Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Canlı hücrelerin plazma zarında ligand bağlanması ile indüklenen mEGFP etiketli-reseptör oligomerlerinin ortalama oligomerik durumunun belirlenmesi için bir görüntüleme yaklaşımını tanımladık. Protokol, Sayı ve Parlaklık (N&B) analizi ile birlikte Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobuna dayanmaktadır.

Özet

Reseptör oligomerizasyonunun önemi ne kadar önemli ve her yerde yer alsa da, kümeleme olaylarının saptandırılması ve kümelenme derecesinin ölçülmesi için çok az yöntem uygulanmaktadır. Burada, canlı hücrelerin zarındaki mEGFP etiketli-reseptör homokomplekslerinin ortalama oligomerik durumunu belirlemek için bir görüntüleme yaklaşımını tanımladık. Protokol, Sayı ve Parlaklık (N&B) analizi ile birlikte Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobuna dayanmaktadır. N&B, floresan-korelasyon spektroskopisi (FCS) ve foton sayma histogramına (PCH) benzer bir yöntemdir ve floresan ların floresan şiddetindeki dalgalanmaların bir aydınlatmaya girip çıkmasındaki dalgalanmaların istatistiksel analizine dayanır. bir gözlem süresi boyunca hacim. Özellikle, N & B oligomerik karışımların proteinlerin ortalama sayısı hakkında bilgi edinmek için PCH bir basitleştirme olduğunu. Yoğunluk dalgalanma genlikleri floroformoleküler parlaklık ve aydınlatma hacmi içinde floroforların ortalama sayısı ile tanımlanır. Böylece, N & B genlik dağılımı, yani, ortalama yoğunluğu ve varyans sadece ilk ve ikinci anları dikkate alır. Bu, aynı zamanda, güç ve yöntemin zayıflığıdır. Sadece iki dakika düşünüldüğünden, N&B bir karışımdaki bilinmeyen oligomerlerin molar fraksiyonunu belirleyemez, ancak sadece karışımın ortalama oliomerizasyon durumunu tahmin eder. Bununla birlikte, sadece floresan yoğunluğunun zaman dalgalanmalarını izleyerek, canlı hücrelerin görüntülerinin piksel piksel bazında nispeten küçük zaman serilerine (diğer an yöntemleriyle karşılaştırıldığında) uygulanabilir. Piksel başına etkili süreyi birkaç mikrosaniyeye düşürerek saniyeler ile milisaniye arasında zaman aralığında edinme sağlar ve bu da hızlı oligomerizasyon kinetikleri için gereklidir. Son olarak, büyük hücre alanları ve alt hücre altbölümleri incelenebilir.

Giriş

Canlı hücrelerin plazma zarındaki reseptör moleküllerinin ortalama oligomerik durumunu belirlemek için toplam Internal Yansıma Floresan-Sayı ve Parlaklık (TIRF-Sayı ve Parlaklık) görüntüleme yaklaşımını, reseptör diziliyi bağlamayı amaçlayan bir toplam iç yansıma floresan-sayı ve parlaklık (TIRF-N&B) görüntüleme yaklaşımını tanımladık. proteinlerin biyolojik işlevine dinamikler (Şekil 1).

Hücre dışı ligand bağlanması üzerine reseptörler konformasyonlarına, oliomerizasyonlarına, potansiyel ko-reseptörlerine ve membran kompozisyonlarına bağlı olarak hücre içi sinyal iletimini başlatırlar. Reseptör oligomerizasyonunun önemi ve her yerde, hücreselsinyalizasyon daönemli bir olay olarak kabul rağmen 1,2,3,4,5,6, 7, birkaç yöntem kümeleme olayları algılayabilir ve deneyselkümelemederecesini ölçmek 8,9. Konfokal hacim (x,y 』 300 nm, z 』 900 nm) moleküler etkileşimi ve stokiyometriyi kanıtlamak için yeterli olarak çözülmüş, görüntü restorasyon algoritmaları tarafından optimizasyon dan sonra bile10. Protein oligomerlerinin alt birim bileşimi, PALM11, STORM12ve STED13gibi 20-70 nm x,y çözünürlükte süper çözünürlük yöntemleriyle bile tamamen mekansal olarak çözülemez. Ayrıca, onların zamansal çözünürlük (görüntü başına dakika sırasına göre) saniye aralığında kinetik takip edemez. Tek moleküllü adım ağartma protein oligomerlerinin stoiyometrisini ancak hareketsiz olduklarında çözer14.

