Medición de ritmos diurnos en flujo autofésico y proteasomal

Resumen

Describimos nuestro protocolo para medir los ritmos biológicos en el catabolismo proteico a través de la autofagia y el proteosoma en el hígado de ratón.

Resumen

Las células emplean varios métodos para reciclar proteínas no deseadas y otros materiales, incluyendo vías lisosomal y no lisosomal. La vía principal dependiente del lisosoma se llama autofagia, mientras que el método principal no lisosomal para el catabolismo proteico es el sistema ubiquitina-proteosoma. Estudios recientes en organismos modelo sugieren que la actividad de la autofagia y el sistema ubiquitina-proteasoma no es constante a lo largo del día, sino que varía según un ritmo diario (circadiano). La capacidad de medir los ritmos biológicos en la rotación de proteínas es importante para entender cómo se logra el control de calidad celular y para entender la dinámica de proteínas específicas de interés. Aquí presentamos un protocolo estandarizado para cuantificar el flujo autofágico y proteasomal in vivo que captura el componente circadiano de la rotación de proteínas. Nuestro protocolo incluye detalles para el manejo del ratón, procesamiento de tejidos, fraccionamiento y cuantificación de flujo autofágico utilizando el hígado del ratón como material de partida.

Introducción

Los ritmos circadianos se refieren a variaciones diarias y predecibles en la función biológica que son evidentes en toda la naturaleza. Existen a todas las escalas biológicas, desde comportamientos macroscópicos como ciclos sueño-vigilia, hasta fenómenos moleculares como la abundancia rítmica de biomoléculas. En los últimos años, la investigación sobre los ritmos circadianos se ha transformado por el descubrimiento de "genes de reloj" que son críticos para la generación del ritmo circadiano. Los estudios en ratones knockout del gen del reloj han revelado un papel central para los ritmos circadianos en la organización temporal de los procesos celulares centrales como el metabolismo¹. Entre las formas en que los ritmos circadianos hacen que esto suceda es impartir una estructura temporal al catabolismo proteico.

Varios grupos incluyendo el nuestro han demostrado que las dos principales vías para el catabolismo proteico celular, la autofagia y el sistema ubiquitina-proteasoma, están sujetas a ritmos diurnos^2,3,4,5. La autofagia representa el brazo lisososodependiente del catabolismo proteico en el que las proteínas de interés se entregan a este orgánulo degradante ya sea a través de la construcción de una vesícula novedosa (macroautofagia) o a través de una translocación directa a través de una canal (autofagia mediada por chaperón)⁶. El sistema ubiquitina-proteasoma es la principal vía no lisosomal, donde las proteínas son poliubiquitinadas y luego se alimentan en el proteosoma, una máquina degradante macromolecular que se encuentra en todo el citoplasma y el núcleo^7,8. Los ritmos en la actividad autofágica y proteasomal son importantes porque probablemente juegan un papel en la limpieza celular. Como resultado, es valioso tener un procedimiento estandarizado que pueda detectar oscilaciones diarias en el catabolismo proteico que es compatible con modelos de enfermedad preclínica.

Aquí, proporcionamos nuestro protocolo para cuantificar las variaciones diurnas en el flujo autofágico en el hígado de ratón, que ha servido de base para el trabajo en nuestro laboratorio^3,9. Nuestro método se clasifica como un "ensayo de volumen de negocios"^10,un enfoque utilizado por numerosos grupos para medir la actividad proteolítica (o flujo). En este enfoque, los inhibidores de la proteasa específicos de los lisosomas o proteasomas se administran a ratones y luego se obtienen muestras de tejido después de un intervalo de tiempo fijo. Paralelamente, las muestras de tejido se obtienen de ratones sometidos a inyecciones falsas. Las muestras de tejido se homogeneizan y luego se separan bioquímicamente para obtener las fracciones lisosomas y citoplasmáticas. Estas fracciones se analizan en paralelo a través de la hincha occidental utilizando anticuerpos específicos de los marcadores de macroautofagia (LC3b y p62) o sustratos proteasomales (proteína poliubiquitinada). Con el tiempo, los animales inyectados con inhibidores de la proteasa acumulan proteínas que normalmente se habrían reciclado. Como resultado, la tasa de rotación se deduce comparando la abundancia de proteínas marcadoras en las muestras tratadas con inhibidores de la proteasa con las muestras tratadas con farsa. Al repetir este método a intervalos de tiempo fijos a lo largo del día es posible reconstruir variaciones circadianas en la proteólisis(Figura 1A).

