JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ونحن وصف نهج التصوير لتحديد الدولة المعتدلة القلة من الأقليات megfp-الموسومة-مستقبلات التي يسببها يجند ملزمه في غشاء البلازما من الخلايا الحية. يعتمد البروتوكول علي المجهر الداخلي للانعكاس الكلي (TIRF) المدمج مع تحليل العدد والسطوع (N & B).

Abstract

علي الرغم من اهميه وانتشار القلة المستقبلة ، فان بعض الطرق قابله للتطبيق للكشف عن احداث التجميع وقياس درجه التجميع. هنا ، ونحن وصف نهج التصوير لتحديد الدولة المعتدلة القلة من mEGFP-الموسومة-مستقبلات المتجانسات في غشاء الخلايا الحية. يعتمد البروتوكول علي المجهر الداخلي للانعكاس الكلي (TIRF) المدمج مع تحليل العدد والسطوع (N & B). N & B هو أسلوب مشابه للتحليل الطيفي للعلاقة الفلورية (FCS) والرسم البياني للعد الفوتون (PCH) ، والتي تستند إلى التحليل الإحصائي للتقلبات في كثافة الفلورية من الفلورية التي تنشر داخل وخارج الاضاءه حجم خلال فتره المراقبة. علي وجه الخصوص ، N & B هو تبسيط PCH للحصول علي معلومات عن متوسط عدد البروتينات في مخاليط القلة. وتوصف شده تذبذب الكثافة بالسطوع الجزيئي للفلوكوفيري ومتوسط عدد الفلوبوهورس داخل حجم الاضاءه. التالي ، لا يعتبر N & B سوي اللحظتين الاولي والثانية من توزيع السعه ، وهما متوسط الكثافة والتباين. هذا هو ، في الوقت نفسه ، وقوه وضعف الأسلوب. لأنه يتم النظر في لحظات فقط ، N & B لا يمكن تحديد الجزء المولي من القلة غير المعروفة في خليط ، ولكنه فقط يقدر متوسط حاله قله العدد من الخليط. ومع ذلك ، فانه يمكن تطبيقها علي سلسله زمنيه صغيره نسبيا (بالمقارنة مع أساليب لحظه أخرى) من الصور من الخلايا الحية علي أساس بكسل بكسل ، وذلك ببساطه عن طريق رصد تقلبات الوقت من كثافة مضان. فانه يقلل من الوقت الفعلي لكل بكسل إلى بضعة ميكروثانية ، مما يسمح الاستحواذ في النطاق الزمني من ثوان إلى مللي ثانيه ، وهو أمر ضروري لحركيه القلة السريعة. وأخيرا ، يمكن استكشاف مناطق الخلايا الكبيرة وكذلك المقصورات شبه الخلوية.

Introduction

ونحن وصف إجمالي انعكاس الداخلية الفلورية-عدد والسطوع (TIRF-N & B) نهج التصوير لتحديد متوسط الدولة القلة من جزيئات مستقبلات في غشاء البلازما من الخلايا الحية ، وتهدف إلى ربط التجمع مستقبلات ديناميات الوظيفة البيولوجية للبروتينات (الشكل 1).

عند الربط خارج الخلية وملزمه ، والمستقبلات بدء محول الاشاره داخل الخلايا اعتمادا علي التشكيل الخاصة بهم ، والقلة ، والمستقبلات المشتركة المحتملة وتكوين الغشاء. علي الرغم من اهميه وانتشار القلة المستقبلة ، المعترف بها كحدث رئيسي في الإشارات الخلوية1،2،3،4،5،6، 7, طرق قليله يمكن الكشف عن تجمع الاحداث وقياس درجه التجميع تجريبيا8,9. وحده التخزين البؤري (x ، y ≈ 300 nm ، z ≈ 900 nm) غير محلول بشكل كاف لإثبات التفاعل الجزيئي والقياس ، حتى بعد التحسين بواسطة خوارزميات استعاده الصورة10. لا يمكن حل تكوين الوحدة الفرعية من قله البروتين علي أساس المكانية بحته حتى من خلال أساليب فائقه الدقة في x, y القرار من 20-70 nm مثل النخيل11, العاصفة12, وتيد13. وعلاوة علي ذلك ، فان الدقة الزمنيه (بترتيب الدقائق لكل صوره) لا يمكن ان تتبع الحركية في نطاق الثواني. جزيء واحد خطوه التبييض علي حل القياس من قله البروتين فقط إذا كانت غير المتنقلة14.

