Misurazione dei ritmi diurni nel flusso autofagico e proteasomico

Riepilogo

Descriviamo il nostro protocollo per la misurazione dei ritmi biologici nel catabolismo proteico tramite l'autofagia e il proteasome nel fegato di topo.

Abstract

Le cellule impiegano diversi metodi per riciclare proteine indesiderate e altro materiale, tra cui vie lisosomiali e non lisosomiche. Il principale percorso dipendente dal lisosoma è chiamato autofagia, mentre il metodo primario non lisosomico per il catabolismo proteico è il sistema ubiquitina-proteasome. Recenti studi su organismi modello suggeriscono che l'attività sia dell'autofagia che del sistema ubiquitina-proteasoma non è costante per tutto il giorno, ma varia invece in base a un ritmo quotidiano (circadiano). La capacità di misurare i ritmi biologici nel turnover delle proteine è importante per comprendere come si ottiene il controllo della qualità cellulare e per comprendere le dinamiche di specifiche proteine di interesse. Qui presentiamo un protocollo standardizzato per quantificare il flusso autofagico e proteasomico in vivo che cattura la componente circadiana del turnover delle proteine. Il nostro protocollo include dettagli per la movimentazione del mouse, l'elaborazione dei tessuti, la frazione e la quantificazione del flusso autofagico utilizzando il fegato di topo come materiale di partenza.

Introduzione

I ritmi circadiani si riferiscono a variazioni giornaliere prevedibili nella funzione biologica che sono evidenti in tutta la natura. Esistono ad ogni scala biologica, da comportamenti macroscopici come i cicli sonno-veglia, a fenomeni molecolari come l'abbondanza ritmica di biomolecole. Negli ultimi anni, la ricerca sui ritmi circadiani è stata trasformata dalla scoperta di "geni dell'orologio" che sono critici per la generazione di ritmi circadiani. Studi sui topi knockout genici dell'orologio hanno rivelato un ruolo centrale per i ritmi circadiani nell'organizzare temporaneamente i processi cellulari di base come il metabolismo¹. Tra i modi in cui i ritmi circadiani fanno questo accadere è impartire una struttura temporale al catabolismo proteico.

Diversi gruppi tra cui il nostro hanno dimostrato che le due principali vie per il catabolismo cellulare proteico, l'autofagia e il sistema ubiquitina-proteasoma, sono soggette a ritmi diurni^2,3,4,5. L'autofagia rappresenta il braccio lisoso-dipendente del catabolismo proteico in cui le proteine di interesse vengono consegnate a questo organello degradante sia attraverso la costruzione di un nuovo vescicolo (macroautofagia) sia attraverso la traslocazione diretta canale (chaperone mediato autofagia)⁶. Il sistema ubiquitina-protasosoma è la principale via non lisomica, dove le proteine sono poli-ubiquitinate e poi alimentate nel proteasome, una macchina degradativa macromolecolare trovata in tutto il citoplasma e nucleo^7,8. I ritmi nell'attività autofagica e proteasomica sono importanti perché probabilmente svolgono un ruolo nella pulizia cellulare. Di conseguenza, è importante avere una procedura standardizzata in grado di rilevare le oscillazioni giornaliere nel catabolismo proteico che è compatibile con i modelli di malattia pre-clinica.