Protocolo

El protocolo descrito aquí fue aprobado por la Universidad de Washington en st. Louis Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Carcasa de ratón y diseño experimental

1. Para detectar ritmos diarios en la rotación de proteínas, ratones domésticos (masculino o femenino C57BL/6J, de 4 a 8 semanas de edad, 20 a 25 g) bajo ciclos estándar de 12 h de luz/oscuridad con alimentos proporcionados ad libitum. Para evitar estresar a los animales, aclimate ratones durante al menos una semana en la instalación antes de usar y evite una sola vivienda. Para demostrar que los ritmos en el catabolismo proteico son verdaderamente circadianos (es decir, impulsados por el reloj biológico interno del animal), los ratones domésticos en condiciones constantes y oscuras, teniendo cuidado de evitar exponer a los ratones a la luz exógena.
   NOTA: Para obtener más información sobre la carcasa del ratón para experimentos de ritmo circadiano, consulte la siguiente referencia¹¹.
2. Para cada punto de tiempo, asigne tres ratones como controles falsos y al menos tres ratones para cada tipo de inhibidor de la proteasa utilizado (leupeptina para flujo autofágico y bortezomib para mediciones de flujo proteasomal). Planifique seis puntos de tiempo espaciados uniformemente a intervalos de 4 h a lo largo del ciclo día/noche para obtener muestras de tejido.
   NOTA: Un experimento de 24 h y 6 puntos de tiempo con solución salina con fosfato (PBS), leupeptina y bortezomib requerirá un total de 54 ratones (3 por tratamiento x 3 tratamientos x 6 puntos de tiempo).

2. Preparación de la solución de homogeneización, soluciones de stock de inhibidores y viales para la recolección de hígados de ratón

1. Preparar el tampón de homogeneización fresco (HB) y mantener en hielo: 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM sacarosa, 5 mM EDTA pH 8.0, y 1 comprimido inhibidor de proteasa por 100 mL.
   NOTA: Se necesitan aproximadamente 10 ml de HB por ratón.
2. Para el procesamiento aguas abajo de muestras biológicas, cada muestra requiere un tubo cónico de 15 ml para sostener el homogeneato crudo, un tubo de 15 ml para sostener el sobrenadante post-nuclear, dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para sostener los 3.000 x g y 20.000 x g de peletización material, respectivamente, y un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para sostener la fracción citoplasmática. Añadir 7 ml de HB frío a cada tubo destinado a homogeneizar crudo y mantener en hielo.
3. Preparar una solución de 2 mg/ml de hemisulfato de leupeptina en PBS estéril. También preparar una solución de 50 mg/ml de bortezomib en dimetil sulfóxido (DMSO). Aliquot y almacenar las soluciones a -80 oC.

3. Administración de inhibidores de la proteasa

1. Descongelar las soluciones de stock de leupeptina (2 mg/ml) y bortezomib (50 mg/ml) a temperatura ambiente 15 minutos antes de cada punto de tiempo. El caldo de leupeptina está listo para la inyección. Diluir el bortezomib en PBS estéril para producir una solución de trabajo de 50 g/ml.
   NOTA: Bortezomib es sensible a la luz, así que proteja el material de trabajo de la luz hasta su uso.
2. Pesar ratones y realizar inyecciones intraperitoneales de PBS "sham" (0,5 ml), leupeptina (40 mg/kg) o bortezomib (1,6 g/kg). Devolver los ratones a jaulas debidamente marcadas agrupadas por el tipo de inyección que recibieron. Registre la hora en que los ratones son tratados o manipulados en una tabla estandarizada (consulte Archivo suplementario " Datosde muestra").
   NOTA: Una calculadora de dosis se incluye como una ayuda en el archivo suplementario "Datosde muestra" . Es importante realizar inyecciones rápidamente y en el mismo orden desde el punto de tiempo hasta el punto de tiempo para minimizar la variabilidad.

4. Adquisición y almacenamiento de tejidos

1. Dos horas después de la inyección, eutanasia a los ratones de uno en uno de acuerdo con el protocolo IACUC aprobado institucionalmente. Por ejemplo, los ratones anestetizan luego etanizan por dislocación cervical. Continúe con el paso de disección inmediatamente después de la eutanasia.
   NOTA: Asegurar la anestesia completa antes de la luxación cervical pellizcando las patas delanteras sin un reflejo observable.
2. Retire el lóbulo izquierdo del hígado haciendo una incisión de 1,5 a 2,0 cm con tijeras Metzenbaum en el abdomen ventral del ratón. Externalizar el lóbulo izquierdo del hígado e extirparlo con tijeras quirúrgicas. Sumerja la muestra hepática en 7 ml de HB helada en un tubo cónico de 15 ml debidamente etiquetado. Mantenga la muestra en hielo durante todo el procesamiento.
   NOTA: Las muestras se pueden mantener en hielo o a 4 oC durante la noche antes de proceder. Si los marcadores estándar de macroautofagia y actividad proteasomal son las únicas lecturas previstas, las muestras de hígado pueden congelarse en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 oC para su posterior procesamiento. Para examinar otros objetivos de degradación (por ejemplo, a través de proteómica), procese las muestras sin congelarlas.
3. Proceda a eutanasiay y diseccione el ratón siguiente hasta que se adquieran todas las muestras. Procesar ratones en el mismo orden de grupo que se inyectaron y registrar la duración de este paso (consulte Archivo suplementario "Datos de muestra"). Cada ratón debe procesarse en menos de 5 minutos para limitar la diferencia en los tiempos de exposición de los inhibidores inyectados.

5. Fraccionamiento bioquímico de muestras de hígado

NOTA: La Figura 1B muestra el esquema de fraccionamiento.

1. Transfiera cada muestra de hígado y 7 ml de HB a un homogeneizador Dounce de 15 ml de capacidad. Homogeneizar la muestra con 10 golpes del pistón suelto y 15 golpes del pistón apretado. Devolver el homogeneizador crudo resultante al tubo cónico de 15 ml del que se originó. Repita hasta que todas las muestras de hígado hayan sido homogeneizadas.
2. Espíre muestras de homogeneización bruta a 700 x g durante 10 min a 4 oC a núcleos de pellets y escombros. Transfiera los 4 ml superiores del sobrenadante postnuclear (S1) a un tubo cónico fresco de 15 ml.
3. Determinar la concentración de proteína de la fracción S1 utilizando ensayos de Bradford o ácido bicinchínico (BCA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, igualar las concentraciones de todas las muestras a 2,1 mg/ml o a la concentración deseada añadiendo HB fresco a S1 cuando sea necesario. Las muestras normalizadas son la fracción "Proteína total" (Tot). Para fines analíticos posteriores y mejora de la calidad, alícuota 500 l de la fracción Tot y almacenar a -80 oC.
4. Transfiera 1,5 ml de la fracción Tot restante a un tubo de microcentrífuga y gire a 3.000 x g durante 15 min a 4 oC. Transfiera 1 ml del sobrenadante resultante (S2) a un tubo de microcentrífuga fresco y poner sobre hielo.
5. Aspirar el sobrenadante restante y lavar el pellet de 3.000 x g (3KP) dos veces con 1,5 ml de HB fría. El pellet de 3KP se puede almacenar seco a -80 oC si se prevé una proteómica aguas abajo. Si sólo se prevé la hincha occidental, resuspenda el pellet de 3KP en 200 ml de electroforesis de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de 3KP en 200 ml de dodecyl sulfato de sodio poliacrilamida (SDS-PAGE) tampón de muestra(Tabla de materiales)y hierva a 95 oC durante 5 min.
6. Gire la fracción S2 a 20.000 x g durante 20 min a 4 oC. Transfiera el sobrenadante resultante (S3) a un tubo de microcentrífuga fresco. S3 es la fracción citoplasmática (Cyto). Para SDS-PAGE, combine 150 éL de fracción de Cito con 50 ml de tampón de muestra De 4 x SDS-PAGE y hierva a 95 oC durante 5 min.
7. Aspirar el sobrenadante restante del pellet de 20.000 x g (20KP) y lavar dos veces con 1,5 ml de HB fría. El pellet de 20KP se puede almacenar seco a -80 oC si se prevé una proteómica aguas abajo. Si sólo se prevé la hincha occidental, resuspenda el pellet de 20KP en 100 ml de tampón de muestra SDS-PAGE y hierva a 95 oC durante 5 min.

6. Lectura de Western Blotting

1. Con el fin de cuantificar el flujo macroautofágico y proteasomal a través de la hincha occidental, componer una solución en stock de GST-LC3b purificado (2 g/mL), p62-Su₆ (2 g/ml) y Lys⁴⁸ poliubiquitina vinculada (K48-Ub, 50 g/mL) en 1 búfer de muestra SDS-PAGE. Después de hervir a 95oC durante 5 min, alícuota y conservar a -80oC para uso futuro.
2. En el momento de SDS-PAGE, genere una curva estándar de 6 puntos de la mezcla de proteínas estándar diluyendo en serie 1:3 en 1 búfer de muestra SDS-PAGE. Cargue 10 l de cada muestra de curva estándar en un midi-gel de 26 pozos 4-12% SDS-PAGE, seguido de los estándares de proteína sensibilizado(Tabla de materiales),un estándar de peso molecular comercial.
3. Para medir el flujo autofágico, cargue 12 ml de muestra de 3KP en cada poca.
   NOTA: Suponiendo que se realizaran tratamientos de farsa, bortezomib y leupeptina y suponiendo 3 ratones por tratamiento, cada punto de tiempo debe consistir en 9 muestras. Por lo tanto, cada midi-gel puede acomodar 2 puntos de tiempo más la curva estándar y un experimento típico de series temporales requerirá 3 midi-gels para la lectura.
4. Para medir el flujo proteasomal, cargue 12 ml de fracción de cito en cada pocal.
5. Separe las muestras de proteínas por SDS-PAGE y transfiera a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando protocolos estándar. Si se prevé la hincha occidental de LC3b, transfiera geles con un búfer de transferencia que contenga metanol al 20%. De lo contrario, utilice un búfer de transferencia que contenga 10% de metanol, ya que esto permitirá una transferencia más eficiente de especies de proteínas de alto peso molecular.
6. Realice la hincha occidental utilizando protocolos estándar. Para analizar el flujo macroautofofagico, las membranas de la mancha que contienen muestras de 3KP con anticuerpos anti-p62 o anti-LC3b (1:1,000) durante la noche a 4 oC. Para analizar el flujo proteasomal, las membranas manchadas que contienen muestras de Cito con poliubiquitina específica anti-Lys⁴⁸ (1:1.000) durante la noche a 4oC.
7. Imágenes occidentales utilizando anticuerpos secundarios estándar y dispositivos de imagen. Imagen de todas las membranas que constituyen un experimento de serie temporal determinado juntos.

7. Análisis de datos

NOTA: Consulte Archivo suplementario "Datos de muestra".

1. Para realizar densitometría en muestras de manchas occidentales, utilice el software de gráficosestándar, Image Studio o, alternativamente, ImageJ.
2. Realice mediciones densitométricas en bandas de interés tanto para la curva estándar como para las muestras experimentales. En Image Studio, usando p62 como ejemplo, dibuje un rectángulo largo que abarque el monómero de proteínas en la parte inferior y se extienda hasta la parte superior de la membrana. Copie, pegue y mueva el rectángulo a las muestras restantes. Es importante mantener el rectángulo utilizado para la cuantificación coherente entre muestras.
3. Guarde la cuantificación en una hoja de cálculo presionando Informe e inicio de hoja de cálculo en la parte inferior derecha de la ventana de análisis.
4. Genere una curva estándar densitométrica con hoja de cálculo utilizando la muestra estándar diluida en serie y utilice la regresión lineal o polinómica para obtener una ecuación de curva estándar de mejor ajuste. Usando esta ecuación, extrapolar la cantidad de p62, LC3b-II o Lys⁴⁸-poly Ub en las muestras experimentales.
5. Para obtener mediciones de flujo, reste la cantidad de proteína extrapolada de cada muestra tratada con inhibidores del valor medio de las muestras de PBS desde el mismo punto de tiempo (consulte Archivo suplementario "Datosde muestra" ).
6. Evaluar la importancia estadística de la variación temporal en la rotación de proteínas utilizando ANOVA de 1 vía. Esto se puede hacer usando el software de hoja de cálculo estándar.

Resultados

Los datos representativos se presentan en la Figura 2A,B, y la cuantificación de estos datos se proporciona en la Figura 2C,D (véase también Archivo Suplementario "Datosde muestra" ). Para simplificar, no hemos representado los controles de carga en la Figura 2, pero estos deben obtenerse en paralelo. Típicamente, las manchas occidentales contra la actina se utilizan para este p...

Discusión

Nuestro protocolo describe un medio técnicamente sencillo de medir los ritmos biológicos en la rotación de proteínas en ratones utilizando equipos de biología molecular comúnmente disponibles. Debido a la duración de los experimentos de series temporales y el número de muestras biológicas involucradas, es importante ser consistente en todo el experimento con respecto a cómo se inyectan los ratones, el momento de la adquisición de tejidos y el procesamiento bioquímico de Muestras. Las etapas de inyección, eut...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x SDS PAGE Sample Buffer	Invitrogen	Cat# NP0008
Bortezomib	EMD Millipore	Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7
Image Studio	LICOR	N/A
Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron	Merck Millipore Ltd	Cat# IPFL00010
K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	Cat#8081S; RRID:AB_10859893
LC3a	Boston Biochem	Cat# UL-430
LC3b antibody	Novus	Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146
LC3b antibody	Cell Signaling Technology	Cat#2775; RRID:AB_915950
Leupeptin	Sigma	Cat# L2884; CAS: 103476-89-7
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	Cat# WG1403BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Fisher Scientific	Cat# NP0007
P62-his	Novus	Cat# NBP1-44490
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards	Bio-Rad	Cat# 1610373
Rabbit Anti-p62/SQSTM1	Millipore-Sigma	Cat#P0067; RRID:AB_1841064
rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)	Boston Biochem	Cat# UC-230
SDS-PAGE Midi-size Gels	Invitrogen	Cat# WG1403
SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets	Millipore-Sigma	Cat# S8830