자동 및 프로테아소말 플럭스에서 일주 리듬 측정

요약

우리는 autophagy및 마우스 간에서 proteasome를 통해 단백질 이화 작용에 있는 생물학 리듬을 측정하기 위한 우리의 프로토콜을 기술합니다.

초록

세포는 리소좀 및 비 리소좀 경로를 포함하여 원치 않는 단백질 및 기타 물질을 재활용하는 여러 가지 방법을 사용합니다. 주요 리소좀 의존적 통로는 autophagy에게 불리고, 단백질 이화작용에 대한 1 차적인 비 리소좀 방법은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템입니다. 모형 유기체에 있는 최근 연구 결과는 autophagy와 유비퀴틴 proteasome 시스템의 활동이 하루 에 걸쳐 일정하지 않다는 것을 건의합니다 그러나 대신 매일 (circadian) 리듬에 따라 변화합니다. 단백질 회전율에 있는 생물학 리듬을 측정하는 기능은 세포 질 통제가 어떻게 달성되는지 이해하고 관심 있는 특정 단백질의 역학을 이해하기 를 위해 중요합니다. 여기에서 우리는 단백질 회전율의 circadian 분대를 붙잡는 생체 내 자동 파기 및 proteasomal 플럭스를 정량화하기 위한 표준화된 프로토콜을 제시합니다. 당사의 프로토콜에는 마우스 처리, 조직 처리, 분획 및 마우스 간을 원료로 사용하는 자가 유속 정량화에 대한 세부 정보가 포함됩니다.

서문

Circadian 리듬은 자연 전체에 걸쳐 명백한 생물학적 기능에 있는 매일, 예측 가능한 변이를 참조합니다. 그(것)들은 모든 생물학 규모에서, 잠 각성 주기 같이 거시적인 행동에서, 생체 분자의 리듬 풍부 같이 분자 현상에, 존재합니다. 최근 몇 년 동안, circadian 리듬에 대 한 연구는 circadian 리듬 생성에 대 한 중요 한 "시계 유전자"의 발견에 의해 변환 되었습니다. 시계 유전자 녹아웃 마우스에 있는 연구 결과는 물질 대사와 같은 핵심 세포 프로세스를 시간적으로 조직하는 circadian 리듬을 위한 중앙 역할을 밝혔습니다^1. circadian 리듬이 이것을 일어나는 방법 중 단백질 이화작용에 시간구조를 부여하여입니다.

당사를 포함한 여러 그룹은 세포 단백질 이화작용, 자가포식 및 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 위한 두 가지 주요 경로가 일주 리듬^2,3,4,5의영향을 받는다는 것을 보여주었습니다. Autophagy는 관심있는 단백질이 열화 세포기관에 전달되는 단백질 이화 작용의 리소좀 의존팔을 나타내며, 이는 새로운 소포(macroautophagy)의 시공을 통해 또는 직접적인 전좌를 통해 전달됩니다. 채널 (샤페론 중재 autophagy)^6. 유비퀴틴-프로테아좀 시스템은 단백질이 폴리-유비퀴틴화되고 프로테아솜으로 공급되는 주요 비리소솜 통로이며, 세포질과 핵^7,8에서발견되는 거대 분자 분해 기계이다. 자동 및 프로테아소말 활동의 리듬은 세포 하우스키핑에 중요한 역할을 할 가능성이 있기 때문입니다. 그 결과, 전임상 질환 모델과 호환되는 단백질 이화작용의 일일 진동을 감지할 수 있는 표준화된 절차를 하는 것이 중요합니다.

여기에서, 우리는 우리의 실험실^3,9에서일의 기초로 봉사한 마우스 간에서 autophagic 유속에 있는 일변을 정량화하기 위한 우리의 프로토콜을 제공합니다. 우리의 방법은 "회전율 분석"^10,프로테오리틱 활성(또는 플럭스)을 측정하기 위해 수많은 그룹에서 사용하는 접근법으로 분류된다. 이러한 접근법에서, 리소좀 또는 프로테아좀에 특이적인 프로테아제 억제제는 마우스에 투여되고 그 후 조직 샘플은 고정된 시간 간격 후에 수득된다. 병렬로, 조직 샘플은 가짜 주사를 행한 마우스로부터 수득된다. 조직 샘플은 균질화한 다음 생화학적으로 분리되어 리소좀이 농축되고 세포질 분획을 수득합니다. 이 분획은 그 때 macroautophagy 마커 (LC3b 및 p62) 또는 proteasomal 기질 (poly-ubiquitated 단백질)에 특이적인 항체를 사용하여 서쪽 blotting를 통해 병렬로 분석됩니다. 시간이 지남에 따라 프로테아제 억제제가 주입된 동물은 일반적으로 재활용되었을 단백질을 축적합니다. 그 결과, 프로테아제 억제제 처리 된 샘플에서 마커 단백질의 풍부를 샴 처리 샘플과 비교하여 회전율의 비율을 추론합니다. 하루 에 걸쳐 고정 된 시간 간격으로이 방법을 반복함으로써 프로테오 리시스(그림 1A)에서circadian 변이를 재구성 할 수 있습니다.

프로토콜

여기에 설명된 프로토콜은 세인트 루이스 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 워싱턴 대학에 의해 승인되었습니다.

1. 마우스 하우징 및 실험 설계

1. 단백질 회전율에서 매일 리듬을 검출하기 위해, 집 마우스 (남성 또는 여성 C57BL / 6J, 4−8 주, 20-25 g) 표준 에서 12 시간 빛 / 어두운 주기 음식 제공 광고 리비텀. 동물에게 스트레스를 주는 것을 피하기 위해, 사용하기 전에 시설에서 적어도 1 주일 동안 마우스를 적응시키고 단일 하우징을 피하십시오. 단백질 이화작용의 리듬이 진정으로 circadian (즉, 동물의 내부 생물학적 시계에 의해 구동됨)임을 증명하기 위해 일정한 어두운 조건하에서 쥐를 외인성 빛에 노출시키는 것을 피하십시오.
   참고: circadian 리듬 실험을 위한 마우스 하우징에 대한 자세한 내용은 다음 참조^11을참조하십시오.
2. 각 시점마다, 3개의 마우스를 가짜 대조군으로 할당하고 사용된 각 유형의 프로테아제 억제제에 대해 적어도 3개의 마우스를 할당한다(프로테소액 플럭스 측정을 위한 자가파장 플럭스 및 보르테조미브에 대한 류페프틴). 조직 샘플을 얻기 위해 주간/야간 주기에 걸쳐 4시간 간격으로 균등하게 간격을 두는 6개의 시점을 계획합니다.
   참고: 인산완충식염수(PBS), 류펜틴 및 보르테조미브를 가진 24시간, 6시간 실험은 총 54개의 마우스를 필요로 한다(3회 치료 당 3회 처리 x 6시간 점).

2. 균질화 용액, 억제제 재고 용액 및 마우스 간 수집용 바이알 준비

1. 신선한 균질화 완충제(HB)를 준비하고 얼음위에 보관하십시오: 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM 자당, 5 mM EDTA pH 8.0, 및 100 mL당 1프로테아제 억제제 정제.
   참고: 마우스당 약 10mL의 HB가 필요합니다.
2. 생물학적 샘플의 다운스트림 처리를 위해 각 샘플은 15 mL 원엽 튜브가 원유 균질화를 보유하도록, 15 mL 튜브는 핵 후 상층부를 보유하고, 2개의 1.5 mL 미세원심지 튜브를 3,000 x g 및 20,000 x g 펠릿을 보유해야 합니다. 각각 세포질 분획을 보유하는 1.5 mL 마이크로원심분리튜브를 담는다. 조잡한 균질화를 위해 각 튜브에 7 mL의 차가운 HB를 추가하고 얼음을 유지하십시오.
3. 멸균 된 PBS에서 leupeptin 헤미 황산염의 2 mg / mL 재고 용액을 준비하십시오. 또한 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에서 보르테조미브의 50 mg/mL 용액을 준비합니다. Aliquot및 -80 °C에서 솔루션을 저장합니다.

3. 프로테아제 억제제 투여

1. 각 시점 15분 전에 실온으로 타우페프틴(2 mg/mL) 및 보르테조미브(50 mg/mL) 스톡 솔루션을 녹입니다. leupeptin 주식은 주입을 위한 준비되었습니다. 보르테조미브를 멸균 PBS로 희석하여 50 μg/mL 작동 용액을 생성합니다.
   참고: 보르테조미브는 가볍고 민감하므로, 사용 전까지 는 가볍지 않도록 재고를 보호하십시오.
2. 마우스를 계량하고 "sham" PBS (0.5 mL), 류업틴 (40 mg/kg), 또는 보르테조미브 (1.6 μg/kg)의 복강 내 주사를 수행합니다. 마우스를 받은 주사의 종류에 따라 적절히 표시된 케이지로 되돌아갑니다. 표준화된 테이블에서 마우스를 처리하거나 조작하는 시간을 기록합니다(보충 파일 " 샘플 데이터"참조).
   참고: 용량 계산기는 보충 파일 "샘플 데이터"에보조로 포함되어 있습니다. 가변성을 최소화하기 위해 시간대에서 시점까지 동일한 순서로 신속하게 주사를 수행하는 것이 중요합니다.

4. 조직 취득 및 저장

1. 주사 후 2시간, 기관적으로 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 마우스를 한 번에 하나씩 안락사시한다. 예를 들면, 마우스를 마취한 다음 자궁 경부 탈구에 의해 안락사시. 안락사 직후 해부 단계로 진행한다.
   참고: 관찰 가능한 반사없이 앞발을 꼬집어 자궁 경부 탈구 전에 완전한 마취를 하십시오.
2. 마우스의 복부 복부에 Metzenbaum 가위로 1.5 에서 2.0 cm 절개를 함으로써 간 왼쪽 엽을 제거합니다. 간 왼쪽 엽을 외부화하고 수술 용 가위로 절제하십시오. 적당하게 표지된 15 mL 원추형 튜브에 7 mL의 얼음 차가운 HB에 간 샘플을 담급금. 처리 전반에 걸쳐 샘플을 얼음위에 보관하십시오.
   참고: 시료는 진행하기 전에 얼음 또는 4°C에서 하룻밤 동안 보관될 수 있다. 대식세포 및 프로테아소말 활성의 표준 마커가 유일한 의도된 판독인 경우, 간 샘플은 액체 질소로 플래시 냉동되고 나중에 처리를 위해 -80°C에서 저장될 수 있습니다. 저하의 다른 대상을 검사하려면 (예 : 프로테오믹스를 통해), 동결없이 샘플을 처리합니다.
3. 모든 샘플이 획득 될 때까지 안락사하고 다음 마우스를 해부진행합니다. 마우스를 주입된 동일한 그룹 순서로 처리하고 이 단계의 기간을 기록합니다(보충 파일 "샘플 데이터"참조). 각 마우스는 주입된 억제제에 대한 노출 시간차이를 제한하기 위해 5분 미만으로 처리되어야 한다.

5. 간 샘플의 생화확적인 분획

참고: 도 1B는 분획 체계를 나타낸다.

1. 각 간 샘플과 HB의 7 mL을 15 mL 용량Dounce 균질화로 옮김을 전달합니다. 느슨한 피스톤 10 스트로크와 단단한 피스톤 15 스트로크로 샘플을 균질화하십시오. 유래된 원유 균질계를 유래한 15 mL 원뿔형 튜브로 되돌릴 수 있습니다. 모든 간 샘플이 균질화될 때까지 반복합니다.
2. 700 x g에서 4 °C에서 10 분 동안 700 x g에서 펠릿 핵및 파편으로 조질 균질 샘플을 회전시다. 핵 후 상층부(S1)의 상위4mL를 신선한 15 mL 원엽 튜브로 옮니다.
3. 제조업체의 지침에 따라 브래드포드 또는 비신코닌산(BCA) 측정을 사용하여 분획 S1의 단백질 농도를 결정합니다. 다음으로 모든 시료의 농도를 2.1 mg/mL로 균등화하거나 필요한 경우 S1에 신선한 HB를 추가하여 원하는 농도로 균등화합니다. 정규화된 시료는 "총단백질"(Tot)분율입니다. 다운스트림 분석 목적 및 품질 개선을 위해, 토트 분획의 500 μL을 aliquot하고 -80 °C에 보관하십시오.
4. 남은 토트 분획의 1.5 mL를 마이크로 원심 분리튜브로 옮기고 4°C에서 15분 동안 3,000 x g에서 회전시다. 결과 상급체(S2)의 1mL을 신선한 미세원심지 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다.
5. 남은 상판을 흡인하고 3,000 x g 펠릿(3KP)을1.5 mL의 차가운 HB로 두 번 세척합니다. 3KP 펠릿은 하류 프로테오믹스가 예상되는 경우 -80°C에서 건조하게 보관할 수 있습니다. 서쪽 블로팅만 예상되는 경우, 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동증(SDS-PAGE) 샘플 버퍼(SDS-PAGE) 샘플버퍼(재료 표)의200 μL에서 3KP 펠릿을 다시 중단하고 95°C에서 5분간 끓입니다.
6. S2 분획을 20,000 x g에서 4°C에서 20분 동안 회전시다. 결과상급체(S3)를신선한 미세원원지 튜브로 옮니다. S3는 세포질(Cyto)분율이다. SDS-PAGE의 경우, 사이토 분획 150 μL과 4x SDS-PAGE 샘플 버퍼 의 50 μL을 결합하고 95 °C에서 5 분 동안 끓입니다.
7. 20,000 x g 펠릿(20KP)에서남은 상구체를 흡인하고 1.5 mL의 차가운 HB로 두 번 씻는다. 20KP 펠릿은 하류 프로테오믹스가 예상되는 경우 -80°C에서 건조하게 보관할 수 있습니다. 서쪽 블로팅만 예상되는 경우, SDS-PAGE 샘플 버퍼의 100 μL에서 20KP 펠릿을 다시 일시 중단하고 95°C에서 5분 동안 끓입니다.

6. 웨스턴 블로팅 판독

1. 서쪽 블로팅을 통해 거대 토파기 및 프로테소좀 플럭스를 정량화하기 위해 정제된 GST-LC3b(2 μg/mL), p62-His₆₍₂ μg/mL), Lys⁴⁸ 연결된 폴리유비퀴틴(K48-Ub, 50 μg/mL)의 스톡 솔루션을 1x SDS-PAGE 버퍼에 작성합니다. 95°C에서 5분간 끓인 후, 향후 사용을 위해 -80°C에서 aliquot및 보관하십시오.
2. SDS-PAGE 시, 1x SDS-PAGE 샘플 버퍼에서 1:3을 직렬로 희석하여 표준 단백질 혼합물의 6포인트 표준 곡선을 생성한다. 각 표준 곡선 샘플의 10 μL을 26 웰 4-12% SDS-PAGE 미디 겔에 적재하고, 그 다음에 상업용 분자량 표준인 스테인드 단백질표준(재료 표)을따릅니다.
3. 자가 파기 플럭스를 측정하기 위해 3KP 샘플 12 μL을 각 우물에 적재하십시오.
   참고: sham, bortezomib 및 leupeptin 처리가 행해진 가정하고 처리 당 3 마우스를 가정하고, 각 시점은 9개의 견본으로 이루어져야 합니다. 따라서 각 미디 겔은 2개의 타임 포인트와 표준 곡선을 수용할 수 있으며 일반적인 타임시리즈 실험에는 판독을 위해 3개의 미디 겔이 필요합니다.
4. 프로테소말 플럭스를 측정하려면 12 μL의 사이토 분획을 각 웰에 적재하십시오.
5. SDS-PAGE로 단백질 샘플을 분리하고 표준 프로토콜을 사용하여 폴리비닐리덴 불소(PVDF) 멤브레인으로 옮김. LC3b에 대한 웨스턴 블로팅이 예상되는 경우, 20% 메탄올 함유 전사 완충액을 사용하여 겔을 전사한다. 그렇지 않으면, 10% 메탄올 함유 전사 완충액을 사용하여 고분자량 단백질 종의 보다 효율적인 전달을 가능하게 한다.
6. 표준 프로토콜을 사용하여 서부 블로팅을 수행합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 항-p62 또는 반대로 LC3b 항체 (1:1,000)를 가진 3KP 견본을 포함하는 macroautophagic 플럭스를 분석하기 위해. 프로테소말 플럭스를 분석하기 위해, 4°C에서 밤새 안티 리스⁴⁸ 특정 폴리유비퀴틴(1:1,000)을 함유한 Cyto 샘플을 함유하는 블롯 멤브레인.
7. 표준 이차 항체 및 화상 진찰 장치를 사용하여 이미지 서쪽 얼룩. 주어진 타임시리즈 실험을 구성하는 모든 멤브레인을 함께 이미지화합니다.

7. 데이터 분석

참고: 추가 파일 "샘플 데이터"를참조하십시오.

1. 웨스턴 블롯 샘플에서 밀도 측정을 수행하려면 표준 그래픽소프트웨어, 이미지 스튜디오 또는 ImageJ를 사용합니다.
2. 표준 곡선과 실험 샘플 모두에 대해 관심 있는 대역에서 밀도 측정을 수행합니다. 이미지 스튜디오에서, 예를 들어 p62를 사용하여, 하단에 단백질 단량체를 포괄하고 멤브레인의 상단까지 연장하는 긴 직사각형을 그립니다. 사각형을 복사, 붙여넣기 및 나머지 샘플로 이동합니다. 샘플 간에 정량화에 사용되는 사각형을 일관되게 유지하는 것이 중요합니다.
3. 분석 창 오른쪽 하단에 있는 보고서 및 시작 스프레드시트를 눌러 정량화를 스프레드시트에 저장합니다.
4. 직렬로 희석된 표준 샘플을 사용하여 스프레드시트를 사용하여 밀도 측정 표준 곡선을 생성하고 선형 또는 다항식 회귀를 사용하여 가장 적합한 표준 곡선 방정식을 얻습니다. 이 방정식을 사용하여 실험 샘플에서 p62, LC3b-II 또는 Lys^48-polyUb의 양을 추정합니다.
5. 플럭스 측정을 얻으려면 동일한 시점에서 PBS 샘플의 평균 값에서 각 억제제 처리 된 샘플의 추정 된 단백질 양을 뺍니다 (보충 파일 "샘플 데이터"참조).
6. 단방향 ANOVA를 사용하여 단백질 회전율의 시간적 변동의 통계적 유의를 평가합니다. 이 작업은 표준 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다.

결과

대표 데이터는 그림 2A, B에표시되고, 이러한 데이터의 정량화는 그림 2C,D에서 제공됩니다 (보충 파일 "샘플 데이터"참조). 간단히 하기 위해 그림 2에서 로드 컨트롤을 묘사하지 는 않았지만 병렬로 가져와야 합니다. 전형적으로, β-액틴에 대하여 서쪽 얼룩은 이 목적을 위해 이용됩니다, 그러...

토론

우리의 프로토콜은 일반적으로 이용 가능한 분자 생물학 장비를 사용하여 마우스에 있는 단백질 회전율에 있는 생물학 리듬을 측정하는 기술적으로 간단한 수단을 기술합니다. 시간차등의 실험의 길이와 관련된 생물학적 샘플의 수로 인해 마우스가 주입되는 방법, 조직 획득 시기 및 생화학 적 처리에 관한 전체 실험에서 일관성을 두는 것이 중요합니다. 샘플. 주사, 안락사 및 자궁 경부 탈구 단...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x SDS PAGE Sample Buffer	Invitrogen	Cat# NP0008
Bortezomib	EMD Millipore	Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7
Image Studio	LICOR	N/A
Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron	Merck Millipore Ltd	Cat# IPFL00010
K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	Cat#8081S; RRID:AB_10859893
LC3a	Boston Biochem	Cat# UL-430
LC3b antibody	Novus	Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146
LC3b antibody	Cell Signaling Technology	Cat#2775; RRID:AB_915950
Leupeptin	Sigma	Cat# L2884; CAS: 103476-89-7
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	Cat# WG1403BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Fisher Scientific	Cat# NP0007
P62-his	Novus	Cat# NBP1-44490
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards	Bio-Rad	Cat# 1610373
Rabbit Anti-p62/SQSTM1	Millipore-Sigma	Cat#P0067; RRID:AB_1841064
rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)	Boston Biochem	Cat# UC-230
SDS-PAGE Midi-size Gels	Invitrogen	Cat# WG1403
SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets	Millipore-Sigma	Cat# S8830