Qui, forniamo il nostro protocollo per quantificare le variazioni diurne nel flusso autofagico nel fegato di topo, che è servito come base per il lavoro nel nostro laboratorio^3,9. Il nostro metodo è classificato come un "asay di turnover"¹⁰, un approccio utilizzato da numerosi gruppi per misurare l'attività proteolitica (o flusso). In questo approccio, gli inibitori della proteasi specifici dei lisosomi o proteasomi vengono somministrati ai topi e quindi i campioni di tessuto vengono ottenuti dopo un intervallo di tempo fisso. Parallelamente, i campioni di tessuto sono ottenuti da topi sottoposti a iniezioni fittizie. I campioni di tessuto vengono omogeneizzati e poi separati biochimicamente per ottenere le frazioni arricchite e citoplasmase arricchite dal lisosomia. Queste frazioni vengono quindi analizzate in parallelo tramite gonfiore occidentale utilizzando anticorpi specifici per marcatori macroautofagia (LC3b e p62) o substrati proteasomici (proteina poli-ubiquitinated). Nel corso del tempo, gli animali iniettati con inibitori della proteasi accumulano proteine che normalmente sarebbero state riciclate. Di conseguenza, il tasso di rotazione viene dedotto confrontando l'abbondanza di proteine marcatore nei campioni trattati con proteasi-inibizionista con i campioni trattati con finta. Ripetendo questo metodo a intervalli di tempo fissi nel giorno è possibile ricostruire le variazioni circadiane nella proteolisi (Figura 1A).

Protocollo

Il protocollo qui descritto è stato approvato dalla Washington University in St. Louis Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Alloggiamento del mouse e progettazione sperimentale

1. Per rilevare i ritmi giornalieri nel turnover delle proteine, i topi domestici (maschio o femmina C57BL/6J, 4-8 settimane di età, 20-25 g) secondo i cicli di luce/oscurità standard 12 h con cibo fornito ad libitum. Per evitare di stressare gli animali, acclimatarsi per almeno una settimana nella struttura prima dell'uso ed evitare un singolo alloggiamento. Per dimostrare che i ritmi nel catabolismo proteico sono veramente circadiani (cioè, guidati dall'orologio biologico interno dell'animale), i topi di casa in condizioni di buio costante, avendo cura di evitare di esporre i topi alla luce esogena.
   NOT: Per informazioni dettagliate sull'alloggiamento dei topi per gli esperimenti di ritmo circadiano, vedere il seguente riferimento¹¹.
2. Per ogni time point, allocare tre topi come controlli finti e almeno tre topi per ogni tipo di inibitore della proteasi utilizzato (leupeptina per il flusso autofagico e bortezomib per le misurazioni del flusso proteasomico). Pianificare per sei punti temporali distanziati uniformemente a intervalli di 4 h durante il ciclo giorno/notte per ottenere campioni di tessuto.
   NOT: Un esperimento di 24 h, 6 punti temporali con salina tamponata di fosfati (PBS), leupeptina e bortezomib richiederà un totale di 54 topi (3 per trattamento x 3 trattamenti x 6 punti temporali).

2. Preparazione della soluzione di omogeneizzazione, delle soluzioni per il supporto inibitore e delle fiale per la raccolta del fegato di topo

1. Preparare il buffer di omogeneizzazione fresco (HB) e tenere sul ghiaccio: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM di saccarosio, 5 mM EDTA pH 8.0 e 1 compressa inibitore proteasi per 100 mL.
   NOT: Sono necessari circa 10 mL di HB per mouse.
2. Per l'elaborazione a valle di campioni biologici, ogni campione richiede un tubo conico da 15 mL per contenere l'omogeneità grezzo, un tubo da 15 mL per contenere il supernatante post-nucleare, due tubi di microcentrismo da 1,5 ml per contenere i 3.000 x g e 20.000 x g di pellettura e un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml per contenere la frazione citoplasmica. Aggiungere 7 mL di HB freddo ad ogni tubo destinato all'omogeneità grezza e tenere sul ghiaccio.
3. Preparare una soluzione di stock da 2 mg/mL di emi-solfato di leupeptina in PBS sterile. Preparare anche una soluzione da 50 mg/mL di bortezomib in solfuro dimetilo (DMSO). Aliquota e conservare le soluzioni a -80 gradi centigradi.

3. Amministrazione inibitore della proteasi

1. Soluzioni di scorte di scongelo leupeptina (2 mg/mL) e bortezomib (50 mg/mL) alla temperatura ambiente 15 min prima di ogni punto temporale. Il brodo di leupeptina è pronto per l'iniezione. Diluire il bortezomib in PBS sterile per produrre una soluzione di lavoro di 50 g/mL.
   NOT: Bortezomib è sensibile alla luce, in modo da proteggere il supporto di lavoro dalla luce fino all'uso.
2. Pesare i topi ed eseguire iniezioni intraperitoneali di PBS "sham" (0,5 mL), leupeptina (40 mg/kg), o bortezomib (1,6 g/kg). Riportare i topi in gabbie contrassegnate in modo appropriato raggruppate in base al tipo di iniezione ricevuta. Registrare il tempo in cui i topi vengono trattati o manipolati in una tabella standardizzata (vedere File supplementare "Dati di esempio").
   NOT: Un calcolatore di dose è incluso come aiuto nel file supplementare "Dati di esempio". È importante eseguire iniezioni in modo tempestivo e nello stesso ordine da un momento all'altro per ridurre al minimo la variabilità.

4. Acquisizione e stoccaggio dei tessuti

1. Due ore dopo l'iniezione, eutanasia topi uno alla volta in conformità con il protocollo IACUC approvato istituzionalmente. Ad esempio, anestesizzare i topi poi l'eutanasia dalla lussazione cervicale. Procedere al passo di dissezione subito dopo l'eutanasia.
   NOT: Assicurare l'anestesia completa prima della lussazione cervicale pizzicando le zampe anteriori senza un riflesso osservabile.
2. Rimuovere il lobo sinistro del fegato facendo un'incisione da 1,5 a 2,0 cm con le forbici Metzenbaum sull'addome ventrale del topo. Esterna il lobo sinistro del fegato e accisa con forbici chirurgiche. Immergere il campione di fegato in 7 mL di HB ghiacciato in un tubo conico da 15 mL opportunamente etichettato. Conservare il campione sul ghiaccio per tutta la lavorazione.
   NOT: I campioni possono essere conservati sul ghiaccio o a 4 gradi centigradi durante la notte prima di procedere. Se i marcatori standard di macroautofagia e attività proteasomica sono le uniche letture previste, i campioni di fegato possono essere congelati flash in azoto liquido e conservati a -80 gradi centigradi per una successiva elaborazione. Per esaminare altri obiettivi di degradazione (ad esempio, tramite proteomica), elaborare i campioni senza congelamento.
3. Procedere all'eutanasia e sezionare il topo successivo fino all'acquisizione di tutti i campioni. Elaborare i mouse nello stesso ordine di gruppo in cui sono stati iniettati e registrare la durata di questo passaggio (vedere File supplementare "Dati di esempio"). Ogni topo deve essere lavorato in meno di 5 min per limitare la differenza nei tempi di esposizione per gli inibitori iniettati.

5. Frazione biochimica dei campioni di fegato

NOT: La figura 1B mostra lo schema di frazionamento.

1. Trasferire ogni campione di fegato e 7 mL di HB in un omogeneizzatore di capacità di 15 mL. Omogeneizzare il campione con 10 colpi del pistone sciolto e 15 colpi del pistone stretto. Riportare l'omogenea grezza risultante al tubo conico da 15 mL da cui ha avuto origine. Ripetere fino a quando tutti i campioni di fegato sono stati omogeneizzati.
2. Girare campioni di omogenea grezzi a 700 x g per 10 min a 4 gradi centigradi per pellet nuclei e detriti. Trasferire i primi 4 mL di supernatante post-nucleare (S1) in un nuovo tubo conico da 15 mL.
3. Determinare la concentrazione proteica della frazione S1 utilizzando Bradford o acido bicinchoninico (BCA) secondo le istruzioni del produttore. Successivamente equalizzare le concentrazioni di tutti i campioni a 2,1 mg/mL o alla concentrazione desiderata aggiungendo HB fresco a S1 dove necessario. I campioni normalizzati sono la frazione "Total Protein" (Tot). Per scopi analitici a valle e miglioramento della qualità, 500 L della frazione Tot e conservare a -80 gradi centigradi.
4. Trasferire 1,5 mL della frazione rimanente del Tot in un tubo di microcentrismo e girare a 3.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Trasferire 1 mL del supernabile risultante (S2) in un tubo di microcentrifuga fresco e impostare sul ghiaccio.
5. Aspirare il restante supernatante e lavare il pellet 3.000 x g (3KP) due volte con 1,5 mL di HB freddo. Il pellet da 3KP può essere conservato a secco a -80 gradi centigradi se si prevede una proteomica a valle. Se si prevede solo gonfiore occidentale, risospendere il pellet da 3KP in 200 -L di sodio dodecyl bioacrilmide gel elettroforesi (SDS-PAGE) buffer campione (Tabella dei materiali) e far bollire a 95 gradi centigradi per 5 min.
6. Girare la frazione Di S2 a 20.000 x g per 20 minuti a 4 gradi centigradi. Trasferire il supernatante risultante (S3) in un tubo di microcentrismo fresco. S3 è la frazione citoplasmatica (Cyto). Per SDS-PAGE, unire 150 l di frazione di Cyto con 50 : L di 4x buffer campione SDS-PAGE e far bollire a 95 gradi centigradi per 5 min.
7. Aspirare il restante supernatante dal pellet 20.000 x g (20KP) e lavare due volte con 1,5 mL di HB freddo. Il pellet da 20 KP può essere conservato a secco a -80 gradi centigradi se si prevede una proteomica a valle. Se si prevede solo l'intorpidimento occidentale, risospendere il pellet da 20KP in 100 gradi di buffer campione SDS-PAGE e far bollire a 95 gradi centigradi per 5 min.

6. Lettura di Western Blotting

1. Al fine di quantificare il flusso macroautofagico e proteasomico attraverso il gonfiore occidentale, comporre una soluzione di stock di gST-LC3b purificato (2 g/mL), p62-His₆ (2 g/mL) e Lys⁴⁸ poliubiquitina collegata (K48-Ub, 50 g/mL) in 1x buffer di campione SDS-PAGE. Dopo aver ebollito a 95 gradi centigradi per 5 min, aliquota e conservare a -80 gradi centigradi per un uso futuro.
2. Al momento di SDS-PAGE, generare una curva standard a 6 punti della miscela proteica standard diluindo in serie 1:3 nel buffer di campione 1x SDS-PAGE. Caricate 10 l di ogni campione di curva standard su un 26 pozzetto 4-12% SDS-PAGE midi-gel, seguito da standard proteici prestati (Table of Materials), uno standard commerciale di peso molecolare.
3. Per misurare il flusso autofagico, caricare 12 lecca di 3KP campione in ogni pozzo.
   NOT: Supponendo che siano stati effettuati trattamenti di finzione, bortezomib e leupeptina e supponendo 3 topi per trattamento, ogni punto temporale dovrebbe essere costituito da 9 campioni. Pertanto, ogni midi-gel può ospitare 2 punti temporali più la curva standard e un tipico esperimento di serie temporali richiederà 3 midi-gel per la lettura.
4. Per misurare il flusso proteasomico, caricare 12 l di Cyto frazione in ogni pozzo.
5. Separare i campioni di proteine per SDS-PAGE e trasferirli su membrane di fluoruro di polivinylidene (PVDF) utilizzando protocolli standard. Se si prevede l'umidità occidentale per LC3b, trasferire i gel utilizzando il buffer di trasferimento contenente metanolo al 20%. In caso contrario, utilizzare il buffer di trasferimento contenente metanolo al 10% in quanto ciò consentirà un trasferimento più efficiente di specie proteiche ad alto peso molecolare.
6. Eseguire l'umidità occidentale utilizzando protocolli standard. Per l'analisi del flusso macroautofagico, membrane di macchie contenenti campioni 3KP con anticorpi anti-p62 o anti-LC3b (1:1,000) durante la notte a 4 gradi centigradi. Per l'analisi del flusso proteasomico, membrane macchia contenenti campioni di Cyto con poliubiquitina specifica anti-Lys⁴⁸ (1:1,000) durante la notte a 4 gradi centigradi.
7. Immagini macchie occidentali utilizzando anticorpi secondari standard e dispositivi di imaging. Immagine di tutte le membrane che costituiscono una data serie temporale sperimentano insieme.

7. Analisi dei dati

NOT: Vedere File supplementare "Dati di esempio".

1. Per eseguire densitometria su campioni di macchie occidentali, utilizzare il software grafico standard, Image Studio o in alternativa ImageJ.
2. Eseguire misurazioni densitometriche su bande di interesse sia per la curva standard che per i campioni sperimentali. In Image Studio, usando p62 come esempio, disegna un lungo rettangolo che comprende il monomero proteico nella parte inferiore e si estende fino alla parte superiore della membrana. Copiare, incollare e spostare il rettangolo nei campioni rimanenti. È importante mantenere coerente il rettangolo utilizzato per la quantificazione tra i campioni.
3. Salvare la quantificazione in un foglio di calcolo premendo Report e Avvia foglio di calcolo nella parte inferiore destra della finestra di analisi.
4. Generare una curva standard densitometrica con foglio di calcolo utilizzando il campione standard diluito in serie e utilizzare la regressione lineare o polinomiale per ottenere un'equazione di curva standard ottimale. Utilizzando questa equazione, estrapolare la quantità di p62, LC3b-II o Lys⁴⁸-poly Ub nei campioni sperimentali.
5. Per ottenere le misurazioni del flusso, sottrarre la quantità di proteine estrapolata di ciascun campione trattato con inibitori dal valore medio dei campioni PBS dallo stesso punto temporale (vedere il file supplementare "Dati campione").
6. Valutare la rilevanza statistica della variazione temporale nel turnover delle proteine utilizzando ANOVA a 1 vie. Questo può essere fatto utilizzando il software di foglio di calcolo standard.

Risultati

I dati rappresentativi sono presentati nella Figura 2A,Be la quantificazione di questi dati sono forniti nella Figura 2C,D (vedere anche il file supplementare "Dati di esempio"). Per semplicità, non è stato descritto il caricamento di controlli in Figura 2, ma questi devono essere ottenuti in parallelo. Tipicamente, le macchie occidentali contro l'atto di z-actin sono utilizzate p...

Discussione

Il nostro protocollo descrive un mezzo tecnicamente semplice per misurare i ritmi biologici nel turnover delle proteine nei topi utilizzando attrezzature di biologia molecolare comunemente disponibili. A causa della durata degli esperimenti di serie temporali e del numero di campioni biologici coinvolti, è importante essere coerenti nell'intero esperimento per quanto riguarda l'iniettazione dei topi, i tempi di acquisizione dei tessuti e l'elaborazione biochimica di Campioni. Le fasi di iniezione, eutanasia e dislocazio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x SDS PAGE Sample Buffer	Invitrogen	Cat# NP0008
Bortezomib	EMD Millipore	Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7
Image Studio	LICOR	N/A
Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron	Merck Millipore Ltd	Cat# IPFL00010
K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	Cat#8081S; RRID:AB_10859893
LC3a	Boston Biochem	Cat# UL-430
LC3b antibody	Novus	Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146
LC3b antibody	Cell Signaling Technology	Cat#2775; RRID:AB_915950
Leupeptin	Sigma	Cat# L2884; CAS: 103476-89-7
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	Cat# WG1403BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Fisher Scientific	Cat# NP0007
P62-his	Novus	Cat# NBP1-44490
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards	Bio-Rad	Cat# 1610373
Rabbit Anti-p62/SQSTM1	Millipore-Sigma	Cat#P0067; RRID:AB_1841064
rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)	Boston Biochem	Cat# UC-230
SDS-PAGE Midi-size Gels	Invitrogen	Cat# WG1403
SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets	Millipore-Sigma	Cat# S8830