A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים את גישת ההדמיה לקביעת המצב oligomeric הממוצע של megfp-מתויג-קולטן מתויגים oligomeric הנגרמת על ידי ליגנד קשירה ממברנה פלזמה של תאים חיים. הפרוטוקול מבוסס על סך הכל מיקרוסקופ של השתקפות פנימית (TIRF) בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות (N & B).

Abstract

למרות החשיבות והייתה של הקולטן, שיטות מעטות ישימות לגילוי אירועים באשכולות ומדידת מידת הקיבוץ. כאן, אנו מתארים גישה להדמיה כדי לקבוע את המצב oligomeric הממוצע של mEGFP-מתויג-קולטן הומוקומפלקסי בקרום של תאים חיים. הפרוטוקול מבוסס על סך הכל מיקרוסקופ של השתקפות פנימית (TIRF) בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות (N & B). N & B היא שיטה דומה ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית (FCS) והיסטוגרמה ספירת פוטון (PCH), אשר מבוססים על ניתוח סטטיסטי של תנודות של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של fluorophores מפזרת פנימה והחוצה של תאורה אמצעי אחסון במהלך זמן התבוננות. בפרט, N & B הוא פישוט של PCH כדי להשיג מידע על המספר הממוצע של חלבונים בתערובות oligomeric. תנודות אינטנסיביות המוני מתוארים על ידי בהירות מולקולרית של fluorophore ואת המספר הממוצע של fluorophores בתוך עוצמת התאורה. כך, N & B רואה רק את הרגעים הראשונים והשני של התפלגות משרעת, כלומר, את העוצמה הממוצע ואת השונות. זה, באותו זמן, את הכוח והחולשה של השיטה. כי רק שני רגעים נחשבים, N & B לא יכול לקבוע את החלק הטוחנת של oligomers לא ידוע בתערובת, אבל זה רק מעריך את מצב oligomeriטיזציה הממוצע של התערובת. עם זאת, זה יכול להיות מיושם על סדרת זמן קטן יחסית (לעומת שיטות רגע אחר) של תמונות של תאים חיים על בסיס פיקסל על ידי פיקסל, פשוט על ידי ניטור תנודות הזמן של עוצמת הקרינה. זה מפחית את הזמן האפקטיבי לפיקסל לכמה מיקרו שניות, המאפשר רכישה בטווח הזמן של שניות לאלפיות השניה, אשר הכרחי עבור הקינטיקה מהירה של oligomerization. לבסוף, שטחי תאים גדולים כמו גם תאים תת סלולריים ניתן לחקור.

Introduction

אנו מתארים כולל השתקפות פנימית מספר ובהירות (TIRF-N & B) גישה להדמיה לקביעת מצב oligomeric הממוצע של מולקולות הקולטן בקרום פלזמה של תאים חיים, מכוון בקישור הרכבה הקולטן דינמיקה לתפקוד הביולוגי של החלבונים (איור 1).

עם ליגתאי ומחייב, קולטנים ליזום את האות תאיים התמרה האותות בהתאם הקונפורמציה שלהם, oligomerization, שיתוף הפוטנציאלי קולטנים והרכב קרום. למרות החשיבות והייתה של קולטן oligomerization, מוכר כאירוע מפתח באיתות סלולרי1,2,3,4,5,6, 7, כמה שיטות יכול לזהות אירועים באשכולות ולמדוד את מידת הניסויים באשכולות8,9. כרך קונפוקלית וקד (x, y ≈ 300 ננומטר, z ≈ 900 nm) הוא פתר מספיק להוכחת אינטראקציה מולקולרית וסטויכמטריה, גם לאחר אופטימיזציה על ידי אלגוריתמים שיקום התמונה10. הרכב התת-יחידתי של חלבון oligomers אינו ניתן לפענוח על בסיס מרחבי גרידא גם על ידי שיטות ברזולוציה גבוהה ב-x, y ברזולוציה של 20-70 ננומטר כגון PALM11, סטורם12, ו ההיסטד13. יתר על כן, הרזולוציה הטמפורלית שלהם (בסדר של דקות לכל תמונה) לא יכול לעקוב אחר הקינטיקה בטווח של שניות. מולקולה בודדת צעד הלבנת פותרת את סטויכיומטריה של oligomers חלבון רק אם הם משותק14.