واحده من الطرق الأكثر تنوعا لقياس الكثافة وقله الفلوريسسينتلي من البروتينات الموسومة داخل صور واحده هو تحليل توزيع كثافة المكانية (SpIDA) ، والتي تعتمد علي أخذ العينات المكانية. وهو ينطبق علي كل من الخلايا الثابتة كيميائيا والحية ، ويسمح تحليل العديد من المناطق التي تهم الخلية في وقت واحد باستخدام المجهر القياسية الفلورية15. بدلا من ذلك ، وأساليب لحظه ، مثل الطيفية الارتباط فلوري (FCS)16، المدرج التكراري العد الفوتون (pch)17، وعدد والسطوع (N & B) 18،19، هي مناسبه لقلهالسنالكمية القياسات. وتحلل هذه الطرق تقلبات الكثافة الفلورية التي يمكن ملاحظتها في الوقت الذي ينتشر فيه الفلوريد ويخرج من حجم الاضاءه. الاتساع من التقلبات شده يستطيع كنت بشكل فريد وصفت بالسطوع جزيئيه من ال [فلوفيبور] (ε) والرقم معدله [فلوبفرس] (ن) ضمن الاناره حجم17 (شكل 2). عاده ، يمكن الحصول علي معامل انتشار الفلوروبيورس ومتوسط عدد الجزيئات (المرتبطة عكسيا بقيمه G (0)) داخل حجم الاضاءه بواسطة FCS20. ومع ذلك ، منذ نشر الوقت فقط الجداول مع جذر مكعب من كتله ، FCS ليست حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن التغيرات في الكتلة الجزيئية21. في الممارسة العملية ، لا يمكن الكشف عن اللون واحد FCS ديميريشن من مستقبلات الغشاء. PCH يحل مخاليط من قله المواليد المختلفة بدقه. باستخدام أكثر من لحظتين من توزيع السعه ، يكتشف جزيئات السطوع المختلفة التي تشغل نفس حجم الاضاءه. المسح الضوئي FCS22 والتطورات ، مثل الزوج مثيره للاهتمام-ارتباط السطوع الجزيئي (pcomb) النهج23، وعرضت لتوسيع نطاق تطبيق أساليب الارتباط فلوري في النظم البيولوجية24 ، تبقي الطرق نقطه واحده تفتقر إلى القدرة علي القياسات السريعة في مساحة كبيره من الخلية ، والتي تتطلب العديد من الملاحظات المتتابعة في كل بكسل والحصول علي البيانات في ترتيب الثواني.

N & B هو نسخه مبسطه من pch التي تعتبر فقط اللحظات الاولي والثانية من سعة التوزيع الفلوري ، وهي متوسط الكثافة ، < I > ، والفرق ، σ2 (الشكل 2)18،19 وبسبب ذلك ، فانه لا يمكن تحديد الجزء المولي من القلة غير المعروفة في خليط ، ولكن فقط تقديرات الدولة المعتدلة القلة من الخليط. ومع ذلك ، N & B لديه ميزه العمل مع سلسله زمنيه أصغر نسبيا من الصور من الخلايا الحية من PCH علي أساس بكسل بكسل ، وذلك ببساطه عن طريق رصد التقلبات في الوقت المناسب من كثافة مضان. لان N & B يقلل من الوقت لكل بكسل إلى بضع ميكروثانية ، فانه يمكن ان تتبع حركيه القلة السريعة علي مناطق الخلايا الكبيرة ، مما يسمح اكتساب الصورة علي مقياس الوقت من الثواني في المسح الضوئي المجهر (علي سبيل المثال ، التنسيق ، 2-الفوتون) ومللي ثانيه في المجهر القائم علي الكاميرا (علي سبيل المثال ، TIRFM).

وقد أظهرت عده تقارير قدره N & B علي قياس عدد الوحدات الفرعية في مجموعات البروتين عن طريق تصوير مناطق الخلايا الموسعة. تم الكشف عن مجموعات باكيلين-EGFP في مواقع التصاق في الخلايا تشو-K125، وتم وصف التجميع داخل الخلايا من الببتيد Httex1p المسببة للامراض في الخلايا كوس-726. وقد تم تطبيق N & B لاتباع القلة التي يحركها الأمر من مستقبلات erbb27، وتاثير يجند علي كلوثوب (klb) و FGFR1c في الخلايا هيلا28. تم استخدام الجمع بين التصوير TIRF وتحليل N & B لإظهار ان دينامين-2 هو رباعيه في المقام الأول في جميع انحاء الغشاء الخلوي بأكمله29. قمنا بتطبيق N & B لكل من المسح النقطي والصور tirf لإثبات ديميريشن الموجهة من upar ومستقبلات غشاء الخلية FGFR130,31.