Floresan etiketli proteinlerin tek bir görüntü içinde yoğunluk ve oliomerizasyonunu ölçmek için en çok yönlü yöntemlerden biri, mekansal örneklemeye dayanan mekansal yoğunluk dağılım analizidir (SpIDA). Hem kimyasal olarak sabit hem de canlı hücreler için geçerlidir ve aynı anda standart floresan mikroskobu15kullanarak hücrenin ilgi çeşitli bölgelerin analizisağlar. Alternatif olarak, floresan-korelasyon spektroskopisi (FCS)16,foton sayma histogramı (PCH)17ve Sayı ve Parlaklık (N&B)18,19gibi moment yöntemleri kantitatif oligomer için uygundur Ölçüm. Bu yöntemler, floresan ların aydınlatma hacmine girip çıktığı zaman gözlemlenebilen floresan yoğunluk dalgalanmalarını analiz eder. Yoğunluk dalgalanmalarının genlikleri, floroforun moleküler parlaklığı (ε) ve aydınlatma hacmindeki ortalama florofor (n) sayısı(şekil 2)ile benzersiz bir şekilde tanımlanabilir. Tipik olarak, floroforların difüzyon katsayısı ve aydınlatma hacmi içindeki ortalama molekül sayısı (G(0) değeriile ters orantılı) FCS20ile elde edilebilir. Ancak, difüzyon süresi sadece kütlenin kübik kökü ile ölçeklenir beri, FCS moleküler kütle değişiklikleri tespit etmek için yeterince duyarlı değildir21. Uygulamada, tek renkli FCS membran reseptörlerinin dimerizasyon unu algılayamaz. PCH, farklı oligomerlerin karışımlarını doğru bir şekilde çözer. Genlik dağılımının iki dakikadan fazlaını kullanarak, aynı aydınlatma hacmini kaplayan farklı parlaklıktaki molekülleri algılar. Tarama FCS22 ve gelişmeler, moleküler parlaklık ilginç çift korelasyon gibi (pCOMB) yaklaşım23, biyolojik sistemlerde floresan korelasyon yöntemlerinin uygulanabilirlik aralığını genişletmek için tanıtıldı24 , bir hücrenin geniş bir alanında hızlı ölçüm yeteneği nden yoksun tek noktalı yöntemler kalır, saniye sırasına göre her piksel ve veri toplama birçok ardışık gözlemler gerektiren.

N&B, PCH'nin floresan dağılımının genliğin inkişanın sadece birinci ve ikinci anlarını, yani ortalama yoğunluğunu, , ve varyans, σ2 (Şekil 2) 18,19'udikkate alan basitleştirilmiş bir sürümüdür. ve bu nedenle, bir karışımda bilinmeyen oligomerlerin molar fraksiyonunu belirleyemez, ancak sadece karışımın ortalama oliomerizasyon durumunu tahmin eder. Bununla birlikte, N & B sadece floresan yoğunluğu zamanında dalgalanmaları izleyerek, bir piksel-piksel bazında PCH daha canlı hücrelerin görüntüleri nispeten daha küçük zaman serisi ile çalışma avantajı vardır. N&B piksel başına zamanı birkaç mikrosaniyeye düşürebildiği için, büyük hücre alanları üzerinde hızlı oligomerizasyon kinetiği izleyebilir ve raster tarama mikroskopisinde (örn. konfokal, 2-foton) ve milisaniyelerde saniyeler ölçeğinde görüntü elde edilmesine izin verir. kamera tabanlı mikroskopide (örn. TIRFM).