אחת השיטות הרב-תכליתיות ביותר כדי למדוד צפיפות ו oligomerization של חלבונים מתויגים פלואורוסקופים בתוך תמונות בודדות היא התפלגות בעוצמה מרחבית ניתוח (SpIDA), אשר נשענת על דגימה מרחבית. הוא חל על תאים כימיים קבועים ולחיות, ומאפשר ניתוח של מספר אזורים של העניין של התא בו זמנית באמצעות מיקרוסקופ קרינה רגילה15. לחילופין, שיטות רגע, כגון ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית (fcs)16, היסטוגרמה לספירת פוטון (PCH)17, ומספר ובהירות (N & B)18,19, מתאימים לאולייומר כמותית דידות. שיטות אלה לנתח תנודות בעוצמה פלואורסצנטית כי ניתן להבחין בזמן כאשר fluorophores לפזר והחוצה של נפח התאורה. המוני התנודות באינטנסיביות ניתן לתאר באופן ייחודי על-ידי הבהירות המולקולרית של הזוהר (ε) והמספר הממוצע של fluorophores (n) בתוך כרך התאורה17 (איור 2). בדרך כלל, מקדם דיפוזיה של fluorophores ואת המספר הממוצע של מולקולות (הקשורים באופן הפוך לערך G (0) בתוך עוצמת התאורה ניתן להשיג על ידי FCS20. עם זאת, מאז זמן הדיפוזיה רק עם השורש העוקב של המסה, FCS אינו רגיש מספיק כדי לזהות שינויים במסה מולקולרית21. בפועל, לצבע אחד FCS אין אפשרות לזהות הדיסמזציה של קולטני הממברנה. PCH פותר תערובות של oligomers שונים במדויק. באמצעות יותר משני רגעים של התפלגות משרעת, הוא מזהה מולקולות של בהירות שונה התופסים את אותו נפח תאורה. סריקת FCS22 ופיתוחים, כגון מתאם זוג מעניין של בהירות מולקולרית (pcomb) גישה23, הציג כדי להאריך את מגוון הישימות של שיטות מתאם פלואורסצנטית במערכות ביולוגיות24 , השארו שיטות חד שונות חסרות יכולת של מדידות מהירות בשטח גדול של תא, הדורשות תצפיות רצופות רבות בכל פיקסל ורכישת נתונים בסדר השניות.

N & B הוא גרסה פשוטה של PCH הרואה רק את הרגעים הראשונים והשני של משרעת התפלגות הזריחה, כלומר את העוצמה ממוצע, < אני >, ואת השונות, σ2 (איור 2)18,19 ובגלל זה, זה לא יכול לקבוע את החלק הטוחנת של oligomers לא ידוע בתערובת, אבל רק מעריך את המצב הממוצע oligomeriטיזציה של התערובת. עם זאת, N & B יש את היתרון של עבודה עם סדרת זמן קטן יחסית של תמונות של תאים חיים מאשר PCH על בסיס פיקסל על ידי פיקסל, פשוט על ידי ניטור תנודות בזמן של עוצמת הקרינה. כיוון ש-N & B מפחית את הזמן בפיקסל למספר מיקרו-שניות, הוא יכול לעקוב אחר מהירות הקינטיקה המנותרת באזורי תאים גדולים, ולאפשר רכישת תמונה בסרגל זמן של שניות במיקרוסקופ סריקת רסטר (למשל, confocal וקד, 2-פוטון) ואלפיות השניה במיקרוסקופיה המבוססת על מצלמה (למשל, TIRFM).

מספר דוחות הפגינו את היכולת של N & B כדי לכמת את מספר יחידות המשנה באשכולות חלבונים על-ידי הדמיה של אזורי תאים מורחבים. אשכולות פעבלין-EGFP זוהו באתרי הדבקה ב-CHO-K1 תאים25, והצבירה התאיים של הפפטיד Httex1p הפתוגניים תוארה ב-COS-7 תאים26. N & B הוחל לאחר oligomerization מונחה ליגאן של הקולטן ErbB27, ואת ההשפעה של ליגFGF21 על קלותוב (klb) ו FGFR1c בתאי הלה28. השילוב של הדמיה TIRF ו-N & B ניתוח שימש כדי להראות כי דינמיות ב-2 היא בעיקר tetrameric לאורך כל קרום התא29. החלתי N & B לשני סריקת רסטר ותמונות tirf להוכיח dimerization מונחה ליגור של upar ו FGFR1 תא קולטנים קרום30,31.

