة: سوف تتطلب تجربة 24 ساعة و6 نقاط زمنية مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وleupeptin وbortezomib ما مجموعه 54 فأراً (3 في العلاج × 3 علاجات × 6 نقاط زمنية).

2. إعداد حل التجانس، وحلول الأسهم المانعة، وقارورة لجمع كبد الماوس

1. إعداد العازلة التجانس الطازجة (HB) والحفاظ على الجليد: 10 M تريس-حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 250 mM السكروز، 5 MM EDTA درجة الحموضة 8.0، و 1 قرص مثبطات البروتياز لكل 100 مل.
   ملاحظة: هناك حاجة إلى حوالي 10 مل من HB لكل ماوس.
2. للمعالجة النهائية للعينات البيولوجية، كل عينة تتطلب أنبوب مخروطي 15 مل لعقد المجانسة الخام، أنبوب 15 مل لعقد supernatant ما بعد النووية، واثنين من أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 مل لعقد 3000 × ز و 20،000 × ز بيليت المواد، على التوالي، وأنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل لعقد كسر السيتوبلازمية. إضافة 7 مل من HB الباردة إلى كل أنبوب مخصص للتجانس الخام والحفاظ على الجليد.
3. إعداد 2 ملغ / مل حل الأسهم من ليوبيبيتين هيمي كبريتات في PBS معقمة. كما قم بإعداد محلول 50 ملغم/مل من البوردزوميفي في كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO). Aliquot وتخزين الحلول في -80 درجة مئوية.

3. إدارة مثبطات البروتياز

1. ذوبان ليوبيبين (2 ملغ / مل) وbortezomib (50 ملغ / مل) حلول الأسهم لدرجة حرارة الغرفة 15 دقيقة قبل كل نقطة زمنية. مخزون ليوبيبين جاهز للحقن. تمييع bortezomib في PBS معقمة لتحقيق حل عمل 50 ميكروغرام /مل.
   ملاحظة: Bortezomib حساسة للضوء، لذلك حماية المخزون العامل من الضوء حتى الاستخدام.
2. وزن الفئران وإجراء الحقن داخل الشبكية من "الشام" PBS (0.5 مل)، ليوبيبين (40 ملغ / كغ)، أو bortezomib (1.6 ميكروغرام / كغ). عودة الفئران إلى أقفاص ملحوظ بشكل مناسب مجمعة حسب نوع الحقن التي تلقتها. تسجيل الوقت الذي يتم فيه التعامل مع الفئران أو معالجتها في جدول موحد (راجع ملف تكميلي "نموذج البيانات").
   ملاحظة: يتم تضمين حاسبة الجرعة كمساعدة في الملف التكميلي "عينة البيانات". من المهم إجراء الحقن على وجه السرعة وبنفس الترتيب من نقطة زمنية إلى نقطة زمنية لتقليل التباين.

4. اقتناء الأنسجة وتخزينها

1. بعد ساعتين من الحقن، قتل الفئران واحدا تلو الآخر وفقا لبروتوكول IACUC المعتمدة مؤسسيا. على سبيل المثال، التخدير الفئران ثم القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم. انتقل إلى خطوة تشريح مباشرة بعد القتل الرحيم.
   ملاحظة: تأكد من التخدير الكامل قبل خلع عنق الرحم عن طريق الضغط على الكفوف الأمامية دون رد فعل ملحوظ.
2. إزالة الفص الأيسر من الكبد عن طريق إجراء شق 1.5 إلى 2.0 سم مع مقص Metzenbaum على البطن البطني للماوس. إضفاء الطابع الخارجي على الفص الأيسر من الكبد ومكوسه بمقص جراحي. غمر عينة الكبد في 7 مل من HB الجليد البارد في أنبوب مخروطي 15 مل المسمى بشكل مناسب. الحفاظ على العينة على الجليد في جميع أنحاء تجهيز.
   ملاحظة: ويمكن الاحتفاظ بالعينات على الجليد أو عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها قبل الشروع. إذا كانت العلامات القياسية للنشاط macroautophagy وproteasomal هي التلاوة المقصودة فقط، يمكن أن تكون عينات الكبد فلاش المجمدة في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية للمعالجة في وقت لاحق. لفحص أهداف أخرى للتحلل (على سبيل المثال، عن طريق البروتيوميات)، معالجة العينات دون تجميد.
3. المضي قدما في القتل الرحيم وتشريح الماوس المقبل حتى يتم الحصول على جميع العينات. معالجة الفئران في نفس ترتيب المجموعة التي تم حقنها وتسجيل مدة هذه الخطوة (راجع الملف التكميلي "نموذج البيانات"). وينبغي معالجة كل فأر في أقل من 5 دقائق للحد من الفرق في أوقات التعرض للمثبطات عن طريق الحقن.

5. الكسر البيوكيميائي لعينات الكبد

ملاحظة: ويبين الشكل 1 باء مخطط الكسر.

1. نقل كل عينة الكبد و 7 مل من HB في سعة 15 مل المجانسة Dounce. تجانس العينة مع 10 السكتات الدماغية من المكبس فضفاضة و 15 السكتات الدماغية من المكبس ضيق. إرجاع التجانس الخام الناتج إلى الأنبوب المخروطي 15 مل التي نشأت منها. كرر حتى يتم تجانس جميع عينات الكبد.
2. تدور عينات التجانس الخام في 700 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية إلى النوى بيليه والحطام. نقل أعلى 4 مل من ما بعد النووية الفائقة(S1)إلى أنبوب مخروطي 15 مل جديدة.
3. تحديد تركيز البروتين من الكسر S1 باستخدام برادفورد أو حمض bicinchoninic (BCA) الاختبارات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك معادلة تركيزات جميع العينات إلى 2.1 ملغ/مل أو إلى التركيز المطلوب عن طريق إضافة HB جديدة إلى S1 عند الحاجة. العينات الطبيعية هي "البروتين الكلي"(توت)جزء. لأغراض تحليلية المصب وتحسين الجودة، aliquot 500 درجة مئوية من كسر توت وتخزينها في -80 درجة مئوية.
4. نقل 1.5 مل من جزء توت المتبقية في أنبوب الطرد المركزي الجزئي وتدور في 3000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. نقل 1 مل من supernatant الناتجة(S2)إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة الطازجة ومجموعة على الجليد.
5. قم بإستقان الـ supernatant المتبقي ة واغسل 3000 × ز بيليه(3KP)مرتين مع 1.5 مل من HB الباردة. ويمكن تخزين بيليه 3KP الجافة في -80 درجة مئوية إذا كان من المتوقع البروتيوميات المصب. إذا كان من المتوقع فقط النشاف الغربية، وإعادة تعليق بيليه 3KP في 200 درجة مئوية من الصوديوم dodecyl كبريتات بولياكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) عينة العازلة(جدول المواد)ويغلي في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
6. تدور الكسر S2 في 20،000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية. نقل supernatant الناتجة(S3)إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة الطازجة. S3 هو السيتوبلازمية(سيتو)كسر. بالنسبة لـ SDS-PAGE، اجمع 150 ميكرو لتر من كسر السيتو مع 50 ميكرو لتر من المخزن المؤقت لعينات SDS-PAGE 4x ويغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
7. قم بإستقان الـ 20,000 × ز بيليه(20KP)واغسل مرتين مع 1.5 مل من HB الباردة. يمكن تخزين بيليه 20KP الجافة في -80 درجة مئوية إذا كان من المتوقع البروتيوميات المصب. إذا كان من المتوقع فقط النشاف الغربية، وإعادة تعليق بيليه 20KP في 100 درجة مئوية من SDS-PAGE عينة العازلة ويغلي في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

6. الغربية النشاف القراءة

1. من أجل قياس تدفق الماكرووتوافوخامال عن طريق النشاف الغربي، يؤلف حل مخزون من تنقية GST-LC3b (2 ميكروغرام /مل)، p62-His₆ (2 ميكروغرام/مل)، وLys⁴⁸ ربط polyubiquitin (K48-Ub، 50 ميكروغرام /مل) في 1X SDS-PAGE عينة العازلة. بعد الغليان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، aliquot وتخزينها في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
2. في وقت SDS-PAGE، قم بإنشاء منحنى قياسي من 6 نقاط لخليط البروتين القياسي عن طريق تخفيف 1:3 بشكل تسلسلي في المخزن المؤقت للعينة SDS-PAGE 1x. قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل عينة منحنى قياسية على 26 بئر 4−12% SDS-PAGE midi-gel، تليها معايير البروتين الملطخة مسبقًا(جدول المواد)،وهو معيار وزن جزيئي تجاري.
3. لقياس تدفق autophagic، تحميل 12 درجة مئوية من عينة 3KP في كل بئر.
   ملاحظة: على افتراض الشام، bortezomib، وعلاجات ليوبيبين تم القيام به وعلى افتراض 3 الفئران لكل علاج، كل نقطة زمنية ينبغي أن تتكون من 9 عينات. ولذلك، كل ميدي هلام يمكن أن تستوعب 2 نقطة زمنية بالإضافة إلى منحنى القياسية وتجربة سلسلة زمنية نموذجية سوف تتطلب 3 هلام ميدي للقراءة.
4. لقياس تدفق البروتياسومال، تحميل 12 ميكرولتر من كسر سيتو في كل بئر.
5. عينات بروتين منفصلة من قبل SDS-PAGE ونقلها إلى أغشية فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) باستخدام بروتوكولات قياسية. إذا كان من المتوقع النشاف الغربية لLC3b، نقل المواد الهلامية باستخدام 20٪ الميثانول التي تحتوي على المخزن المؤقت نقل. خلاف ذلك، استخدم 10٪ الميثانول التي تحتوي على نقل العازلة لأن هذا سوف تمكن من نقل أكثر كفاءة من أنواع البروتين عالية الوزن الجزيئي.
6. تنفيذ النشاف الغربية باستخدام بروتوكولات قياسية. لتحليل تدفق الماكرووتافالجيك، الأغشية وصمة عار تحتوي على عينات 3KP مع الأجسام المضادة للp62 أو المضادة لLC3b (1:1000) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. لتحليل تدفق البروتياسومال، الأغشية وصمة عار تحتوي على عينات سيتو مع المضادة للليس⁴⁸ بوليوبيكتين محددة (1:1000) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
7. صورة البقع الغربية باستخدام الأجسام المضادة الثانوية القياسية وأجهزة التصوير. صورة جميع الأغشية التي تشكل تجربة سلسلة زمنية معينة معا.

7- تحليل البيانات

ملاحظة: راجع الملف التكميلي "نموذج البيانات".

1. لإجراء قياس الكثافة على عينات اللطخة الغربية، استخدم برنامج الرسومات القياسيةأو Image Studio أو ImageJ بدلاً من ذلك.
2. إجراء قياسات قياس الكثافة على نطاقات ذات أهمية لكل من المنحنى القياسي والعينات التجريبية. في Image Studio، باستخدام p62 كمثال، رسم مستطيل طويل يشمل مونومر البروتين في الجزء السفلي وتمتد إلى الجزء العلوي من الغشاء. نسخ المستطيل ولصقه ونقله إلى العينات المتبقية. من المهم الحفاظ على المستطيل المستخدم للقياس الكمي متسقبين العينات.
3. حفظ القياس الكمي إلى جدول بيانات عن طريق الضغط على تقرير وجدول البيانات في أسفل يمين إطار التحليل.
4. قم بإنشاء منحنى قياسي للكثافة مع جدول بيانات باستخدام العينة القياسية المخففة تسلسلياً واستخدم إما الانحدار الخطي أو متعدد الحدود للحصول على معادلة منحنى قياسية تناسب أفضل. باستخدام هذه المعادلة، استقراء كمية p62، LC3b-II أو Lys⁴⁸-poly Ub في العينات التجريبية.
5. للحصول على قياسات التدفق، طرح كمية البروتين استقراء من كل عينة المعالجة بمثبطات من متوسط قيمة عينات PBS من نفس النقطة الزمنية (انظر الملف التكميلي "عينة البيانات").
6. تقييم الأهمية الإحصائية للتباين الزمني في دوران البروتين باستخدام ANOVA في اتجاه واحد. ويمكن القيام بذلك باستخدام برنامج جدول البيانات القياسي.

النتائج

وترد البيانات التمثيلية في الشكل 2ألف باء،ويرد التحديد الكمي لهذه البيانات في الشكل 2جيم(د) (انظر أيضاً الملف التكميلي "بيانات العينة"). للبساطة، لم نصور عناصر تحكم التحميل في الشكل 2 ولكن يجب الحصول عليها بالتوازي...

Discussion

يصف بروتوكولنا وسيلة مباشرة من الناحية الفنية لقياس الإيقاعات البيولوجية في دوران البروتين في الفئران باستخدام معدات البيولوجيا الجزيئية المتاحة عادة. بسبب طول تجارب السلاسل الزمنية وعدد العينات البيولوجية المعنية، من المهم أن تكون متسقة عبر التجربة بأكملها فيما يتعلق بكيفية حقن الفئ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x SDS PAGE Sample Buffer	Invitrogen	Cat# NP0008
Bortezomib	EMD Millipore	Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7
Image Studio	LICOR	N/A
Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron	Merck Millipore Ltd	Cat# IPFL00010
K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	Cat#8081S; RRID:AB_10859893
LC3a	Boston Biochem	Cat# UL-430
LC3b antibody	Novus	Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146
LC3b antibody	Cell Signaling Technology	Cat#2775; RRID:AB_915950
Leupeptin	Sigma	Cat# L2884; CAS: 103476-89-7
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	Cat# WG1403BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Fisher Scientific	Cat# NP0007
P62-his	Novus	Cat# NBP1-44490
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards	Bio-Rad	Cat# 1610373
Rabbit Anti-p62/SQSTM1	Millipore-Sigma	Cat#P0067; RRID:AB_1841064
rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)	Boston Biochem	Cat# UC-230
SDS-PAGE Midi-size Gels	Invitrogen	Cat# WG1403
SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets	Millipore-Sigma	Cat# S8830