Çeşitli raporlar, Genişletilmiş hücre bölgelerini görüntüleyerek protein kümelerinde alt birim sayısını ölçebilme yeteneğini göstermiştir. PAXIllin-EGFP kümeleri CHO-K1 hücrelerinde adezyon bölgelerinde tespit edildi25, ve patojenik Httex1p peptid in hücre içi agregasyonu COS-7 hücrelerinde tanımlanmıştır26. N & B ErbB reseptörünün ligand tahrikli oligomerizasyonu aşağıdaki için uygulandı27, ve HeLa hücrelerinde Klothob üzerinde ligand FGF21 etkisi (KLB) ve FGFR1c HeLa hücrelerinde28. TIRF görüntüleme ve N & B analizi kombinasyonu dinamin-2 öncelikle tüm hücre zarı29boyunca tetramerik olduğunu göstermek için kullanılmıştır. UPAR ve FGFR1 hücre zarı reseptörlerinin ligand tahrikli dimerizasyonunu kanıtlamak için hem raster tarama sınahem de TIRF görüntülerine N&B uyguladık30,31.

N&B, FCS ve PCH gibi floresan korelasyon yöntemleri, açık bir hacimde parçacıkların işgal sayısının Bir Poisson dağılımını izlediği fikrine dayanır. Sadece floroforların emit tespit edilebildiği fotonlar, görüntünün figure-introduction-6274 bir pikselinde ölçülen floresan yoğunluğuile zaman arasındaki ortalama değer, aydınlatma hacmindeki ortalama floresan sayısının, n ve bunların moleküler parlaklık, ε17:

figure-introduction-6550

molekül aydınlatma hacminin merkezindeyken molekül başına zaman birimi başına yayılan foton sayısı (geleneksel olarak saniyede) olarak ifade edilir.

Parlaklık belirli bir edinim kurmak her florofor bir özelliğidir, yoğunluk tüm floroforlardan tüm katkıların toplamı ise. Biyolojik yarışmalarda, birlikte dalgalanan florofor sayısının artmasıyla parlaklık artarak floresan etiketli proteinin oliomerizasyon durumu hakkında bilgi verecektir. Belirli bir pikseldeki dalgalanma genlikleri floresan sinyalinin varyansından ölçülür, σ2:

figure-introduction-7225

Yoğunluk figure-introduction-7311 karesinin ortalaması ve yoğunluk ortalamasının karesi, figure-introduction-7421 her karenin her pikselindeki tek tek yoğunluk değerlerinden hesaplanır:

figure-introduction-7576

k zaman serisindeki toplam kare sayısıdır. Deneysel olarak, tüm görüntü serisi için ortalama yoğunluk değeri etrafında tek bir görüntünün her pikselinde tek tek yoğunluk değerlerinin dağılım açıklayan varyans hesaplamak için gereklidir. Varyans, farklı kökenlerdeki tüm dalgalanmaları içerir. İlk yaklaşık olarak, aydınlatma hacmindeki difüzyon parçacıklar nedeniyle varyans, σ20, dedektör atış gürültüsü nedeniyle varyans ayrılabilir, σ2d. İki varyans bağımsızdır; böylece, toplam varyans onların toplamı ile verilir:

figure-introduction-8253

Algılama hacmindeki ve dışında meydana gelen moleküler dalgalanmalar nedeniyle varyans, moleküler parlaklığa ve yoğunluğa doğrusal olarak bağlıdır:

figure-introduction-8506

Eq 1'e göre eq 6'nın yeniden düzenlenmesi:

figure-introduction-8654

Floresan korelasyon spektroskopisinde tipik kavrama göre, 7.

Daha sonra, dedektör dalgalanmaları nedeniyle varyans dedektör doygunluk sınırı nın altında çalıştırılır varsayımı altında, tespit yoğunluğunun doğrusal bir fonksiyonudur19:

figure-introduction-9046

Foton sayma dedektörleri durumunda a=1 ve c=0, böylece dedektör varyans ortalama yoğunluğuna eşittir:

figure-introduction-9272

Bu kavramları canlı hücrelerdeki gerçek ölçümlere uygulamak için Gratton ve meslektaşları18, her piksel için görünür parlaklığı, B'yi ortalama yoğunluk üzerinde varyans oranı olarak tanımlar:

figure-introduction-9594

B, deneysel olarak ölçülen parametredir. Bu çalışmada, HeLa hücrelerinin plazma zarındaki FGFR1 reseptörlerinin zaman serisi görüntüleri TIRF mikroskobu ile yakalanır ve ortalama parlaklık olan B, N&B analizi ile belirlenir. Daha sonra, FGF2 eklenmesinden sonra, ardışık zaman serileri kanonik ligand ile reseptör uyarılmasından sonra membran yüzeyinde reseptör moleküllerinin kendi kendine montaj değişiklikleri takip yakalanır.