שיטות מתאם פלואורסצנטית, כגון N & B, FCS ו-PCH, מבוססות על הרעיון שבנפח פתוח מספר הכיבוש של החלקיקים עוקב אחר התפלגות פואסון. כי רק את הפוטונים כי פולטות fluorophores ניתן להבחין, ערך ממוצע של עוצמת הזריחה נמדד לעומת הזמן בפיקסל של התמונה figure-introduction-5196 ,, הוא התוצר של המספר הממוצע של fluorophores נפח התאורה, n, ואת ה בהירות מולקולרית, ε17:

figure-introduction-5392

כאשר ε מבוטא כמספר הפוטונים הנפלטים ליחידת זמן (מקובל לשניה) לכל מולקולה כאשר המולקולה נמצאת במרכז עוצמת התאורה.

בהירות היא תכונה של כל fluorophore ברכישה נתונה להגדיר, בעוד האינטנסיביות הוא הסכום של כל התרומות מכל fluorophores. בתחרויות ביולוגיות, הבהירות יגדל עם הגידול של מספר fluorophores המתאחד יחד, נותן מידע על המצב oligomerization של חלבון fluoresc, מתויג. מגביר תנודות בפיקסל נתון נמדד מן השונות של האות הפלואורסצנטית, σ2:

figure-introduction-5968

כאשר המשמעות של ריבוע העוצמה figure-introduction-6074 , והריבוע של העוצמה figure-introduction-6149 , מחושבים מערכי העוצמה האינדיווידואליים בכל פיקסל בכל מסגרת:

figure-introduction-6293

כאשר K הוא מספר המסגרות הכוללות בסידרת הזמן. ניסויים, יש צורך לחשב עבור סדרת התמונות כולה את השונות המתארת את פיזור ערכי העוצמה הבודדת בכל פיקסל של תמונה אחת סביב ערך העוצמה הממוצע. השונות כוללת את כל התנודות במקורות שונים. בקירוב ראשון, השונות הנובעת מהחלקיקים הניתנים לפיזור בעוצמת התאורה, σ20, יכולה להיות מופרדת מן השונות עקב רעש שוט הגלאי, σ2ד. שני השונויות הן עצמאיות; לפיכך, השונות הכוללת ניתנת על-ידי הסכום שלהם:

figure-introduction-6872

השונות, עקב תנודות מולקולריות של עוצמת האיתור והיציאה, תלויה בצורה לינארית בבהירות ובעוצמה המולקולרית:

figure-introduction-7080

מסידור מחודש של eq 6 לפי eq .1:

figure-introduction-7217

על פי המושג האופייני ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית, משוואה 7 קובעת כי השונות בשל מספר התנודות תלויה בריבוע של בהירות החלקיקים.

לאחר מכן, השונות עקב תנודות גלאי היא פונקציה קווית של העוצמה שזוהתה, תחת ההנחה כי הגלאי מופעל מתחת למגבלת הרוויה שלה19:

figure-introduction-7623

במקרה של גלאים של ספירת פוטון a= 1 ו- c= 0, ולכן שונות הגלאי שווה לעוצמה הממוצעת:

figure-introduction-7829

כדי להחיל מושגים אלה על מדידות אמיתיות בתאים חיים, Gratton ועמיתים18 להגדיר את הבהירות לכאורה, B, עבור כל פיקסל כיחס של שונות על העוצמה הממוצעת:

figure-introduction-8104

B הוא הפרמטר הנמדד באמצעות הניסויים. בעבודה זו, סדרת הזמן תמונות של קולטני FGFR1 בקרום פלזמה של תאי הלה נלכדים על ידי מיקרוסקופ TIRF ואת הבהירות לכאורה הממוצעת, B, נקבעת על ידי ניתוח N & B. לאחר מכן, לאחר הוספת FGF2, סדרת הזמן ברציפות נלכדים לבצע את השינויים העצמית הרכבה של מולקולות הקולטן במשטח הקרום לאחר גירוי של הקולטן עם ligand קאנוני.