طرق الارتباط الفلورية ، مثل N & B ، FCS و PCH ، وتستند إلى فكره انه في حجم مفتوح الاحتلال عدد من الجزيئات يتبع توزيع Poisson. لأنه فقط الفوتونات التي تنبعث منها الفلوروبيورس يمكن الكشف عنها ، والقيمة المتوسطة لكثافة مضان قياس figure-introduction-5420 مقابل الوقت في بكسل من الصورة ، ، هو نتاج متوسط عدد الفلوبورس في حجم الاضاءه ، ن ، وبهم السطوع الجزيئي ، ε17:

figure-introduction-5637

حيث يتم التعبير عن ε كعدد من الفوتونات المنبعثة لكل وحده من الوقت (تقليديا في الثانية) لكل جزيء عندما يكون الجزيء في مركز حجم الاضاءه.

السطوع هو خاصيه لكل فلوكوفيري في عمليه استحواذ معينه ، في حين ان الكثافة هي مجموع جميع المساهمات من جميع الفلوبورس. في المسابقات البيولوجية ، سيزداد السطوع مع زيادة عدد الفلوريد الذي يتقلب معا ، مما يعطي معلومات عن حاله قله الفلوريسسينتلي من البروتين الموسوم. يتم قياس سعة التذبذب في بكسل معينه من التباين في اشاره مضان ، σ2:

figure-introduction-6242

حيث المتوسطة من المربع الشدة figure-introduction-6348 ,, والمربع من المدى الشدة figure-introduction-6429 ,, يحسب من الفردية كثافة قيم في كل [بكسل] من كل اطار:

figure-introduction-6566

حيث K هو عدد الإطارات الاجماليه في سلسله الوقت. من الناحية التجريبية ، فمن الضروري حساب لسلسله الصورة بأكملها الفرق الذي يصف مبعثر قيم كثافة الفردية في كل بكسل من صوره واحده حول قيمه كثافة متوسط. ويشمل الفرق جميع التقلبات من أصول مختلفه. في تقريب اولي, التباين واجبه ال ينتشر جسيمات في الاناره حجم, σ20, يستطيع كنت فصلت من التباين واجبه إلى الكاشف طلقه خردق ضوضاء, σ2[د.]. والفرق بينهما مستقل ؛ التالي ، يتم إعطاء الفرق الإجمالي من خلال المبلغ الخاص بهم:

figure-introduction-7179

الفرق ، بسبب التقلبات الجزيئية داخل وخارج حجم الكشف ، يعتمد خطيا علي السطوع الجزيئي وكثافة:

figure-introduction-7376

أعاده ترتيب المكافئ 6 وفقا لمكافئ 1:

figure-introduction-7518

وفقا للمفهوم النموذجي في الطيفي الترابط الفلوري ، المعادلة 7 تنص علي ان الفرق بسبب عدد من التقلبات يعتمد علي مربع من سطوع الجسيمات.

ثم, الفرق بسبب تقلبات كاشف هو وظيفة خطيه من كثافة الكشف, تحت افتراض ان يتم تشغيل كاشف تحت الحد التشبع19:

figure-introduction-7912

في حاله الفوتون العد كاشفات a= 1 و c= 0 ، التالي فان الفرق كاشف يساوي متوسط كثافة:

figure-introduction-8119

لتطبيق هذه المفاهيم علي القياسات الحقيقية في الخلايا الحية ، Gratton وزملاءه18 تحديد سطوع واضح ، B ، لكل بكسل كنسبه الفرق علي مدي كثافة متوسط:

figure-introduction-8392

B هي المعلمة التي تقاس بالتجربة. في هذا العمل ، يتم التقاط صور السلسلة الزمنيه لمستقبلات FGFR1 في غشاء البلازما من الخلايا هيلا من قبل المجهر TIRF ومتوسط سطوع واضح ، B ، يتم تحديده من قبل تحليل N & B. بعد ذلك ، بعد أضافه FGF2 ، يتم التقاط سلسله زمنيه متتالية لمتابعه التغييرات في التجميع الذاتي لجزيئات المستقبلات في سطح الغشاء بعد تحفيز المستقبلات مع ligand المتعارف عليه.

ومع ذلك ، منذ كاشف المجهر TIRF هو كاميرا EMCCD ، والتعبير عن سطوع واضح يحتاج إلى تعديل كما19:

figure-introduction-9019

حيث أزاحه هو أزاحه كثافة الكترونيات الكشف التي هي سمه من سمات إعدادات كاشف. يتم إعطاء الفرق ومتوسط كثافة للكشف التناظرية علي التوالي من قبل:

figure-introduction-9276

حيث G هو كسب التناظرية في المستويات الرقمية (DL/الفوتونات) ، S، والمستويات الرقمية لكل فوتون19، وتعطي من قبل منحدر كثافة مقابل مؤامرة الفرق لمصدر الضوء مع كثافة ثابته (اي تقلبات الزمنيه). يرتبط عامل γ بشكل وحده تخزين الكشف عن البكسل. وفقا ل Hassler وآخرون32، عامل γ يساوي 0.3 للتصوير tirf العمل في الكسب الأقصى من الكاميرا الكشف19. الازاحه ، S و G المعلمات هي خصائص الكاميرا والمجهر. السطوع الظاهر ، B ، يتم الحصول عليه عن طريق أعاده ترتيب المكافئ 11 وفقا لمكافئ 12 و 13:

figure-introduction-9936

تجريبيا ، ε هو وظيفة معقده من كثافة الليزر وكفاءه الكشف عن النظام. ومع ذلك ، بما ان B/S يعتمد خطيا علي ε ، فمن المهم تحديد القيمة النسبية لε لوضع الكشف المعطي:

figure-introduction-10202

حيث ε ' يتناسب مع الε. ومع ذلك ، يتم اجراء المعايرة باستخدام مرجع داخلي.

Protocol

1. اعداد العينات

  1. اليوم الأول البذور هيلا الخلايا في المتوسط الكامل في تركيز من 100000-200000 خليه/مل في الاطباق الزجاجية القاع. البذور 6-8 تكرار الاطباق.
    ملاحظه: في هذا المثال ، يتم تكمله المتوسطة مع 10 ٪ الحرارة الجنين البقري المنشط مصل (الجندي) ، 1 ملليمتر بيروفات الصوديوم ، 100 U/100 ميكروغرام البنسلين/ستربتوميسين. ويتم اعداد العديد من الاطباق المتماثلة.
  2. اليوم 2-3 عندما تكون الخلايا في الكونفلوينسي الفرعية ، transfect نصف الاطباق مع البلازميد البروتين والنصف الثاني مع مرجع البلازميدات (مونومر وديمير) ، في وسط خاليه من المصل.
    ملاحظه: يرصد التحويل في المصل المتوسطة الحرة تستكمل مع المضادات الحيوية ، 0.1 ٪ البقري مصل الزلال و 25 مم HEPES العازلة ، دون الفينول الأحمر.
  3. اليوم 3-4 تاكد من ان الخلايا المقسمة ملتصقة بالجزء السفلي من الاطباق وان غشاء الخلية فلوري. تجاهل الاطباق مع الخلايا متضخمة أو مع فلوري منخفضه جدا.
    ملاحظه: لا تدع الخلايا تكبر. يجب ان تكون الخلايا موزعه بشكل جيد وان تلتزم بالمنطقة الزجاجية للصحن (الشكل 1ا). يمكن استخدام الاطباق أسفل الزجاج precoated لصالح التصاق الخلية. يتم اختبار ثقافة الخلية للتلوث الميكوبلازما قبل اي تجربه. في هذا المثال ، يتم نقل الخلايا بواسطة (A207K) megfp-FGFR1 البلازميد ويتم نقل الخلايا المرجعية مع gpi-(A207K) megfp و gpi-(A207K) megfp-(A207K) megfp البلازميدات باستخدام البروتوكولات القياسية. للحصول علي المجهر الخلوي الحي ، ينصح باستخدام وسيطه خاليه من المؤشرات ؛ يتم أضافه 25 مم HEPES العازلة لمنع تغييرات الأس الهيدروجيني اثناء التصوير.

2. TIRF التصوير-محاذاة خط الليزر والأمثل للاضاءه TIRF

  1. قبل أربع ساعات من التجربة ، وتنشيط حاضنه درجه الحرارة من المجهر في 37 درجه مئوية.
  2. قم بتشغيل المجهر وأجهزه الكمبيوتر والكاميرات وانتظر حتى تصل الكاميرات إلى درجه حرارة العمل المناسبة.
    ملاحظه: درجه حرارة العمل من الكاميرا المستخدمة في هذه الدراسة هي-75 درجه مئوية.
  3. ضع قطره صغيره من الزيت علي الهدف. وضع طبق عينه في المكان. إغلاق أبواب الحاضنة والسماح للحرارة من طبق تتوازن (~ 10 دقيقه).
  4. بدوره علي مصباح العدسة والليزر 488 nm.
  5. حدد وضع التباين الكتابي لاستكشاف العينة ، والبحث في خليه للتركيز من العين.
    ملاحظه: استخدام مصباح الفلورسنت للبحث الخلايا الحوض العين ليست إلزاميه. ويمكن استخدام خط ليزر مناسب بدلا من ذلك.
  6. حدد فلتر المناسبة لجمع الانبعاثات الخضراء من خلال كاميرا المجهر (باند باس Ex 490/20 (500) الفرقة تمرير Em 525/50 ، أو ما شابه ذلك.
  7. التبديل من العين إلى منفذ الكاميرا (كاميرا #1 في الشكل 1) في وضع العدسة ، وصقل التركيز والتغيير إلى وضع tirf. قد يتم تسميه وسائط TIRF والعدسات مع تسميه مختلفه اعتمادا علي العلامة التجارية للمجهر.
    ملاحظه: قد يكون هناك قضايا التركيز أو محاذاة الليزر إذا لم تكن هناك علامات الفلورسنت في واجهه كوفيرسليب. لمحاذاة الليزر بشكل صحيح (الاساسيه ل TIRF جيده) ، والتركيز علي coverslip. غالبا ما يكون من الصعب جدا تحديد ما إذا كان المشارك في التركيز. كاقتراح ، والتركيز علي حواف الخلايا.
  8. تنشيط المحاذاة التلقائية التالية للتعليمات المجهر TIRF.
    ملاحظه: لفتره وجيزة ، للخطوات من 2.4 إلى 2.8 ، أولا العثور علي الخلايا من خلال العين والتركيز عليها ، ثم إرسال الانبعاثات إلى منفذ الكاميرا من المجهر TIRF ، أعاده تركيز الخلايا علي شاشه الكمبيوتر المجهر وتفعيل الاجراء لمحاذاة الليزر. وتتكون المحاذاة من العثور علي الزاوية الحرجة التي تصبح فيها الاضاءه غير المستوية (الشكل 3). قد يكون المجاهر التجارية بروتوكولات محاذاة مختلفه قليلا وأيضا ان تكون مؤتمتة بالبالكامل; قد يكون لدي الآخرين كاميرا صغيره لتسهيل التصور من الظروف زاوية حرجه.
  9. اختيار عمق الاضاءه المناسبة وتحسين اتجاه الحقل evتخدير (الشكل 3).
    ملاحظه: يتم الاحتفاظ عمق الاختراق ثابت لجميع الضوابط والعينات.