Ancak, TIRF mikroskobu dedektörü bir EMCCD kamera olduğundan, görünür parlaklık için ifade19olarak değiştirilmesi gerekir:

figure-introduction-10306

ofset dedektör ayarlarının bir özelliğidir algılama elektroniği yoğunluğu ofset nerede. Bir analog dedektör için varyans ve ortalama yoğunluğu sırasıyla tarafından verilir:

figure-introduction-10595

nerede G dijital düzeylerde analog kazanç (DL / foton), S, foton başına dijital düzeyleri19, sabit yoğunluğu (hiçbir zamansal dalgalanmalar) ile bir ışık kaynağı için bir yoğunluk karşı varyans arsa eğimi tarafından verilir. Γ faktörü piksel algılama hacminin şekli ile ilgilidir. Hassler ve ark.32'yegöre γ faktörü, algılama kamerası19'unmaksimum kazancıyla çalışan TIRF görüntülemeiçin 0,3'e eşittir. Ofset, S ve G parametreleri kamera ve mikroskop özellikleridir. Görünür parlaklık, B, eq 11 eq 12 ve 13 göre yeniden düzenlenmesi ile elde edilir:

figure-introduction-11333

Deneysel olarak, ε lazer yoğunluğu ve sistemin algılama verimliliği karmaşık bir fonksiyonudur. Bununla birlikte, B/S doğrusal olarak ε'ya bağlı olduğundan, yalnızca belirli bir algılama modu için ε'nin göreli değerini belirlemek önemlidir:

figure-introduction-11680

ε' ile orantılı dır. Yine de, bir kalibrasyon dahili bir başvuru kullanılarak gerçekleştirilir.

Protokol

1. Örnek Hazırlama

  1. Birinci gün. Cam dipli yemeklerde 100.000-200.000 hücre/mL konsantrasyonda tam ortamda Tohum HeLa hücreleri. Tohum 6-8 çoğaltmak yemekleri.
    NOT: Bu örnekte ortam %10 ısı inaktive Fetal Sığır Serumu (FBS), 1 mM sodyum pirüuvat, 100 U/100 μg penisilin/streptomisin ile desteklenmektedir. Birkaç çoğaltma yemekleri hazırlanır.
  2. 2-3. gün. Hücreler alt-fluency olduğunda, protein plazmid ile yemeklerin yarısını transfect ve referans plazmidler ile ikinci yarısında (monomer ve dimer), serumsuz ortamda.
    NOT: Transfeksiyon, Fenol Kırmızısı olmadan antibiyotik, %0.1 Sığır Serum Albumin ve 25 mM HEPES tamponu ile takviye edilen serumsuz ortamda yapılır.
  3. 3-4. gün. Transfected hücrelerin bulaşıkların altına yapışıp yapışmadığını ve hücre zarının floresan olup olmadığını kontrol edin. Aşırı büyümüş hücreler le veya çok düşük floresan ile bulaşıkları atın.
    NOT: Hücrelerin büyümesine izin vermeyin. Hücreler iyi dağıtılmalı ve yemeğin cam alanına yapıştırılmalıdır(Şekil 1A). Precoated cam alt tabaklar hücre yapışması lehine kullanılabilir. Hücre kültürü herhangi bir deneyden önce mikoplazma kontaminasyonu için test edilir. Bu örnekte hücreler (A207K)mEGFP-FGFR1 plazmidi ile transfekte edilir ve referans hücreler standart protokoller kullanılarak GPI-(A207K)mEGFP ve GPI-(A207K)mEGFP plazmidleri ile transfekslenir. Canlı hücre mikroskobu için göstergesiz bir ortam önerilir; Görüntüleme sırasında pH değişikliklerini önlemek için 25 mM HEPES tamponu eklenir.

2. TIRF Görüntüleme — Lazer Hattının Hizalanması ve TIRF Aydınlatmasının Optimizasyonu

  1. Deneyden dört saat önce, mikroskobun sıcaklık inkübatörünü 37 °C'de aktif hale getirin.
  2. Mikroskobu, bilgisayarları ve kameraları açın ve kameraların uygun çalışma sıcaklığına ulaşmasını bekleyin.
    NOT: Bu çalışmada kullanılan kameranın çalışma sıcaklığı -75 °C'dir.
  3. Hedefe biraz damla yağ yerleştirin. Yerine örnek bir tabak koyun. Kuvöz kapılarını kapatın ve yemeğin sıcaklığının (~10 dk) dengelemasına izin verin.
  4. Epifloresan lambasını ve 488 nm lazeri açın.
  5. Örneği keşfetmek için epifloresan kontrast modunu seçin ve okülerden odaklanmak için bir hücreyi arayarak.
    NOT: Oküler yalak hücreleri aramak için bir floresan lamba kullanımı zorunlu değildir. Bunun yerine uygun bir lazer hattı kullanılabilir.
  6. Mikroskop kamerası (Band Pass Ex 490/20 (500) Band Pass Em 525/50 veya benzeri aracılığıyla yeşil emisyon toplamak için uygun filtreyi seçin.
  7. Epifloresan modunda gözden kamera portuna (Şekil 1'dekamera #1) geçin, odağı hassaslaştırın ve TIRF moduna geçin. Epifloresans ve TIRF modları mikroskobun markasına bağlı olarak farklı bir adlandırma ile adlandırılabilir.
    NOT: Coverslip arabiriminde floresan belirteçler yoksa lazeri odaklayan veya hizalayan sorunlar olabilir. Lazeri düzgün bir şekilde hizalamak için (iyi TIRF için gerekli), kapak kaymasına odaklanın. Genellikle kapak kayması odak olup olmadığını belirlemek çok zordur. Bir öneri olarak, hücrelerin kenarlarına odaklanın.
  8. TIRF mikroskobunun yönergelerini izleyerek otomatik hizalamayı etkinleştirin.
    NOT: Kısaca, 2.4'ten 2.8'e kadar olan adımlar için, önce hücreleri göz lerden geçirip üzerlerine odaklanın, sonra emisyonunu TIRF mikroskobunun kamera portuna gönderin, hücreleri mikroskop bilgisayar ekranındaki yeniden odaklayın ve lazer hizalama prosedürünü etkinleştirin. Hizalama, aydınlatmanın evanescent hale gelir kritik açı bulma oluşur (Şekil 3). Ticari mikroskoplar biraz farklı hizalama protokolleri olabilir ve aynı zamanda tam otomatik olabilir; diğerleri kritik açı koşullarının görselleştirilmesini kolaylaştırmak için küçük bir kamera olabilir.
  9. Uygun bir aydınlatma derinliği seçin ve evanescent alanın yönünü optimize (Şekil 3).
    NOT: Penetrasyon derinliği tüm kontroller ve numuneler için sabit tutulur.