עם זאת, מאז גלאי המיקרוסקופ TIRF הוא מצלמה EMCCD, הביטוי לבהירות לכאורה צריך להיות שונה19:

figure-introduction-8696

כאשר היסט הוא היסט האינטנסיביות של האלקטרוניקה לאיתור שהוא מאפיין של הגדרות הגלאי. השונות והעוצמה הממוצעת עבור גלאי אנלוגי ניתנות בהתאמה על-ידי:

figure-introduction-8957

כאשר G הוא רווח אנלוגי ברמות דיגיטליות (DL/פוטונים), S, הרמות הדיגיטליות לכל פוטון19, ניתנת על ידי השיפוע של עוצמה לעומת מזימה שונות עבור מקור אור עם עוצמה מתמדת (אין תנודות בזמן). הפקטור הγ קשור לצורה של אמצעי האחסון לזיהוי פיקסלים. לדברי האסלר ואח '32, הפקטור γ שווה 0.3 עבור הדמיה tirf עבודה ברווח המקסימלי של מצלמת האיתור19. היסט, S ו-G פרמטרים הם מאפיינים של המצלמה ואת המיקרוסקופ. הבהירות לכאורה, B, מתקבלת על ידי סידור משנה של eq. 11 לפי eq .12 ו -13:

figure-introduction-9604

ניסויים, ε היא פונקציה מורכבת של עוצמת לייזר ויעילות הזיהוי של המערכת. עם זאת, מאחר ש-B/S תלוי באופן ליניארי ב ε, חשוב רק לקבוע את הערך היחסי של ε עבור מצב זיהוי נתון:

figure-introduction-9878

כאשר ε ' הוא פרופורציונלי לε. עדיין, כיול מבוצע באמצעות הפניה פנימית.

Protocol

1. הכנה לדוגמא

  1. . היום הראשון זרעים הלה התאים בינוני מלא בריכוז של 100,000-200000 cell/mL במנות התחתון זכוכית. . זרע 6-8 משכפל מנות
    הערה: בדוגמה זו, המדיום הוא שיושלם עם 10% חום בלתי מופעל סרום שור העוברי (FBS), 1 mM נתרן פירובט, 100 U/100 μg פניצילין/סטרפטומיצין. מספר מנות שכפול מוכנות.
  2. . היום 2-3 כאשר התאים הם בשטף משנה, מחצית מנות הכלים עם הפלסמיד החלבון והמחצית השנייה עם התייחסות פלמידים (מונומר ו dimer), במדיום ללא סרום.
    הערה: החצייה מורכבת מסרום בינוני בחינם בתוספת אנטיביוטיקה, 0.1% מאגר העור של סרום והוא 25 מ"מ, ללא פנול אדום.
  3. . היום 3-4 בדוק כי תאים מזוהמים הם מחסיד לתחתית הכלים ואת קרום התא הוא פלורסנט. התעלם מכלים עם תאים מגודלים או עם זריחה נמוכה מאוד.
    הערה: אל תתנו לתאים לצמוח יותר מדי. התאים חייבים להיות מבוזרים היטב ולהיות מדבקה לאזור הזכוכית של המנה (איור 1א). מנות זכוכית מצופות מראש ניתן להשתמש כדי להעדיף הדבקה תא. תרבות התא נבדקת לזיהום mycoplasma לפני כל ניסוי. בדוגמה זו, תאים מצוידים עם a (A207K) mEGFP-FGFR1 פלמיד ואת התאים התייחסות הם מזוהמים עם GPI-(A207K) mEGFP ו GPI-(A207K) mEGFP-(A207K) ממגה פלמידים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. עבור מיקרוסקופ תאים חי, מומלץ מדיום נטול מחוון; מאגר HEPES 25 מ"מ נוסף כדי למנוע שינויי pH במהלך ההדמיה.

2. הדמיה TIRF – יישור קו הלייזר ואופטימיזציה של תאורה TIRF

  1. 4 שעות לפני הניסוי, להפעיל את החממה טמפרטורה של המיקרוסקופ ב 37 ° c.
  2. הפעל את המיקרוסקופ, מחשבים ומצלמות ולחכות המצלמות להגיע לטמפרטורת העבודה הנכונה.
    הערה: טמפרטורת העבודה של המצלמה המשמשת במחקר זה היא-75 ° c.
  3. הניחו טיפת שמן קטנה על המטרה. . שים צלחת דגימה במקומה סגרו את דלתות החממה והרשו לטמפרטורת המנה להיות מעורפלת (~ 10 דקות).
  4. הפעל את המנורה האפינטית ואת לייזר 488 ננומטר.
  5. בחר במצב ניגודיות אפיפלואורסצנטית כדי לחקור את המדגם, חיפוש בתא כדי להתמקד מן העינית.
    הערה: השימוש במנורה פלורסנט לחיפוש שוקת בתאי העינית אינה חובה. במקום זאת ניתן להשתמש בקו לייזר מתאים.
  6. בחר את המסנן המתאים לאיסוף הפליטה הירוקה דרך מצלמת המיקרוסקופ (הלהקה Pass לשעבר 490/20 (500) הלהקה להעביר Em 525/50, או דומה.
  7. לעבור מתוך העינית ליציאת המצלמה (המצלמה #1 באיור 1) במצב epiפלואורסצנטית, למקד את המוקד ולשנות למצב tirf. מצבי מסוג אפיטאין ומצב TIRF עשויים להיות בעלי שם עם מינוח שונה בהתאם למותג של המיקרוסקופ.
    הערה: ייתכנו בעיות התמקדות או יישור לייזר אם אין סמנים פלורסנט בממשק coverslip. כדי ליישר את הלייזר כראוי (חיוני עבור TIRF טוב), להתמקד על coverslip. לעתים קרובות קשה מאוד לקבוע אם הcoverslip בפוקוס. כהצעה, התמקד בקצות התאים.
  8. הפעל את היישור האוטומטי בעקבות הוראות מיקרוסקופ TIRF.
    הערה: בקצרה, עבור צעדים מ 2.4 כדי 2.8, תחילה למצוא את התאים דרך העינית ולהתמקד בהם, ולאחר מכן לשלוח את הפליטה ליציאת המצלמה של מיקרוסקופ TIRF, למקד מחדש את התאים על מסך המחשב במיקרוסקופ ולהפעיל את ההליך עבור יישור לייזר. היישור מורכב ממציאת הזווית הקריטית שבה התאורה הופכת לאוונהאור (איור 3). מיקרוסקופים מסחריים עשויים להיות בעלי פרוטוקולי יישור שונים במקצת וגם להיות אוטומטיים לחלוטין; אחרים עשויים להיות מצלמה קטנה להקלה על ויזואליזציה של תנאי זווית קריטית.
  9. בחרו עומק תאורה מתאים ומטב את כיוון שדה האוונ, (איור 3).
    הערה: עומק החדירה נשמר קבוע עבור כל הפקדים והדגימות.

3. הדמיה TIRF: לכידת סדרת הזמן

  1. הגדר אזור מעניין (ROI) של לפחות 256 x 256 פיקסלים.
    הערה: בהגדרה זו, הלכידה מתבצעת עם #2 המצלמה תחת תוכנה השולטת ישירות על המצלמה (ראה איור 1 מקרא).
  2. הגדר את החשיפה ל-1 אלפיות הראשונה ול1,000 EM (מדובר בפקטור G ב-eq .12 ו-13). במהירות כזו, ייתכן שיהיה צורך לכוונן או להגדיל את כוח הלייזר. כאן כוח לייזר הוא 0.5 mW.
    הערה: בהתאם לסוג של המצלמה ואת המגבלות המוטלות על ידי מקדם דיפוזיה של החלבון, העוצמה הפלואורסצנטית והרקע, הקריטריונים הכלליים לקביעת כוח הלייזר הם לא להרוות את הגלאי, למזער את הלבנת התמונות, וללכוד כמו מהיר ככל האפשר ב-S סבירים/N. הרווח ה-EM מוגדר תמיד למקסימום של המצלמה (ראה מבוא).
  3. הפעל רצף ניסיון ראשון תחת תנאים ראשוניים והערכת ערך S/N בערך. התנאים מקובלים ב-S/N = 2-3 או יותר, כפי שנמדד במסגרת הראשונה של סדרת הזמן הראשונה.
  4. השתמש במחוון של מערכת הפליטה פיצול מצלמה המחבר #2 למיקרוסקופ עבור המסיכה של צד של התמונה (איור 1B, איור 4א-ב)
    הערה: בהגדרה זו מחבר הדמיה רב-ערוצית מותקן במצלמה #2 כדי לאפשר רכישה של שתי תמונות זהות בו. המערכת מצוידת בשקופיות להרכבת מסנני פליטה שונים. אחד המחוונים טוען מסיכה שחורה כדי לכסות צד של התמונה. האזור עם המסיכה משמש לכיול הפנימי של כל סדרת הזמן, כדי לקבוע את פרמטרי המצלמה (eq .12 ו-eq .13). בדרך זו אין צורך בצעד כיול עצמאי, וחשוב מכך, כיול מבוצע במקביל ללכידת כל סדרת הזמן. בהעדר מערכת זו, ניתן לכייל את המצלמה להחלת פרוטוקולים שפורסמו33.
  5. בחר את אפשרות השמירה האוטומטית של קובץ המצלמה.
  6. התחל את הרכישה של סדרת התמונות. השג מינימום של 700 מסגרות ביחס S/N מינימלי של 2.
    הערה: מספר המסגרות הנחוצות לניתוח תלוי ביציבות המדגם לפוטולבנת ובפיזור הנתונים. לכן, האיכות של כל סדרת זמן מוערך במהלך ניתוח N & B.
  7. , בלי להוציא את הצלחת ממיקרוסקופ. הוסיפו את הליגורק
  8. בחר תא עם קרום זריחה בהיר במהירות להתחיל את סדרת הפעם הראשונה של הפעלה קינטית.
    הערה: אם התוספת של הליומתבצעת במהירות, הלכידה הראשונה מגדירה את הנקודה = 0 זמן של ליגו הקינטיקה. התוכנה רושמת את הזמן המדויק של הלכידה.
  9. חיפוש תא שני ולרכוש את נקודת הזמן השנייה של הקינטיקה.
    הערה: רוטינות ביקור נקודה זמינות בכמה מיקרוסקופים מצויד x, y, z בשלבים ממונעים. אלה מאפשרים שינון של תפקידים מרובים על צלחת התא, והוא יכול לעזור לשמור על מרווח קבוע יותר של זמן בין סדרת תמונות על תאים שונים.
  10. לכוד תא חדש לכל נקודת זמן של הפעלה קינטית.
    הערה: לאחר הלכידה, תא מולבן באופן חלקי ואינו ניתן לדימות מחדש. בגלל זה, הקינטיקה מושגת על ידי שילוב של סדרת הזמן של תאים רבים, כל אחד נלכד בנקודת זמן שונה.
  11. עבור כל מנה חדשה, חזור על הפרוטוקול משלב 2.3 עד 3.9.
    הערה: לקבלת מנות התייחסות, להוסיף נפח של הרכב (PBS בתוספת עם 0.01% בסרום פרה אלבומין) שווה ערך לזה המשמש את ligand.

4. מספר & בהירות (N & B): בדיקת איכות של סדרת הזמן

  1. המר ושמור בשם. TIFF הקבצים שנרכשו עם תוכנת המצלמה (קבצי. sif בדוגמה זו).
  2. ייבוא. קובצי TIFF בשגרת תוכנת הניתוח על-ידי הפעלת ממשק המשתמש הגרפי N & B (GUI) MATLAB.
    הערה: משתמשים כאן בMatlab הפעלה מותאמת אישית N & B שגרה כאן (ניתוח N & B ב-https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). על-ידי פתיחת מיובא. TIFF, השגרה יוצרת את תמונת העוצמה הממוצעת, פרופיל העוצמה הממוצע, והיא מאפשרת בדיקה על הסדרה מסגרת אחר מסגרת (איור משלים 1). תוכנות אחרות זמינות לניתוח N & B (לדוגמה, תוכנת SimFCS).
  3. השמט סדרה שפרופיל העוצמה הממוצעת מציג יותר מ-10% photobleaching לבנה, והסדרה שבה היתה עיוות תא בולט או תרגום ממברנה במהלך הרכישה.
  4. חיתוך מסגרות שאינן מתמקדות בעליל.
    הערה: כלי חיתוך מיושם בשגרה כדי לוחק מסגרות בודדות או מרובות בתוך סדרת התמונות. פעולה זו מותרת מכיוון שזמן מסגרת למסגרת אינו קריטי בעוד שזמן השימוש בפיקסל (זמן חשיפה) הוא (ראה דיון).
  5. לשמור על הניתוח רק סדרה עם לפחות 500 מסגרות זמן.

5. מספר & בהירות (N & B): קביעת פרמטרי המצלמה (היסט, σ ו-S)

  1. הפעל את מצלמת כיולהשגרה.
  2. בחר שטח של לפחות 20 x 50 פיקסלים באזור הרעש של הגלאי (איור 4).
    הערה: השגרה מקורו בהיסטוגרמה של הערכים (הוגדרה גם ' רמה דיגיטלית ', DL) ומחזירה מגרש לוגריתם בתדר לעומת רמות דיגיטליות.
  3. בתדר יומן הרישום לעומת מגרש ברמה הדיגיטלית, הזז את הסמן האדום הליניארי כדי להפריד את התרשים הגאוסיאני והחלק הליניארי של העקומה.
    הערה: הסמן האדום מחלק את שני החלקים של העקומה, ומפעיל את השגרה המחזירה את ההיסט, המהווה את מרכז הפונקציה הגאוסיאנית של תגובת המצלמה, את הσ של ההתאמה הגאוסיאנית ואת הפקטור S, שהוא השיפוע של החלק הליניארי של המצלמה e (איור 4C-D).

6. מספר & בהירות (N & B): חישוב ערכי B באזור נבחר-of-הריבית (ROI)

  1. הפעל את מקש B .
    הערה: פעולה זו יוצרת את תמונת העוצמה הממוצעת (איור 5, עמודה ראשונה) ותמונת B שבה כל ערך b משויך לפיקסל הקשור בתמונה (איור משלים 1).
  2. החל מינימום (2 2) כדי להקטין את פיזור הנתונים וכלה בהפקת היסטוגרמה B-I (איור 5, עמודה שנייה).
    הערה: ההיסטוגרמה B-I מייצגת את התפלגות ערכי B של כל הפיקסלים בתמונה לעומת עוצמת הפיקסל. Y = B/S; X = (figure-protocol-8899 -היסט)/S (איור משלים 1 ו-eq .11 ו -15).
  3. בדוק את ההיסטוגרמה B-I באמצעות הסמן הריבועי האינטראקטיבי.
  4. בחר ROI מרובע עבור הניתוח (איור 5, עמודה שלישית).
    הערה: הסמן מסנכרן מסיכה ניידת על תמונת העוצמה הממוצעת, הדגשת הפיקסלים שנבחרו בתוך אזור הסמן המרובע (איור משלים 1). בבדיקה זו, ניתן להוציא מהניתוח את הרקע והאזורים בעוצמה נמוכה מאוד.
  5. צור את ה-B-map של ה-ROI הנבחר (איור 5, עמודה רביעית).
  6. שמור את קובץ ה-ASCII של ערכי B המשויכים לבחירה.
  7. יבא את קובץ ה-ASCII בתוכנה גרפית כדי לחשב את התפלגות התדירות של הנתונים ולקבל את הממוצע B-value ± S. E (איור 5, העמודה החמישית).
    הערה: אם הנתונים הם הומוגניות, התפלגות התדירות של ערכי B מקירוב התפלגות גאוסיאנית.
  8. החל את eq. 15 כדי להפיק את figure-protocol-9850 הבהירות הממוצעת = figure-protocol-9918 -1 [(ספירות/מולקולה) לכל תא בזמן הריצה הקינטית. נרמל את הנתונים בהתאם ל:
    figure-protocol-10044
    כאשר figure-protocol-10102 הוא ערך b-value הממוצע הנמדד בזמן "t" לאחר התוספת, והוא figure-protocol-10208 ערך b-value הממוצע הנמדד בזמן t = 0 (10-20 s לאחר התוספת).
    הערה: הנורמליזציה של התוצאות מאפשרת השוואה ישירה בין הניסויים שבוצעו בימים שונים. היא מפצה על הבדלים בבהירות נמדד עקב כוח לייזר ותנודות טכניות.
  9. התווה את הבהירות הממוצעת המנורמלת לעומת זמן הרכישה כדי לבנות את ההפעלה הקינטית (איור 6).

תוצאות

התוצאות עבור שני תאים מייצגים הלה-mEGFP-FGFR1 שנזרע באותה צלחת תרבות מוצגים באיור 5 ו טבלה משלימה 1. שני התאים נלכדו בזמן 0 דקות (איור 5א, למעלה) ו -7 דקות (איור 5א, למטה) לאחר הוספת FGF2 ligand.

Discussion

N & B דורש מספר אמצעי זהירות בבחירת דגם התא ואסטרטגיית התוויות. ניתן להחיל אותו רק על תאים חיים שנשארים ללא הפסק בזמן לכידת התמונה. תנודות נוספות בשל העקירה הנוקשה של התא כולו עשוי להיות מטופל עם גישות שחזור התמונה המתאים38. עם זאת, בדרך כלל כאשר התא זז, קרום התא גם deforms, ואת מבנה דפ...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

CNIC נתמך על ידי משרד של Ciencia, מרכז האוניברסיטה והקרן הפרו CNIC, והוא המרכז המרכזי של אוצ'ואה מצוינות (צב-2015-0505). אנחנו גם נתמכים על ידי הקרן האירופית לפיתוח האזור (פדר) "אונה סון נרה דה האג אירופה". אוניברסיטת קליפורניה מכירה בתמיכה של האגודה לחקר הסרטן הבינלאומי (הידוע כיום כ מחקר הסרטן העולמי), ומשרד הבריאות האיטלקי. א. ש. מכירה בעמותת "פוננדאלקה דל מונטה די לומברדיה" לתמיכה חלקית בעבודתו עם מלגת PV "המקצוענים בצ" 2011-2012.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimunSigma-Aldrich, St. Louis, MI, USAA7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPESGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA21063029Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX IGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA10566-016Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)Biowest, Nuaillé, FranceX0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, BrazilGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA1027010610% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishesMatTek, Ashland, MA, USAP35G-0.170-14-Cuncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad PrismGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cellsMillipore-Sigma ECACC, Darmstadt, GermanyCB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis softwareOxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UKThis camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routineUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spaindownload at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018bThe MathWorks, Inc. Natick, MA, USAdownload at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100xBiowhittaker Inc. Walkersville, MD, USALONZA 17-602Esupplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vectorUnit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, ItalyZamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vectorUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, SpainHellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vectorUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, SpainHellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2PeproTech EC, Ltd., London, UKLigand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCOThermoFisher Scientific113600701mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection ReagentMirusBio LLC, Madison, WI, USAMIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA25200056
Type F Immersion liquid 10 mLLeica Microsystems, Wetzlar, Germany11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)ThermoFisher ScientificAM26180.1% supplement for medium without phenol red used for transfections

References

  1. Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
  2. Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
  3. Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. Muscarinic receptor oligomerization. Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).
  4. Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
  5. Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
  6. Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
  7. Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
  8. Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
  9. Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
  10. Trussell, H. J., et al., Trussell, J., et al. . Academic Press Library in Signal Processing. 4, 3-9 (2014).
  11. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  12. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  13. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
  14. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  15. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  16. Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
  17. Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
  18. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  19. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  20. Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  21. Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
  22. Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
  23. Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047 (2016).
  24. Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
  25. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  26. Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
  27. Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
  28. Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
  29. Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
  30. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  31. Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
  32. Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
  33. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).
  34. Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
  35. Joubert, J., Sharma, D. Light microscopy digital imaging. Current Protocols in Cytometry. , (2011).
  36. Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
  37. Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).
  38. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  39. Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
  40. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
  41. Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
  42. Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

153N BoligomersTIRF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved