מדידת מקצבים הדיורnal בתצוגה מקדימה של הזרם ופרוטאספאל השטף

Summary

אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו למדידת מקצבים ביולוגיים בקטוליזם חלבונים באמצעות הוראות משוב ושוב בכבד העכבר.

Abstract

תאים מעסיקים מספר שיטות למיחזור חלבונים בלתי רצויים וחומרים אחרים, כולל ליזוזומיום ושבילים לא-ליסוזומ. המסלול העיקרי התלוי למטה מכונה באופן אוטומטי, ואילו השיטה העיקרית שאינה ליסוזומלית עבור קטאבוליזם חלבונים היא מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין. מחקרים שנעשו לאחרונה במודל אורגניזמים מצביעים על כך שהפעילות של שני הדגמים האוטומטיים ומערכת אוביקוויב-פרוטאסאין אינה קבועה לאורך היום, אך במקום זאת משתנה בהתאם לקצב היומי (circadian). היכולת למדוד מקצבים ביולוגיים במחזור החלבונים חשוב להבין כיצד מושגת בקרת איכות סלולרית ולהבנת הדינמיקה של חלבונים ספציפיים המעניינים אותך. כאן אנו מציגים פרוטוקול מתוקננת עבור ככמת השטף האוטומטי ו הפרוטאסאואל בvivo כי לוכדת את רכיב האחראי של מחזור החלבון. הפרוטוקול שלנו כולל פרטים על הטיפול בעכבר, רקמת עיבוד, משבר, וכימות השטף האוטומטית באמצעות הכבד של העכבר כמו החומר ההתחלתי.

Introduction

מקצבים circadian מתייחסים היום, וריאציות צפויות בתפקוד הביולוגי הגלויים ברחבי הטבע. הם קיימים בכל קנה מידה ביולוגי, מהתנהגויות מאקרוסקופיות כמו מחזורי התעוררות לשינה, לתופעות מולקולריות כמו השפע הקצבי של biomolecules. בשנים האחרונות, המחקר לתוך מקצבים מעגליות השתנה על ידי גילוי של "גנים שעון" כי הם קריטיים ליצירת קצב מעגלי. מחקרים בשעון גנים הסתרה עכברים חשפו תפקיד מרכזי עבור מקצבים מעגליות באופן זמני ארגון תהליכים סלולאריים ליבה כגון חילוף החומרים¹. בין הדרכים מקצבים מעגליות לגרום לזה לקרות הוא על ידי הקניית מבנה זמני לקטוליזם חלבון.

מספר קבוצות כולל שלנו הראו כי שתי השדרות הגדולות לקטאבליזם חלבונים סלולריים, התצוגה האוטומטית של מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין, הם כפופים מקצבים יומי^2,3,4,5. הבחירה האוטומטית מייצגת את הזרוע התלוית-ליקיה של קטאבוליזם חלבונים, שבה חלבונים מעניינים מועברים לdegradative זה או דרך הבנייה של שלפוחית הרומן (מאקרואוטומטית) או באמצעות טרנסלוקציה ישירה למרות ש ערוץ (שלווה אוטומטית מתווכת)⁶. מערכת אוביקוויב-פרוטסאין היא מסלול הראשי ללא-ליזוזומלית, שם חלבונים הם פולי-אוביקוויל ולאחר מכן ניזונים לתוך פרוטאסדום, מכונת macromolecular degradative שנמצאו ברחבי הציטופלסמה וגרעין^7,8. המקצבים בפעילות האוטומטית והפרוטאספראל הם חשובים מכיוון שהם נוטים לשחק תפקיד במשק הבית הסלולרי. כתוצאה מכך, זה חשוב שיש הליך מתוקננת שיכול לזהות תנודות יומיות של קטאבוליזם חלבונים התואמים עם מודלים טרום קליניים מחלות.

כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול שלנו כדי לכמת וריאציות יומי השטף האוטומטי בכבד העכבר, אשר שימש כבסיס לעבודה במעבדה שלנו^3,9. השיטה שלנו מסווגת "שיטת מחזור"¹⁰, גישה המשמשת על ידי קבוצות רבות כדי למדוד פעילות פרוטחרדה (או שטף). בגישה זו, מעכבי פרוטאז ספציפיים לlysosomes או פרוטאסמס ניתנת לעכברים ולאחר מכן דגימות רקמות מתקבלים לאחר מרווח זמן קבוע. במקביל, דגימות רקמות מתקבלות מעכברים נתון זריקות מזויף. דגימות רקמות הם הומוגניים ולאחר מכן ביולוגי הופרדו כדי לקבל את השברים lysosome מועשר, cytoplasmic. שברים אלה מנותח לאחר מכן במקביל דרך הכתמים המערביים באמצעות נוגדנים ספציפיים סמנים macroLC3b hagy (ו-p62) או מצעים פרוטאספאל (חלבון פולי-אוביקטים). במשך הזמן, חיות מוזרק עם מעכבי פרוטאז לצבור חלבונים שהיו בדרך כלל היה ממוחזר. כתוצאה מכך, שיעור המחזור משתמעת על ידי השוואת השפע של חלבונים סמן בדגימות פרוטאז-מעכב הטיפול לדגימות מטופל המזויף. על-ידי חזרה על שיטה זו במרווחי זמן קבועים לאורך היום, ניתן לשחזר וריאציות מעגליות ב-פרוטפוליזיס (איור 1A).

Protocol

הפרוטוקול המתואר כאן אושר על ידי אוניברסיטת וושינגטון בכנסיית סנט לואיס בעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC).

1. מגורי העכבר ותכנון ניסיוני

1. כדי לזהות מקצבים יומיים במחזור החלבונים, עכברים בבית (זכר או נקבה C57BL/6J, 4-8 שבוע בן, 20 עד 25 גרם) תחת סטנדרטי 12 h מחזורי אור/כהה עם מזון סיפק ad libitum. כדי להימנע מלהלחיץ את בעלי החיים, עכברים לפחות שבוע אחד במתקן לפני השימוש ולהימנע דיור יחיד. על מנת להוכיח כי המקצבים בקטוליזם החלבונים הם באמת אחראי (כלומר, מונע על ידי השעון הביולוגי הפנימי של בעל החיים), עכברים בבית תחת תנאים כהים מתמדת, מטפל כדי למנוע חשיפת העכברים לאור אקסוגני.
   הערה: לפרטים על מגורים העכבר לניסויים בקצב מעגלי ראה את ההפניה הבאה¹¹.
2. עבור כל נקודת זמן, להקצות שלושה עכברים כמו שולטת המזויף לפחות שלושה עכברים עבור כל סוג של מעכבי פרוטאז בשימוש (leupeptin עבור השטף האוטומטי ובורטזומב עבור מדידות השטף פרוטאסאואל). תכנון 6 נקודות זמן באופן שווה במרווחים של 4 שעות לאורך היום/לילה מחזור להשיג דגימות רקמות.
   הערה: A 24 h, 6 נקודת זמן ניסוי עם מלוחים באגירה פוספט (PBS), leupeptin, ו bortezomib יברות ידרוש סך של 54 עכברים (3 לכל טיפול x 3 טיפולים x 6 נקודות זמן).

2. הכנת תמיסת הומוגון, פתרונות מלאי מעכב ומבחנות לאוסף כבד העכבר

1. להכין מאגר הומוגון טרי (HB) ולשמור על הקרח: 10 mM טריס-HCl pH 7.5, 250 mM סוכות, 5 mM EDTA pH 8.0, ו 1 מעכב פרוטאז לוח לכל 100 mL.
   הערה: כ 10 מ ל של HB נדרש לכל עכבר.
2. עבור עיבוד במורד הזרם של דגימות ביולוגיות, כל מדגם מחייב 15 מ ל שפופרת חרוט להחזיק את המגון גולמי, 15 מ"ל צינור להחזיק את supernatant פוסט גרעיני, שני 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות להחזיק את 3,000 x g ו 20,000 x g מפלטד חומר, בהתאמה, ושפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL להחזיק את השבר cytoplasmic. הוסיפו 7 מ ל של HB הצטננות לכל צינורית המיועדת להומוגון גסה ושמרו על קרח.
3. להכין פתרון 2 מ"ג/mL של מלאי של leupeptin המי-סולפט ב-PBS סטרילי. כמו כן להכין פתרון 50 mg/mL של בורטזומב diמתיל סולפוקסיד (DMSO). הקליקו ואחסנו את הפתרונות ב-80 ° c.

3. מינהל מעכבי פרוטאז

1. הפשרת לוקיטין (2 מ"ג/mL) ובורטזומלי (50 מ"ג/mL) פתרונות מניות לטמפרטורת החדר 15 דקות לפני כל נקודת זמן. . מלאי הלופטין מוכן לזריקה לדלל את הבורזומב ב-PBS סטרילי כדי להניב פתרון מ50 μg/mL עובד.
   הערה: בוריזומאיב היא רגישה באור, ולכן להגן על מלאי העבודה מפני האור עד השימוש.
2. שוקלים עכברים ולבצע זריקות הצפק של "שם" PBS (0.5 mL), leupeptin (40 מ"ג/ק"ג), או bortezomib או (1.6 μg/ק"ג). החזר עכברים לכלובים המסומנים כהלכה המקובצים לפי סוג הזריקה שהם קיבלו. תעד את הזמן שבו העכברים מטופלים או מניפולציות בטבלה סטנדרטית (ראה קובץ משלים "מדגם נתונים").
   הערה: מחשבון מינון כלול כסיוע בקובץ משלים "לדוגמה נתונים". חשוב לבצע זריקות בזריזות ובאותו סדר מ-timepoint לנקודת זמן כדי למזער את השונות.

4. רכישת רקמות ואחסון

1. שעתיים לאחר ההזרקה, המתת החסד של עכברים אחד בכל פעם, בהתאם לפרוטוקול IACUC מאושר מבחינה מבצעית. לדוגמה, עכברים מורדם ולאחר מכן המתת חסד על ידי פריקה צוואר הרחם. המשך לשלב הניתוח מיד. לאחר המתת החסד
   הערה: להבטיח הרדמה מלאה לפני פריקה צוואר הרחם על ידי כפות הקדמיות צובט ללא רפלקס הנצפה.
2. הסר את האונה השמאלית של הכבד על ידי ביצוע 1.5 כדי 2.0 ס"מ חתך עם מספריים Metzenbaum על הבטן הגגבית של העכבר. להחצין את האונה השמאלית של הכבד ולבלו אותו עם מספריים כירורגיים. יש לטבול את דגימת הכבד ב -7 מ ל בתוך שפופרת הקרח הקרה בעלת תווית של 15 מ"ל. שמור את המדגם על הקרח במהלך העיבוד.
   הערה: ניתן לשמור את הדגימות בקרח או ב -4 ° c בלילה לפני שממשיכים. אם סמנים סטנדרטיים של הפעילות מאקרואוטומטית ו-פרוטאספאל הם הקריאות המיועדות רק, דגימות הכבד יכול להיות מוקפא בחנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 ° c לעיבוד מאוחר יותר. כדי לבחון מטרות אחרות של השפלה (למשל, באמצעות פרוטאומניקס), לעבד את הדגימות בלי לקפוא.
3. המשך להרוג ולנתח את העכבר הבא עד שכל הדגימות נרכשים. לעבד עכברים באותה הסדר קבוצתי שהם הזריקו ולהקליט את המשך של שלב זה (ראה קובץ משלים "לדוגמה נתונים"). כל עכבר צריך להיות מעובד תחת 5 דקות כדי להגביל את ההפרש בזמני חשיפה עבור מעכבי מוזרק.

5. שבירה ביוכימית של דגימות כבד

הערה: איור 1B מציג את סכימת השבר.

1. העבר כל דגימת כבד ו-7 מ ל של HB לתוך 15 mL בקיבולת הומוגנידצר. המגון לסדר את המדגם עם 10 משיכות של בוכנה רופף 15 משיכות של בוכנה הדוקה. החזר את המגון הגולמי הנוצר לצינור החרוט של 15 מ ל שמקורו. אני חוזר עד שכל דגימות. הכבד הומוגניים
2. ספין גולמי המגון בדגימות ב 700 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' כדי גרעיני גלולה ופסולת. העבר את החלק העליון 4 מ ל של supernatant שלאחר הגרעין (S1) לצינור מחדש של 15 מ ל חרוט.
3. קבע את ריכוז החלבון של שבר S1 באמצעות ברדפורד או החומצה הבינוגית (bca) בחני על פי הוראות היצרן. הבא להשוות את הריכוזים של כל הדגימות כדי 2.1 mg/mL או לריכוז הרצוי על ידי הוספת HB החדש כדי S1 במידת הצורך. הדגימות המנורמלות הן שבר "סה כ חלבון" (עד). למטרות אנליטיות במורד הזרם ושיפור איכות, סדרת מחלקים 500 μl של שבר עד וחנות ב-80 ° c.
4. העברת 1.5 mL של שבריר שארית לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה ספין ב 3,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c. העבר 1 mL של התוצאה supernatant (S2) לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי ולהגדיר על קרח.
5. ולשטוף את הסופרנטאנט הנותרים ולרחוץ את 3,000 x גלולה (3KP) פעמיים עם 1.5 ML של הקרים HB. 3KP גלולה ניתן לאחסן יבש ב-80 ° צ' אם המטה הפרוטמרים צפויים. אם רק לחסום מערבי צפוי, להשעות מחדש את 3KP גלולה ב-200 μl של נתרן dodecyl סולפט אלקטרופורזה ג'ל טפלון (sds-PAGE) לדוגמה מאגר (טבלת חומרים) ו לרתוח ב 95 ° צ' עבור 5 דקות.
6. ספין את השבר S2 ב 20,000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c. העבר את התוצאה (S3) לשפופרת מיקרוצנטריפוגה טרייה. S3 היא השבר cytoplasmic (cyto). עבור SDS-עמוד, לשלב 150 μL של Cyto שבר עם 50 μl של 4X sds-מאגר לדוגמה עמוד ולרתוח ב 95 ° צ' עבור 5 דקות.
7. מ20KP את הסופרנטאנט הנותרים מתוך כדור ה20,000 x g (משחק) ולשטוף פעמיים עם 1.5 mL של הקרים HB. 20KP גלולה ניתן לאחסן יבש ב-80 ° צ' אם המטה הפרוטמרים צפויים. אם רק לחסום מערבי צפוי, להשעות מחדש את 20KP גלולה ב-100 μl של sds-מאגר לדוגמה עמוד ולרתוח ב 95 ° צ' עבור 5 דקות.

6. הבלוג המערבי

1. על מנת לכמת את השטף המקרו-אוטומטיים והפרוטאספאל באמצעות בלוק מערבי, להלחין פתרון מניות של GT מטוהרים-LC3b (2 μg/mL), p62-שלו₆ (2 μg/ml), ו-Lys⁴⁸ מקושרים polyubiquitin (K48-וכד, 50 μg/ml) ב 1x sds- לאחר רתיחה ב 95 ° c עבור 5 דקות, סדרת מחלקים ו חנות ב-80 ° צ' לשימוש עתידי.
2. בזמן ה-SDS-PAGE, צור עיקול סטנדרטי של 6 נקודות של תערובת החלבון הסטנדרטי על-ידי דילול מ1:3 במאגר של 1x SDS-עמוד לדוגמה. טען 10 μL של כל מדגם עקום רגיל על 26 טוב 4-12% SDS-עמוד midi-ג'ל, ואחריו תקני חלבון מוכתם (טבלת חומרים), תקן מולקולרי מולקולרית משקל.
3. למדידת השטף האוטומטי, טען 12 μL של 3KP לתוך כל טוב.
   הערה: בהנחה התחזות, בורטזומב, וטיפולים לוקיטין נעשו ובהנחה 3 עכברים לכל טיפול, כל נקודת זמן צריכה להכיל 9 דגימות. לכן, כל midi-ג'ל יכול להכיל 2 נקודות זמן בתוספת עקומת הרגיל ואת הניסוי סדרת זמן אופייני ידרוש 3 midi-ג'לים עבור הבדיקה.
4. למדידת השטף פרוטאספאל, טען 12 μL של Cyto שבר לתוך כל טוב.
5. הפרדה בין דגימות חלבון באמצעות SDS-PAGE והעברה ל-polyvinylidene פלואוריד (PVDF) ממברנות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. אם מLC3b מערבי צפוי, להעביר ג'לים באמצעות 20% מתנול המכיל מאגר העברה. אחרת, השתמש ב-10% מתנול המכיל מאגר העברה מאחר שפעולה זו תאפשר העברה יעילה יותר של מינים מולקולריים גבוהים של חלבון משקל.
6. בצע בלוק מערבי באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. לניתוח שטף מאקרומי, ממברנות כתמי המכילים 3KP דגימות עם אנטי p62 או Anti-LC3b נוגדנים (1:1000) לילה ב 4 ° c. לניתוח השטף פרוטאספאל, ממברנות כתמי המכיל Cyto דגימות עם Anti-Lys⁴⁸ ספציפי polyubiquitin (1:1000) לילה ב 4 ° c.
7. תמונה הכלים מערבי באמצעות נוגדנים משני סטנדרטיים התקנים הדמיה. התמונה כל ממברנות המהווים ניסוי סדרת זמן נתון יחד.

7. ניתוח נתונים

הערה: ראה קובץ משלים "נתונים לדוגמה".

1. כדי לבצע הדסילנסה על דגימות כתמי מערביות, השתמש בתוכנה גרפית סטנדרטית, בסטודיו תמונה או לחילופין imagej.
2. ביצוע מדידות דנסיטומטריות על להקות התעניינות הן בעקומת התקן והן בדגימות הניסוי. בסטודיו תמונה, באמצעות p62 כדוגמה, לצייר מלבן ארוך המקיף מונומר חלבון בתחתית והארכת לחלק העליון של קרום. העתק, הדבק והזז את המלבן לדגימות הנותרות. חשוב לשמור על המלבן המשמש לכימות העקביות בין דגימות.
3. שמור את הקוונפיקציה לגיליון אלקטרוני על-ידי הקשה על דוח ושיגור גיליון אלקטרוני בחלק הימני התחתון של חלון הניתוח.
4. צור עקומת התקן densi, עם גיליון אלקטרוני באמצעות מדגם סטנדרטי מדולל באופן סדרתי ולהשתמש ברגרסיה לינארית או פולינומיאלית כדי לקבל משוואה עקומה רגילה המתאימה ביותר. באמצעות משוואה זו, לשער את כמות p62, LC3b-II או ליס⁴⁸-פולי רוב בדגימות ניסיוני.
5. כדי להשיג את מדידות השטף, להפחית את כמות החלבון שיעור של כל מעכב מטופל מתוך הערך הממוצע של דגימות PBS מאותו נקודת זמן (ראה קובץ משלים "לדוגמה נתונים").
6. הערכת המשמעות הסטטיסטית של וריאציה טמפורלית במחזור החלבונים באמצעות ANOVA בדרך אחת. ניתן לעשות זאת באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני רגיל.

תוצאות

נתונים מייצגים מוצגים באיור 2א, ב, והקוונפיקציה של נתונים אלה מסופקים באיור 2C, D (ראה גם קובץ משלים "מדגם נתונים"). למען הפשטות, לא מתוארת הטענת שולטת באיור 2 אך יש להשיג זאת במקביל. בדרך כלל, בלוטים מערביים נגד β-actin מש...

Discussion

הפרוטוקול שלנו מתאר אמצעי מבחינה טכנית פשוטה למדידת מקצבים ביולוגיים במחזור החלבונים בעכברים באמצעות ציוד מולקולרי זמין נפוץ בביולוגיה. בגלל המשך הניסויים בסדרת הזמן ומספר הדגימות הביולוגי המעורבות, חשוב להיות עקבי לאורך כל הניסוי בנוגע לאופן הזרקת העכברים, התזמון של רכישת רקמות והעיב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x SDS PAGE Sample Buffer	Invitrogen	Cat# NP0008
Bortezomib	EMD Millipore	Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7
Image Studio	LICOR	N/A
Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron	Merck Millipore Ltd	Cat# IPFL00010
K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	Cat#8081S; RRID:AB_10859893
LC3a	Boston Biochem	Cat# UL-430
LC3b antibody	Novus	Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146
LC3b antibody	Cell Signaling Technology	Cat#2775; RRID:AB_915950
Leupeptin	Sigma	Cat# L2884; CAS: 103476-89-7
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	Cat# WG1403BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Fisher Scientific	Cat# NP0007
P62-his	Novus	Cat# NBP1-44490
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards	Bio-Rad	Cat# 1610373
Rabbit Anti-p62/SQSTM1	Millipore-Sigma	Cat#P0067; RRID:AB_1841064
rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)	Boston Biochem	Cat# UC-230
SDS-PAGE Midi-size Gels	Invitrogen	Cat# WG1403
SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets	Millipore-Sigma	Cat# S8830