3. TIRF Görüntüleme: Zaman Serisi yakalama

  1. En az 256 x 256 piksellik bir ilgi alanı (YG) tanımlayın.
    NOT: Bu kurulumda, yakalama doğrudan sadece kamera (Şekil 1 göstergebakınız) kontrol yazılım altında kamera #2 ile yapılır.
  2. 1 ms'e ve EM kazancına 1.000'e maruz kalma ayarlayın (bu 12 ve 13'teki G faktörüdür). Böyle bir hızda, lazer gücünü ayarlamak veya artırmak gerekebilir. Burada lazer gücü 0.5 mW'tır.
    NOT: Kameranın türüne ve proteinin difüzyon katsayısı, floresan şiddeti ve arka planının uyguladığı sınırlara bağlı olarak, lazer gücünü ayarlamak için genel kriterler dedektörü doygunluğa uymayacak, fotobeyaztlamayı en aza indirmek ve makul bir S/N'de mümkün olduğunca hızlı. EM kazancı her zaman kameranın maksimumuna ayarlanır (Bkz. Giriş).
  3. İlk koşullar altında ilk deneme sırasını çalıştırın ve S/N değerini kabaca tahmin edin. Koşullar, ilk kez serilerinin ilk karesinde ölçüldüğü gibi, S/N = 2-3 veya daha yüksek koşullarda kabul edilebilir.
  4. Görüntünün bir tarafını maskelemek için #2 mikroskoba bağlayan emisyon bölme sisteminin kaydırıcısını kullanın (Şekil 1B, Şekil 4A-B)
    NOT: Bu kurulumda aynı anda iki mekansal özdeş görüntü elde etmek için kamera #2 bir çok kanallı görüntüleme konektörü yüklenir. Sistem, farklı emisyon filtrelerinin montajı için kaydıraklarla donatılmıştır. Kaydırıcılardan biri, görüntünün bir tarafını örtmek için siyah bir maske bağlar. Maskeli alan, kamera parametrelerini belirlemek için her zaman serisinin iç kalibrasyonu için kullanılır (eq. 12 ve eq. 13). Bu şekilde bağımsız bir kalibrasyon adımına gerek yoktur ve daha da önemlisi, kalibrasyon her zaman serisinin yakalanmasına paralel olarak gerçekleştirilir. Bu sistemin yokluğunda, kamera yayınlanan protokolleri uygulayarak kalibre edilebilir33.
  5. Kamera dosyası otomatik kaydetme seçeneğini seçin.
  6. Görüntü serisinin edinimini başlatın. En az 2 S/N oranında en az 700 kare edinin.
    NOT: Analiz için gerekli olan çerçeve sayısı, fotobeyazrlama ve verilerin dağılım örnek kararlılığına bağlıdır. Bu nedenle, her zaman serisinin kalitesi N & B analizi sırasında değerlendirilir.
  7. Mikroskop dışında çanak almadan, ligand ekleyin.
  8. Parlak floresan membranı olan bir hücre seçin ve kinetik çalıştırmanın ilk serisini hızlı bir şekilde başlatın.
    NOT: Ligand ilavesi hızlı bir şekilde yapılırsa, bu ilk yakalama ligand kinetik noktası = 0 zaman ayarlar. Yazılım yakalama tam saatini kaydeder.
  9. İkinci bir hücreyi arayın ve kinetik ikinci kez noktası elde.
    NOT: Nokta ziyaret rutinleri x,y,z motorize aşamaları ile donatılmış bazı mikroskoplarda mevcuttur. Bunlar hücre çanağı üzerinde birden fazla pozisyonun ezberlemesine izin verir ve farklı hücrelerdeki görüntü serileri arasında daha sabit bir zaman aralığı nın tutulmasına yardımcı olabilir.
  10. Kinetik çalıştırmanın her zaman noktası için yeni bir hücre yakalayın.
    NOT: Yakalama dan sonra, bir hücre kısmen fotobeyazrlanır ve yeniden görüntülenemez. Bu nedenle, kinetik birçok hücre, her biri farklı bir zaman noktasında yakalanan zaman serisi birleştirerek elde edilir.
  11. Her yeni yemek için, 2.3'ten 3.9'a kadar protokolü tekrarlayın.
    NOT: Referans yemekler için, aracın bir hacmi ekleyin (PBS% 0.01 sığır serum albumin ile birlikte) ligand için kullanılan eşdeğer.

4. Sayı & Parlaklık (N&B): Zaman Serisinin Kalite Kontrolü

  1. Dönüştürün ve kaydedin. TIFF kamera yazılımı (.sif dosyaları bu örnekte) ile elde edilen dosyaları.
  2. Ithalat. N & B grafik kullanıcı arayüzü (GUI) MATLAB etkinleştirerek analiz yazılımı rutin TIFF dosyaları.
    NOT: Özelleştirilmiş bir Matlab çalıştırılabilir N & B rutin burada kullanılır (Https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia N & B analizi). Bir içe aktarılan. TIFF dosyası, rutin ortalama yoğunluk görüntü oluşturur, ortalama yoğunluk profili ve seri kare kare incelenmesine olanak sağlar (Ek Şekil 1). Diğer yazılımlar N&B analizi için kullanılabilir (örneğin, SimFCS yazılımı).
  3. Ortalama yoğunluk profilinin %10'dan fazla fotobeyaztlama gösterdiği seriyi atın ve edinim sırasında belirgin bir hücre zarı bozulması veya çevirisi olan serileri atın.
  4. Belirgin bir şekilde odak dışı olan çerçeveleri kırpma.
    NOT: Kırpma aracı, görüntü serisi içinde tek veya birden çok kare atmak için yordamda uygulanır. Bu işlem, kare kare zaman kritik değil, piksel çalışma süresi (pozlama süresi) ise (Bkz. Tartışma) olduğundan izin verilir.
  5. Analiz için en az 500 zaman dilimi olan sadece serileri saklayın.

5. Sayı ve Parlaklık (N&B): Kamera Parametrelerinin Belirlenmesi (Ofset, σ ve S)

  1. Rutin Kalibrasyon Kamerasınıetkinleştirin.
  2. Dedektör gürültü bölgesinde en az 20 x 50 piksellik bir alan seçin (Şekil 4).
    NOT: Yordam değerlerin bir histogram ı (ayrıca Dijital Düzey, DL olarak tanımlanır) kaynaklanır ve Sıklık ve Dijital Düzeyler bir logaritma arsa döndürür.
  3. Günlük Frekansı ve Dijital düzey çiziminde, Gaussian'ı ve eğrinin doğrusal kısmını sınırlamak için doğrusal kırmızı imleci hareket ettirin.
    NOT: Kırmızı imleç eğrinin iki bölümünü böler ve kamera tepkisinin Gauss fonksiyonunun merkezi olan ofset dönen rutini etkinleştirir, Gaussian uyumunun σ'si ve kamera nın doğrusal kısmının eğimi olan S faktörü e (Şekil 4C-D).

6. Sayı ve Parlaklık (N&B): Seçili Alandaki B değerlerinin hesaplanması (YG)

  1. B tuşunu etkinleştirin.
    NOT: Bu eylem, ortalama yoğunluk görüntüsünü(Şekil 5, ilk sütun) ve her bir B değerinin görüntüdeki ilgili pikselle ilişkili olduğu B görüntüsünü oluşturur (Ek Şekil 1).
  2. Verilerin dağılımını azaltmak ve B-I histogramı(Şekil 5, ikinci sütun) oluşturmak için en az bir binning (2 2) uygulayın.
    NOT: B-I histogramı, görüntünün tüm piksellerinin B-değerlerinin piksel yoğunluğuna göre dağılımını temsil eder. Y = B/S; X =figure-protocol-10844 ( - ofset)/S (Ek Şekil 1 ve eq. 11 ve 15).
  3. Etkileşimli kare imleci kullanarak B-I histogramını inceleyin.
  4. Çözümleme için bir kare yg(Şekil 5, üçüncü sütun) seçin.
    NOT: İmleç, kare imleç alanı içinde seçilen pikselleri vurgulayarak ortalama yoğunluk görüntüsünde bir mobil maskeyi senkronize eder(Ek Şekil 1). Bu inceleme ile, çok düşük yoğunluklu arka plan ve alanları analiz dışında dışlamak mümkündür.
  5. Seçili YG'nin(Şekil 5, dördüncü sütun) B-haritasını oluşturun.
  6. Seçimle ilişkili B değerlerinin ASCII dosyasını kaydedin.
  7. Verilerin frekans dağılımını hesaplamak ve ortalama B değeri ± S.E(Şekil 5, beşinci sütun) elde etmek için ASCII dosyasını bir grafik yazılımına aktarın.
    NOT: Veriler homojen sayılsa, B-değerlerinin frekans dağılımı bir Gauss dağılımına yaklaşık olarak gelir.
  8. Kinetik çalıştırmanın her zaman noktasında figure-protocol-11952 her figure-protocol-12006 hücre için ortalama parlaklığı = - 1 [(sayım/molekül) ] her hücre için türetmek için 15 uygulayın. Verileri aşağıdakilere göre normalleştirin:
    figure-protocol-12202
    ligand ilavesinden sonra "t" zamanında ölçülen ortalama B değeri ve figure-protocol-12323 t=0 (ligand ilavesinden sonra 10-20 s) zamanda ölçülen ortalama B figure-protocol-12439 değeridir.
    NOT: Sonuçların normalleştirilmesi, farklı günlerde yapılan deneylerin doğrudan karşılaştırılmasına olanak sağlar. Lazer gücü ve teknik dalgalanmalar nedeniyle ölçülen parlaklıktaki farklılıkları telafi eder.
  9. Kinetik çalıştırmayı oluşturmak için Normalleştirilmiş Ortalama Parlaklık ve edinme süresini çizin (Şekil 6).

Sonuçlar

Aynı kültür çanamında tohumlanmış iki temsilci HeLa-mEGFP-FGFR1 hücresinin sonuçları Şekil 5 ve Ek Tablo 1'degösterilmiştir. İki hücre, FGF2 ligand'ın eklenmesinden sonra 0 dk(Şekil 5A, üst) ve 7 dk(Şekil 5A, alt) zamanda ele geçirildi.

Şekil 5

Tartışmalar

N & B hücre modeli ve etiketleme stratejisi seçiminde çeşitli önlemler gerektirir. Yalnızca görüntü yakalama süresi boyunca uygun şekilde yapışmış kalan canlı hücrelere uygulanabilir. Tüm hücre katı deplasman nedeniyle ekstra dalgalanmalar uygun görüntü restorasyon yaklaşımları ile ele alınabilir38. Ancak, genellikle bir hücre hareket ettiğinde, hücre zarı da deforme olur, ve yapı deformasyonu, büyük ekstra varyans üreten, membran proteinlerinin analizi için cid...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

CNIC, Ciencia Bakanlığı, Innovacion y Universidades ve Pro CNIC Vakfı tarafından desteklenir ve Severo Ochoa Mükemmellik Merkezi 'dir (SEV-2015-0505). Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (FEDER) "Una manera de hacer Europa" tarafından da destekliyoruz. UC Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, Uluslararası Kanser Araştırma Derneği (şimdi Dünya Çapında Kanser Araştırma olarak da bilinir) ve İtalya Sağlık Bakanlığı desteğini kabul eder. A.T., 2011-2012'de PV Bursu "Progetto Professionalità Ivano Becchi" ile yaptığı çalışmaları kısmen desteklediği için "Fondazione Banca del Monte di Lombardia"yı kabul etti.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimunSigma-Aldrich, St. Louis, MI, USAA7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPESGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA21063029Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX IGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA10566-016Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)Biowest, Nuaillé, FranceX0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, BrazilGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA1027010610% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishesMatTek, Ashland, MA, USAP35G-0.170-14-Cuncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad PrismGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cellsMillipore-Sigma ECACC, Darmstadt, GermanyCB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis softwareOxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UKThis camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routineUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spaindownload at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018bThe MathWorks, Inc. Natick, MA, USAdownload at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100xBiowhittaker Inc. Walkersville, MD, USALONZA 17-602Esupplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vectorUnit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, ItalyZamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vectorUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, SpainHellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vectorUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, SpainHellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2PeproTech EC, Ltd., London, UKLigand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCOThermoFisher Scientific113600701mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection ReagentMirusBio LLC, Madison, WI, USAMIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA25200056
Type F Immersion liquid 10 mLLeica Microsystems, Wetzlar, Germany11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)ThermoFisher ScientificAM26180.1% supplement for medium without phenol red used for transfections

Referanslar

  1. Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
  2. Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
  3. Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. Muscarinic receptor oligomerization. Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).
  4. Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
  5. Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
  6. Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
  7. Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
  8. Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
  9. Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
  10. Trussell, H. J., et al., Trussell, J., et al. . Academic Press Library in Signal Processing. 4, 3-9 (2014).
  11. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  12. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  13. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
  14. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  15. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  16. Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
  17. Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
  18. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  19. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  20. Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  21. Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
  22. Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
  23. Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047 (2016).
  24. Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
  25. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  26. Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
  27. Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
  28. Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
  29. Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
  30. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  31. Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
  32. Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
  33. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).
  34. Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
  35. Joubert, J., Sharma, D. Light microscopy digital imaging. Current Protocols in Cytometry. , (2011).
  36. Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
  37. Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).
  38. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  39. Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
  40. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
  41. Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
  42. Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 153Resept r k meleriN BSay ve Parlakl kmoment analiziprotein oligomerlerih cre zarTIRF mikroskobu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır