Messung von diurnalen Rhythmen in autophagischen und proteasomalen Flux

Zusammenfassung

Wir beschreiben unser Protokoll zur Messung biologischer Rhythmen im Proteinkatabolismus über Autophagie und das Proteasom in der Mausleber.

Zusammenfassung

Zellen verwenden mehrere Methoden zum Recycling unerwünschter Proteine und anderer Materialien, einschließlich lysosomaler und nicht-lysosomaler Wege. Der Hauptlysosome-abhängige Weg wird Autophagie genannt, während die primäre nicht-lysosomale Methode für Proteinkatabolismus das Ubiquitin-Proteam-System ist. Jüngste Studien an Modellorganismen deuten darauf hin, dass die Aktivität sowohl der Autophagie als auch des Ubiquitin-Proteasom-Systems nicht täglich konstant ist, sondern je nach täglichem (zirkadianem) Rhythmus variiert. Die Fähigkeit, biologische Rhythmen im Proteinumsatz zu messen, ist wichtig, um zu verstehen, wie die zelluläre Qualitätskontrolle erreicht wird, und um die Dynamik bestimmter Proteine von Interesse zu verstehen. Hier präsentieren wir ein standardisiertes Protokoll zur Quantifizierung des autophagischen und proteasomalen Flusses in vivo, das die zirkadiane Komponente des Proteinumsatzes erfasst. Unser Protokoll enthält Details zur Maushandhabung, Gewebeverarbeitung, Fraktionierung und autophagischen Flussquantifizierung mit Mausleber als Ausgangsmaterial.

Einleitung

Zirkadische Rhythmen beziehen sich auf tägliche, vorhersehbare Variationen der biologischen Funktion, die in der ganzen Natur sichtbar sind. Sie existieren auf jeder biologischen Skala, von makroskopischen Verhaltensweisen wie Schlaf-Wach-Zyklen bis hin zu molekularen Phänomenen wie der rhythmischen Fülle von Biomolekülen. In den letzten Jahren hat sich die Erforschung zirkadianer Rhythmen durch die Entdeckung von "Uhrengenen" verändert, die für die zirkadiane Rhythmuserzeugung entscheidend sind. Studien an Clock-Gen-Knockout-Mäusen haben eine zentrale Rolle für zirkadiane Rhythmen bei der zeitlichen Organisation von kernzellulären Prozessen wie Stoffwechsel¹gezeigt. Zu den Möglichkeiten, wie zirkadiane Rhythmen dies ermöglichen, gehört die Vermittlung einer zeitlichen Struktur zum Proteinkatabolismus.

Mehrere Gruppen, darunter unsere, haben gezeigt, dass die beiden Hauptwege für zellulären Proteinkatabolismus, Autophagie und das Ubiquitin-Proteasom-System, den Tagesrhythmen^2,3,4,5unterliegen. Die Autophagie stellt den lysosomenabhängigen Arm des Proteinkatabolismus dar, in dem Proteine von Interesse entweder durch den Bau einer neuartigen Vesikel (Makroautophagie) oder durch direkte Translokation durch eine Kanal (Chaperon vermittelte Autophagie)⁶. Das Ubiquitin-Proteasom-System ist der wichtigste nicht-lysosomale Weg, bei dem Proteine polyubiquitiniert und dann in das Proteasom eingespeist werden, eine makromolekulare Degradative Maschine, die im gesamten Zytoplasma und Kern gefunden wird^7,8. Rhythmen in autophagischer und proteasomaler Aktivität sind wichtig, weil sie wahrscheinlich eine Rolle in der zellulären Haushaltsführung spielen. Daher ist es wertvoll, ein standardisiertes Verfahren zu haben, das tägliche Schwingungen im Proteinkatabolismus erkennen kann, die mit präklinischen Krankheitsmodellen kompatibel sind.

Hier stellen wir unser Protokoll zur Quantifizierung von Tagesschwankungen im autophagischen Fluss in der Mausleber zur Verfügung, das als Grundlage für die Arbeit in unserem Labor^{diente 3,9}. Unsere Methode wird als "Umsatz-Assay"¹⁰klassifiziert, ein Ansatz, der von zahlreichen Gruppen verwendet wird, um proteolytische Aktivität (oder Fluss) zu messen. Bei diesem Ansatz werden Proteasehemmer, die für Lysosomen oder Proteasomen spezifisch sind, Mäusen verabreicht und anschließend Gewebeproben nach einem festen Zeitintervall erhalten. Parallel dazu werden Gewebeproben von Mäusen gewonnen, die Scheininjektionen unterzogen werden. Die Gewebeproben werden homogenisiert und dann biochemisch getrennt, um die lysosososomeangereicherten und zytoplasmatischen Fraktionen zu erhalten. Diese Fraktionen werden dann parallel über Western Blotting mit Antikörpern analysiert, die spezifisch für makroautophagy Marker (LC3b und p62) oder proteasomale Substrate (poly-ubiquitiniertes Protein) sind. Im Laufe der Zeit akkumulieren Tiere, die mit Proteasehemmern injiziert werden, Proteine, die normalerweise recycelt worden wären. Infolgedessen wird die Umsatzrate durch den Vergleich der Häufigkeit von Markerproteinen in den mit Protease-Hemmerbehandelten behandelten Proben mit den scheinbehandelten Proben abgeleitet. Durch die Wiederholung dieser Methode in festen Zeitintervallen über den Tag ist es möglich, zirkadiane Variationen in der Proteolyse zu rekonstruieren (Abbildung 1A).

Protokoll

Das hier beschriebene Protokoll wurde von der Washington University in St. Louis Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.

1. Mausgehäuse und experimentelles Design

1. Um tägliche Rhythmen im Proteinumsatz zu erkennen, hause Mäuse (männlich oder weiblich C57BL/6J, 4 x 8 Wochen alt, 20-25 g) unter Standard 12 h Licht/Dunkel-Zyklen mit Lebensmitteln ad libitumzur Verfügung gestellt. Um Stress zu vermeiden, können Sie Mäuse mindestens eine Woche lang in der Anlage vor der Anwendung anklimatisieren und einzelne Unterkünfte vermeiden. Um zu beweisen, dass Rhythmen im Proteinkatabolismus wirklich zirkadianer sind (d.h. angetrieben von der inneren biologischen Uhr des Tieres), beherbergen Mäuse unter konstanten dunklen Bedingungen, wobei darauf geachtet wird, dass die Mäuse nicht exogenem Licht aussetzen.
   HINWEIS: Details zum Mausgehäuse für zirkadiane Rhythmusexperimente finden Sie in der folgenden Referenz¹¹.
2. Weisen Sie für jeden Zeitpunkt drei Mäuse als Scheinkontrollen und mindestens drei Mäuse für jede verwendete Art von Proteasehemmer zu (Leupeptin für autophagischen Fluss und Bortezomib für proteasomale Flussmessungen). Planen Sie sechs Zeitpunkte, die gleichmäßig in 4-Stunden-Intervallen über den Tag/Nacht-Zyklus verteilt sind, um Gewebeproben zu erhalten.
   HINWEIS: Ein 24-Stunden-, 6-Zeitpunkt-Experiment mit phosphatgepufferter Kochsaline (PBS), Leupeptin und Bortezomib erfordert insgesamt 54 Mäuse (3 pro Behandlung x 3 Behandlungen x 6 Zeitpunkte).

2. Vorbereitung von Homogenisierungslösung, Inhibitor Stock Solutions und Vials für die Mauslebersammlung

1. Frischer Homogenisierungspuffer (HB) vorbereiten und auf Eis halten: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM Saccharose, 5 mM EDTA pH 8,0 und 1 Proteasehemmer tablette pro 100 ml.
   HINWEIS: Pro Maus werden ca. 10 ml HB benötigt.
2. Für die nachträge Verarbeitung biologischer Proben benötigt jede Probe ein 15 ml kegelförmiges Rohr, um das Rohhomogenat, ein 15 ml-Rohr für den postnuklearen Überstand, zwei 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre zu halten, um die 3.000 x g und 20.000 x g pelleted zu halten. Material bzw. ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, um die zytoplasmatische Fraktion zu halten. Fügen Sie 7 ml kalte HB zu jedem Rohr für rohöl homogenisieren und auf Eis halten.
3. Bereiten Sie eine 2 mg/ml-Stammlösung von Leupeptin-Hemi-Sulfat in sterilem PBS vor. Bereiten Sie auch eine 50 mg/ml-Lösung von Bortezomib in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor. Aliquot und lagern Sie die Lösungen bei -80 °C.

3. Protease-Hemmer-Verabreichung

1. Leupeptin (2 mg/ml) und Bortezomib (50 mg/ml) auf Raumtemperatur 15 min vor jedem Zeitpunkt auftauen. Der Leupeptin-Bestand ist zur Injektion bereit. Verdünnen Sie das Bortezomib in sterilem PBS, um eine Arbeitslösung von 50 g/ml zu erhalten.
   HINWEIS: Bortezomib ist lichtempfindlich, so schützen Sie den Arbeitsbestand vor Licht bis zum Gebrauch.
2. Wiegen Sie Mäuse und führen Sie intraperitoneale Injektionen von "Schein" PBS (0,5 ml), Leupeptin (40 mg/kg) oder Bortezomib (1,6 g/kg) durch. Bringen Sie Mäuse in entsprechend markierte Käfige zurück, die nach der Art der Injektion gruppiert sind, die sie erhalten haben. Zeichnen Sie die Zeit auf, zu der die Mäuse in einer standardisierten Tabelle behandelt oder manipuliert werden (siehe Ergänzungsdatei "Beispieldaten").
   HINWEIS: Ein Dosisrechner ist als Hilfsmittel in der Zusatzdatei "Beispieldaten"enthalten. Es ist wichtig, Injektionen schnell und in der gleichen Reihenfolge von Zeitpunkt zu Zeitpunkt durchzuführen, um die Variabilität zu minimieren.

4. Gewebeerwerb und -lagerung

1. Zwei Stunden nach der Injektion, einschläfern Mäuse nacheinander in Übereinstimmung mit dem institutionell zugelassenen IACUC-Protokoll. Zum Beispiel, Anästhesisieren Mäuse dann einschläfern durch Zervix-Dislokation. Fahren Sie mit dem Abschnittsschritt unmittelbar nach der Euthanasie fort.
   HINWEIS: Sorgen Sie für eine vollständige Anästhesie vor der Zervixverrenkung, indem Sie die Vorderpfoten ohne beobachtbaren Reflex kneifen.
2. Entfernen Sie den linken Leberlappen, indem Sie einen 1,5 bis 2,0 cm großen Schnitt mit der Metzenbaumschere am ventralen Bauch der Maus machen. Externalisieren Sie den linken Leberlappen und verbrauchen Sie ihn mit einer chirurgischen Schere. Untertauchen Sie die Leberprobe in 7 ml eiskaltem HB in einem entsprechend beschrifteten 15 ml konischen Rohr. Halten Sie die Probe während der gesamten Verarbeitung auf Eis.
   HINWEIS: Die Proben können über Nacht auf Eis oder bei 4 °C aufbewahrt werden, bevor sie fortgesetzt werden. Wenn Standardmarker der Makroautophagie und der proteasomale Aktivität die einzigen beabsichtigten Auslesungen sind, können Leberproben in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C zur späteren Verarbeitung gelagert werden. Um andere Abbauziele (z.B. über Proteomik) zu untersuchen, verarbeiten Sie die Proben ohne Einfrieren.
3. Fahren Sie mit der Einschläferung fort und sezieren Sie die nächste Maus, bis alle Proben erworben sind. Verarbeiten Sie Mäuse in derselben Gruppenreihenfolge, in die sie injiziert wurden, und erfassen Sie die Dauer dieses Schritts (siehe Ergänzungsdatei "Beispieldaten"). Jede Maus sollte in weniger als 5 minuten verarbeitet werden, um die Differenz der Expositionszeiten für die injizierten Inhibitoren zu begrenzen.

5. Biochemische Fraktionierung von Leberproben

HINWEIS: Abbildung 1B zeigt das Fraktionierungsschema.

1. Übertragen Sie jede Leberprobe und 7 ml HB in einen 15 ml Kapazität Dounce Homogenisator. Homogenisieren Sie die Probe mit 10 Schlägen des losen Kolbens und 15 Hüben des engen Kolbens. Bringen Sie das resultierende Rohhomogenat in das 15 ml konische Rohr zurück, aus dem es stammt. Wiederholen Sie dies, bis alle Leberproben homogenisiert sind.
2. Spin rohe Homogenatproben bei 700 x g für 10 min bei 4 °C zu Pelletkernen und Schmutz. Übertragen Sie die oberen 4 ml des postnuklearen Überstandes (S1) auf ein frisches 15 ml kegelförmiges Rohr.
3. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der Fraktion S1 mit Bradford- oder Bicinchoninsäure(BCA)-Assays gemäß den Anweisungen des Herstellers. Als nächstes die Konzentrationen aller Proben auf 2,1 mg/ml oder auf die gewünschte Konzentration zu gleichen, indem bei Bedarf frische HB zu S1 hinzugefügt wird. Die normalisierten Proben sind die "Total Protein" (Tot) Fraktion. Für nachgelagerte Analysezwecke und Qualitätsverbesserungen, aliquot 500 l der Tot-Fraktion und lagern bei -80 °C.
4. 1,5 ml der verbleibenden Tot-Fraktion in ein Mikrozentrifugenrohr geben und bei 3.000 x g 15 min bei 4 °C drehen. 1 ml des resultierenden Überstandes (S2) auf ein frisches Mikrozentrifugenrohr geben und auf Eis stellen.
5. Den restlichen Überstand ansaugen und das 3.000 x g Pellet (3KP) zweimal mit 1,5 ml kaltem HB waschen. Das 3KP-Pellet kann bei -80 °C trocken gelagert werden, wenn nachgeschaltete Proteomik erwartet wird. Wenn nur eine westliche Blotting erwartet wird, setzen Sie das 3KP-Pellet in 200 l Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Probenpuffer(Materialtabelle)wieder auf und kochen bei 95 °C für 5 min.
6. Drehen Sie die S2-Fraktion bei 20.000 x g für 20 min bei 4 °C. Übertragen Sie den resultierenden Überstand (S3) auf ein frisches Mikrozentrifugenrohr. S3 ist die zytoplasmatische (Zyto) Fraktion. Kombinieren Sie für SDS-PAGE 150 l Cyto-Fraktion mit 50 l 4x SDS-PAGE-Probenpuffer und kochen bei 95 °C für 5 min.
7. Den restlichen Überstand aus dem 20.000 x g Pellet (20KP) ansaugen und zweimal mit 1,5 ml kaltem HB waschen. Das 20KP-Pellet kann bei -80 °C trocken gelagert werden, wenn nachgeschaltete Proteomik erwartet wird. Wenn nur eine westliche Blotting erwartet wird, setzen Sie das 20KP-Pellet in 100 l SDS-PAGE-Probenpuffer wieder auf und kochen Sie bei 95 °C für 5 min.

6. Western Blotting Readout

1. Um den makroautophagischen und proteasomalen Fluss über western blotting zu quantifizieren, stellen Sie eine Stammlösung aus gereinigtem GST-LC3b (2 g/ml), p62-His₆ (2 g/ml) und Lys⁴⁸ verknüpftem Polyubiquitin (K48-Ub, 50 g/ml) im 1x SDS-PAGE-Probenpuffer zusammen. Nach dem Kochen bei 95 °C für 5 min aliquot und bei -80 °C für die zukünftige Verwendung lagern.
2. Erzeugen Sie zum Zeitpunkt von SDS-PAGE eine 6-Punkt-Standardkurve des Standard-Proteingemisches, indem Sie im 1x SDS-PAGE-Probenpuffer 1:3 seriell verdünnen. Laden Sie 10 l jeder Standard-Kurvenprobe auf ein 26 gut 4-12% SDS-PAGE Midi-Gel, gefolgt von vorgefärbten Proteinstandards (Table of Materials), einem kommerziellen Molekulargewichtsstandard.
3. Zur Messung des autophagischen Flusses 12 l 3KP Probe in jeden Bohrwert einzuladen.
   HINWEIS: Angenommen, Schein-, Bortezomib- und Leupeptin-Behandlungen wurden durchgeführt und unter der Annahme von 3 Mäusen pro Behandlung sollte jeder Zeitpunkt aus 9 Proben bestehen. Daher kann jedes Midi-Gel 2 Zeitpunkte plus die Standardkurve aufnehmen und ein typisches Zeitreihenexperiment erfordert 3 Midi-Gele zum Auslesen.
4. Zur Messung des proteasomalen Flussflusses 12 l Zytofraktion in jeden Brunnen einzuladen.
5. Trennen Sie Proteinproben nach SDS-PAGE und übertragen Sie sie mit Standardprotokollen auf Polyvinylidenfluorid -Membranen (PVDF). Wenn eine westliche Blotting für LC3b erwartet wird, übertragen Gele mit 20% Methanol-haltigen Transferpuffer. Andernfalls verwenden Sie 10% Methanol-haltigen Transferpuffer, da dies eine effizientere Übertragung von proteinreichen Proteinarten mit hohem Molekulargewicht ermöglicht.
6. Führen Sie western Blotting mit Standardprotokollen durch. Zur Analyse des makroautophagischen Flusses bloten Membranen, die 3KP-Proben mit Anti-p62- oder Anti-LC3b-Antikörpern (1:1.000) enthalten, über Nacht bei 4 °C. Zur Analyse des proteasomalen Flusses bloten Membranen, die Cyto-Proben mit Anti-Lys⁴⁸ spezifischem Polyubiquitin (1:1.000) enthalten, über Nacht bei 4 °C.
7. Bild westliche Flecken mit Standard-Sekundärantikörpern und Bildgebungsgeräten. Bild alle Membranen, die ein bestimmtes Zeitreihenexperiment zusammen bilden.

7. Datenanalyse

HINWEIS: Siehe Ergänzungsdatei "Beispieldaten".

1. Verwenden Sie die Standardgrafiksoftware, Image Studio oder alternativ ImageJ, um die Densitometrie für westliche Blotbeispiele durchzuführen.
2. Führen Sie densitometrische Messungen an Interessenbändern sowohl für die Standardkurve als auch für die experimentellen Proben durch. Zeichnen Sie in Image Studio am Beispiel p62 ein langes Rechteck, das Proteinmonomer am boden umfasst und sich bis zur Oberseite der Membran erstreckt. Kopieren, einfügen und verschieben Sie das Rechteck in die verbleibenden Beispiele. Es ist wichtig, das für die Quantifizierung verwendete Rechteck zwischen den Stichproben konsistent zu halten.
3. Speichern Sie die Quantifizierung in einer Kalkulationstabelle, indem Sie Berichts- und Tabellenstart unten rechts im Analysefenster drücken.
4. Generieren Sie eine densitometrische Standardkurve mit Tabellenkalkulation mit der seriell verdünnten Standardstichprobe, und verwenden Sie entweder eine lineare oder polynomiaale Regression, um eine standardoptimale Kurvengleichung zu erhalten. Mit dieser Gleichung extrapolieren Sie die Menge von p62, LC3b-II oder Lys⁴⁸-poly Ub in den Versuchsproben.
5. Um Flussmessungen zu erhalten, subtrahieren Sie die extrapolierte Proteinmenge jeder inhibitorbehandelten Probe vom Durchschnittswert der PBS-Proben vom gleichen Zeitpunkt (siehe Zusatzdatei "Beispieldaten").
6. Bewerten Sie die statistische Signifikanz der zeitlichen Variation des Proteinumsatzes mit 1-Wege-ANOVA. Dies kann mit Standard-Tabellenkalkulationssoftware erfolgen.

Ergebnisse

Repräsentative Daten sind in Abbildung 2A,Bdargestellt, und die Quantifizierung dieser Daten ist in Abbildung 2C,D enthalten (siehe auch Zusatzdatei "Beispieldaten"). Der Einfachheit halber haben wir die Ladesteuerungen in Abbildung 2 nicht dargestellt, aber diese sollten parallel erhalten werden. Typischerweise werden zu diesem Zweck westliche Flecken gegen das -Actin verwendet, a...

Diskussion

Unser Protokoll beschreibt ein technisch unkompliziertes Mittel zur Messung biologischer Rhythmen im Proteinumsatz von Mäusen mit allgemein verfügbaren molekularbiologischen Geräten. Aufgrund der Länge der Zeitreihenexperimente und der Anzahl der beteiligten biologischen Proben ist es wichtig, während des gesamten Experiments konsistent zu sein, wie die Mäuse injiziert werden, den Zeitpunkt der Gewebeaufnahme und die biochemische Verarbeitung von Proben. Die Injektions-, Euthanasie- und Zervixdislokationsschritte k...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x SDS PAGE Sample Buffer	Invitrogen	Cat# NP0008
Bortezomib	EMD Millipore	Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7
Image Studio	LICOR	N/A
Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron	Merck Millipore Ltd	Cat# IPFL00010
K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	Cat#8081S; RRID:AB_10859893
LC3a	Boston Biochem	Cat# UL-430
LC3b antibody	Novus	Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146
LC3b antibody	Cell Signaling Technology	Cat#2775; RRID:AB_915950
Leupeptin	Sigma	Cat# L2884; CAS: 103476-89-7
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	Cat# WG1403BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Fisher Scientific	Cat# NP0007
P62-his	Novus	Cat# NBP1-44490
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards	Bio-Rad	Cat# 1610373
Rabbit Anti-p62/SQSTM1	Millipore-Sigma	Cat#P0067; RRID:AB_1841064
rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)	Boston Biochem	Cat# UC-230
SDS-PAGE Midi-size Gels	Invitrogen	Cat# WG1403
SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets	Millipore-Sigma	Cat# S8830