3. TIRF التصوير: التقاط السلسلة الزمنيه

  1. تحديد منطقه الاهتمام (ROI) علي الأقل 256 x 256 بكسل.
    ملاحظه: في هذا الاعداد ، يتم التقاط مع الكاميرا #2 تحت البرنامج الذي يتحكم مباشره فقط الكاميرا (انظر الشكل 1 اسطوره).
  2. تعيين التعرض إلى 1 مللي ثانيه وكسب EM إلى 1,000 (وهذا هو عامل G في eq. 12 و 13). في مثل هذه السرعة ، قد يكون من الضروري لضبط أو زيادة قوه الليزر. هنا قوه الليزر 0.5 ميغاواط.
    ملاحظه: اعتمادا علي نوع من الكاميرا والحدود التي يفرضها معامل انتشار البروتين ، وكثافة الفلورية والخلفية ، والمعايير العامة لتحديد قوه الليزر ليست لتشبع الكاشف ، والحد من التسرب الضوئي ، والقبض علي النحو أسرع وقت ممكن في S/N معقولة. يتم تعيين كسب EM دائما في الحد الأقصى من الكاميرا (انظر مقدمه).
  3. تشغيل التسلسل التجريبي الأول ضمن الشروط الاوليه وتقريبا تقدير قيمه S/N. الشروط مقبوله في S/N = 2-3 أو اعلي ، كما تقاس في الإطار الأول من سلسله الوقت الأول.
  4. استخدام المنزلق من نظام تقسيم الانبعاثات ربط الكاميرا #2 إلى المجهر لإخفاء جانب من الصورة (الشكل 1ب، الشكل 4ا-ب)
    ملاحظه: في هذا الاعداد يتم تثبيت موصل تصوير متعدد القناات علي #2 الكاميرا لتمكين الحصول علي صورتين متطابقتين مكانيا في نفس الوقت. وقد تم تجهيز النظام مع الشرائح لتركيب مرشحات الانبعاثات المختلفة. أحد المنزلقات يتصاعد قناع اسود لتغطيه جانب من الصورة. يتم استخدام المنطقة المقنعة للمعايرة الداخلية لكل سلسله زمنيه ، لتحديد معلمات الكاميرا (مكافئ 12 و eq. 13). وبهذه الطريقة لا توجد حاجه لخطوه معايره مستقله ، والاهم من ذلك ، يتم اجراء المعايرة بالتوازي مع القبض علي كل سلسله زمنيه. في غياب هذا النظام ، يمكن معايره الكاميرا تطبيق البروتوكولات المنشورة33.
  5. حدد خيار الحفظ التلقائي لملف الكاميرا.
  6. بدء الاستحواذ علي سلسله الصور. الحصول علي الحد ادني من 700 الإطارات بنسبه S/N الحد الأدنى من 2.
    ملاحظه: يعتمد عدد الإطارات الضرورية للتحليل علي استقرار العينة إلى الرشح الضوئي وعلي تشتت البيانات. لذلك ، يتم تقييم جوده كل سلسله زمنيه اثناء تحليل N & B.
  7. دون أخذ الطبق من المجهر ، أضافه ligand.
  8. حدد خليه مع غشاء فلوري مشرق وتبدا بسرعة أول سلسله من الوقت لتشغيل الحركية.
    ملاحظه: إذا تمت أضافه الربط بسرعة ، فان هذا التقاط الأول يحدد النقطة = 0 من الوقت الحركي والحركية. يسجل البرنامج الوقت الدقيق للتقاط.
  9. البحث في الخلية الثانية والحصول علي نقطه الوقت الثاني من الحركية.
    ملاحظه: تتوفر إجراءات الزيارة النقطية في بعض المجاهر المجهزة بالمراحل اليه x و y و z. هذه تسمح لتحفيظ مواقف متعددة علي طبق الخلية ، ويمكن ان تساعد في الحفاظ علي فاصل زمني أكثر ثابته من الوقت بين سلسله الصور علي خلايا مختلفه.
  10. التقاط خليه جديده لكل نقطه زمنيه من التشغيل الحركي.
    ملاحظه: بعد التقاط ، يتم تصوير الخلية جزئيا ولا يمكن أعاده وضعها. وبسبب ذلك ، يتم الحصول علي حركيه من خلال الجمع بين سلسله زمنيه من العديد من الخلايا ، كل القبض في نقطه زمنيه مختلفه.
  11. لكل طبق جديد ، كرر البروتوكول من الخطوة 2.3 إلى 3.9.
    ملاحظه: ل مرجع اطباق, أضفت حجم من العربة ([ببس] يلحق مع 0.01% بقري مصل البومات) معادله إلى ان يستعمل ل ال [ليغو].

4. عدد & السطوع (N & B): جوده الاختيار من السلسلة الزمنيه

  1. تحويل وحفظ باسم. TIFF الملفات التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج الكاميرا (ملفات .sif في هذا المثال).
  2. استيراد. ملفات TIFF في روتين برنامج التحليل عن طريق تنشيط واجهه المستخدم الرسوميه N & B (GUI) MATLAB.
    ملاحظه: يتم استخدام روتين Matlab القابل للتنفيذ N & B المخصص هنا (تحليل N & B في https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). عن طريق فتح المستوردة. TIFF ، يقوم الروتين بإنشاء صوره الكثافة المتوسطة ، ومتوسط الكثافة الشخصية ويسمح بفحص اطار السلسلة بإطار (الشكل التكميلي 1). وهناك برامج أخرى متاحه للتحليل N & B (علي سبيل المثال ، برنامج SimFCS).
  3. تجاهل السلسلة التي يظهر فيها متوسط الكثافة الضوئية أكثر من 10% من الرشح بالصور ، والسلسلة التي تم فيها تشويه غشاء الخلية الواضح أو ترجمته اثناء الاستحواذ.
  4. إطارات الاقتصاص التي من الواضح انها خارج التركيز.
    ملاحظه: يتم تطبيق أداه اقتصاص في الروتين لتجاهل إطارات مفرده أو متعددة ضمن سلسله الصور. يتم السماح بهذه العملية لان وقت اطار الإطار ليس حرجا بينما يكون وقت السكون بكسل (وقت التعريض) (راجع المناقشة).
  5. الحفاظ علي سلسله التحليل فقط مع ما لا يقل عن 500 الأطر الزمنيه.

5. عدد & السطوع (N & B): تحديد معلمات الكاميرا (الازاحه ، σ و S)

  1. تنشيط الكاميرا معايرهالروتينية.
  2. حدد مساحة لا تقل عن 20 × 50 بيكسل في منطقه ضوضاء الكاشف (الشكل 4).
    ملاحظه: يتكون الروتين من الرسم البياني للقيم (أيضا تعريف المستوي الرقمي ، DL) ويقوم بإرجاع مؤامرة لوغاريتم من التردد مقابل المستويات الرقمية.
  3. في السجل التردد مقابل مؤامرة المستوي الرقمي ، حرك المؤشر الخطي الأحمر لتحديد غوسيه والجزء الخطي من المنحني.
    ملاحظه: المؤشر الأحمر يقسم القسمين من المنحني ، وينشط الروتين العائد الازاحه ، والذي هو مركز الدالة غوسيه من استجابه الكاميرا ، والσ من نوبة غاوسي ، وعامل S ، وهو الميل من الجزء الخطي من الكاميرا (ه) (الشكل 4-جيم-دال).

6. عدد & سطوع (N & B): حساب القيم B في منطقه مختاره من الفائدة (ROI)

  1. تنشيط المفتاح B .
    ملاحظه: يقوم هذا الاجراء بإنشاء صوره الكثافة المتوسطة (الشكل 5، العمود الأول) و b-الصورة التي يقترن بها كل فرد من القيمة b إلى بكسل ذات الصلة في الصورة (الشكل الإضافي 1).
  2. تطبيق الحد الأدنى من التسلق (2 2) للحد من تشتت البيانات وتوليد الرسم البياني ب-I (الشكل 5، العمود الثاني).
    ملاحظه: يمثل الرسم البياني بي-I توزيع القيم B لكافة البيكسلات الخاصة بالصورة مقابل كثافة البكسل. Y = B/S ؛ X = (figure-protocol-9747 أزاحه)/s (الشكل التكميلي 1 ومكافئ 11 و 15).
  3. افحص الرسم البياني بي-اي باستخدام المؤشر المربع التفاعلي.
  4. حدد عائد مربع للتحليل (الشكل 5، العمود الثالث).
    ملاحظه: المؤشر بمزامنة قناع محمول علي صوره كثافة متوسط ، تسليط الضوء علي البيكسلات التي تم تحديدها داخل منطقه المؤشر مربع (الشكل الإضافي 1). من خلال هذا التفتيش ، فمن الممكن ان تستبعد من التحليل الخلفية والمناطق ذات كثافة منخفضه جدا.
  5. إنشاء خريطة B لعائد الاستثمار المحدد (الشكل 5، العمود الرابع).
  6. حفظ ملف ASCII من القيم B-المقترنة بالتحديد.
  7. استيراد ملف ASCII في برنامج رسومي لحساب توزيع الترددات للبيانات والحصول علي متوسط B-قيمه ± s. E (الشكل 5، العمود الخامس).
    ملاحظه: وإذا كانت البيانات متجانسة ، فان توزيع الترددات الخاصة بالقيم باء يقترب من توزيع غاوسي.
  8. تطبيق eq. 15 لاشتقاق متوسط السطوع figure-protocol-10770 = figure-protocol-10822 -1 [(التهم/جزيء) لكل وقت السكون] لكل خليه في كل نقطه زمنيه من التشغيل الحركي. تطبيع البيانات وفقا لما يلي:
    figure-protocol-10982
    حيث figure-protocol-11039 هو متوسط b-القيمة تقاس في الوقت "t" بعد الربط والاضافه ، وهو figure-protocol-11150 متوسط b-القيمة تقاس في الوقت t = 0 (10-20 s بعد يجند الاضافه).
    ملاحظه: تطبيع النتائج يسمح المقارنة المباشرة للتجارب التي يتم تنفيذها في أيام مختلفه. هو يعوض لفروق في ال يقاس سطوع واجبه إلى ليزر قوه وتقلبات فنيه.
  9. ارسم متوسط السطوع العادي مقابل وقت الاكتساب لبناء التشغيل الحركي (الشكل 6).

النتائج

النتائج لاثنين من الخلايا الممثلة هيلا-mEGFP-FGFR1 المصنفة في نفس الطبق الثقافة وترد في الشكل 5 والجدول التكميلي 1. تم القبض علي الخليتين في وقت 0 دقيقه (الشكل 5a، اعلي) و 7 دقيقه (الشكل 5a، أسفل) بعد أضافه ...

Discussion

N & B يتطلب العديد من الاحتياطات في اختيار نموذج الخلية واستراتيجية وضع العلامات. ويمكن تطبيقه فقط علي الخلايا الحية التي لا تزال ملتزمه بثبات خلال وقت التقاط الصورة. ويمكن التعامل مع التقلبات الاضافيه الناجمة عن النزوح الجامد للخلية بأكملها مع نهج استعاده الصورة المناسبة38. و?...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

ويدعم هذا المركز وزاره الاستخبارات والابتكار واليقع والمؤسسة المناصرة للمؤسسة الخيرية ، وهو أحد مراكز الامتياز في سيفيرو اوتشوا (سيف-2015-0505). ويدعمنا أيضا الصندوق الأوروبي للتنمية الاقليميه "Una manera de هاجر Europa". وتنوه جامعه كاليفورنيا بالدعم المقدم من الرابطة الايطاليه للبحث عن السرطان ، وجمعيه البحوث الدولية للسرطان (المعروفة الآن باسم بحوث السرطان في جميع انحاء العالم) ، ووزارة الصحة الايطاليه. وتقر تحكيم بان "مؤسسه بيانكا ديل مؤنتي دي لومباردي" لدعمها الجزئي لعمله مع الزمالة الكهروضوئية "Progetetetalita ايفانو Becchi" 2011-2012.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimunSigma-Aldrich, St. Louis, MI, USAA7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPESGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA21063029Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX IGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA10566-016Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)Biowest, Nuaillé, FranceX0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, BrazilGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA1027010610% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishesMatTek, Ashland, MA, USAP35G-0.170-14-Cuncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad PrismGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cellsMillipore-Sigma ECACC, Darmstadt, GermanyCB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis softwareOxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UKThis camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routineUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spaindownload at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018bThe MathWorks, Inc. Natick, MA, USAhttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100xBiowhittaker Inc. Walkersville, MD, USALONZA 17-602Esupplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vectorUnit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, ItalyZamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vectorUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, SpainHellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vectorUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, SpainHellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2PeproTech EC, Ltd., London, UKLigand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCOThermoFisher Scientific113600701 mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection ReagentMirusBio LLC, Madison, WI, USAMIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA25200056
Type F Immersion liquid 10 mLLeica Microsystems, Wetzlar, Germany11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)ThermoFisher ScientificAM26180.1% supplement for medium without phenol red used for transfections

References

  1. Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
  2. Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
  3. Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. Muscarinic receptor oligomerization. Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).
  4. Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
  5. Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
  6. Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
  7. Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
  8. Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
  9. Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
  10. Trussell, H. J., et al., Trussell, J., et al. . Academic Press Library in Signal Processing. 4, 3-9 (2014).
  11. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  12. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  13. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
  14. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  15. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  16. Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
  17. Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
  18. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  19. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  20. Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  21. Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
  22. Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
  23. Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047 (2016).
  24. Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
  25. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  26. Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
  27. Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
  28. Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
  29. Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
  30. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  31. Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
  32. Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
  33. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).
  34. Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
  35. Joubert, J., Sharma, D. Light microscopy digital imaging. Current Protocols in Cytometry. , (2011).
  36. Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
  37. Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).
  38. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  39. Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
  40. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
  41. Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
  42. Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

153 N B TIRF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved