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Describimos un enfoque de imagen para la determinación del estado oligomérico promedio de los oligómeros receptores etiquetados con mEGFP inducidos por la unión de ligandos en la membrana plasmática de las células vivas. El protocolo se basa en la microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total (TIRF) combinada con el análisis Número y Brillo (N&B).
A pesar de la importancia y la ubicuidad de la oligomerización de receptores, pocos métodos son aplicables para detectar eventos de agrupación en clústeres y medir el grado de agrupación en clústeres. Aquí, describimos un enfoque de imagen para determinar el estado oligomérico promedio de los homocomplejos de receptores etiquetados con mEGFP en la membrana de las células vivas. El protocolo se basa en la microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total (TIRF) combinada con el análisis Número y Brillo (N&B). N&B es un método similar a la espectroscopia de fluorescencia-correlación (FCS) y el histograma de recuento de fotones (PCH), que se basan en el análisis estadístico de las fluctuaciones de la intensidad de fluorescencia de los fluoróforos que se difunden dentro y fuera de una iluminación volumen durante un tiempo de observación. En particular, N&B es una simplificación de PCH para obtener información sobre el número medio de proteínas en mezclas oligoméricas. Las amplitudes de fluctuación de intensidad se describen por el brillo molecular del fluoróforo y el número medio de fluoróforos dentro del volumen de iluminación. Por lo tanto, N&B considera sólo el primer y segundo momento de la distribución de amplitud, a saber, la intensidad media y la varianza. Esta es, al mismo tiempo, la fuerza y la debilidad del método. Debido a que sólo se consideran dos momentos, N&B no puede determinar la fracción molar de los oligómeros desconocidos en una mezcla, pero sólo estima el estado medio de oligomerización de la mezcla. Sin embargo, se puede aplicar a series temporales relativamente pequeñas (en comparación con otros métodos de momento) de imágenes de células en vivo píxel por píxel, simplemente monitoreando las fluctuaciones de tiempo de la intensidad de la fluorescencia. Reduce el tiempo efectivo por píxel a unos pocos microsegundos, lo que permite la adquisición en el intervalo de tiempo de segundos a milisegundos, lo que es necesario para la cinética de oligomerización rápida. Por último, se pueden explorar grandes áreas celulares, así como compartimentos subcelulares.
Describimos un enfoque de imagen de Fluorescencia-Número de Fluorescencia Y Brillo de Reflexión Interna Total (TIRF-N&B) para determinar el estado oligomérico promedio de las moléculas receptoras en la membrana plasmática de las células vivas, con el objetivo de vincular el conjunto del receptor dinámica a la función biológica de las proteínas (Figura 1).
Tras la unión de ligandoextra extracelular, los receptores inician la transducción de la señal intracelular dependiendo de su conformación, oligomerización, posibles coreceptores y composición de la membrana. A pesar de la importancia y ubicuidad de la oligomerización de receptores, reconocido como un evento clave en la señalización celular1,2,3,4,5,6, 7, pocos métodos pueden detectar eventos de agrupación en clústeres y medir el grado de agrupación en clústeres experimentalmente8,9. El volumen confocal (x,y a 300 nm, z a 900 nm) no está suficientemente resuelto para probar la interacción molecular y la estequiometría, incluso después de la optimización por algoritmos de restauración de imágenes10. La composición de la subunidad de los oligómeros proteicos no puede resolverse sobre una base puramente espacial incluso mediante métodos de superresolución a resolución x,y de 20-70 nm como PALM11,STORM12y STED13. Además, su resolución temporal (en el orden de minutos por imagen) no puede seguir la cinética en el rango de segundos. El blanqueamiento escalonado de una sola molécula resuelve la estequiometría de los oligómeros proteicos sólo si están inmóviles14.
Uno de los métodos más versátiles para medir la densidad y el oligomerización de proteínas etiquetadas fluorescentes dentro de imágenes individuales es el análisis de distribución de intensidad espacial (SpIDA), que se basa en el muestreo espacial. Es aplicable tanto a células químicamente fijas como vivas, y permite el análisis de varias regiones de interés de la célula simultáneamente utilizando la microscopía de fluorescencia estándar15. Alternativamente, los métodos de momento, tales como espectroscopia de fluorescencia-correlación (FCS)16, histograma de recuento de fotones (PCH)17,y Número y brillo (N&B)18,19, son adecuados para el oligomer cuantitativo Medidas. Estos métodos analizan las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia que se pueden observar en el tiempo cuando los fluoróforos se difunden dentro y fuera de un volumen de iluminación. Las amplitudes de las fluctuaciones de intensidad pueden describirse de forma única por el brillo molecular del fluoróforo y el número medio de fluoróforos (n) dentro del volumen de iluminación17 (Figura 2). Típicamente, el coeficiente de difusión de los fluoróforos y el número medio de moléculas (inversamente relacionadas con el valor G(0)) dentro del volumen de iluminación se pueden obtener por FCS20. Sin embargo, dado que el tiempo de difusión sólo se escala con la raíz cúbica de la masa, el FCS no es lo suficientemente sensible para detectar cambios en la masa molecular21. En la práctica, fcS de un solo color no puede detectar la dimerización de los receptores de membrana. PCH resuelve mezclas de diferentes oligómeros con precisión. Utilizando más de dos momentos de la distribución de amplitud, detecta moléculas de diferente brillo que ocupan el mismo volumen de iluminación. Escaneando FCS22 y desarrollos, como la interesante correlación par del enfoque23del brillo molecular (pCOMB), introducido para ampliar el rango de aplicabilidad de los métodos de correlación de fluorescencia en los sistemas biológicos24 , siguen siendo métodos de un solo punto que carecen de la capacidad de mediciones rápidas en un área grande de una celda, lo que requiere muchas observaciones consecutivas en cada píxel y la adquisición de datos en el orden de segundos.
N&B es una versión simplificada de PCH que considera sólo el primer y segundo momento de la amplitud de la distribución de la fluorescencia, a saber, la intensidad media, , y la varianza, n.o2 (Figura 2)18,19 y, debido a eso, no puede determinar la fracción molar de los oligómeros desconocidos en una mezcla, pero sólo estima el estado medio de oligomerización de la mezcla. Sin embargo, N&B tiene la ventaja de trabajar con series temporales relativamente más pequeñas de imágenes de células en vivo que PCH en una base de píxel a píxel, simplemente monitoreando las fluctuaciones en el tiempo de la intensidad de la fluorescencia. Debido a que N&B reduce el tiempo por píxel a unos pocos microsegundos, puede seguir la cinética de oligomerización rápida en áreas de celdas grandes, lo que permite la adquisición de imágenes en una escala de tiempo de segundos en microscopía de escaneo ráster (por ejemplo, confocal, 2 fotones) y milisegundos de milisegundos microscopía basada en cámara (por ejemplo, TIRFM).
Varios informes han demostrado la capacidad de N&B para cuantificar el número de subunidades en los grupos de proteínas mediante imágenes de regiones celulares extendidas. Se detectaron grupos de Paxillin-EGFP en los sitios de adhesión en las células CHO-K125,y la agregación intracelular del péptido patógeno Httex1p se describió en las células COS-726. N&B se aplicó para seguir la oligomerización impulsada por ligando sorda del receptor ErbB27, y el efecto del ligando FGF21 en Klothob (KLB) y FGFR1c en las células De LaLa28. La combinación de imágenes TIRF y análisis N&B se utilizó para mostrar que el dinamina-2 es principalmente tetramírico en toda la membrana celular29. Aplicamos N&B tanto a las imágenes de escaneo ráster como a las imágenes TIRF para probar la dimerización impulsada por ligando sin efecto de los receptores de membrana celular uPAR y FGFR130,31.
Los métodos de correlación de fluorescencia, como N&B, FCS y PCH, se basan en la noción de que en un volumen abierto el número de ocupación de partículas sigue una distribución de Poisson. Debido a que sólo se pueden detectar los fotones que emiten los fluoróforos, el valor medio de una intensidad de fluorescencia medida frente al tiempo en un píxel de la imagen, , es el producto del número medio de fluoróforos en el volumen de iluminación, n, y su brillo molecular,17:
donde se expresa como el número de fotones emitidos por unidad de tiempo (convencionalmente por segundo) por molécula cuando la molécula está en el centro del volumen de iluminación.
El brillo es una propiedad de cada fluoróforo en una adquisición determinada establecida, mientras que la intensidad es la suma de todas las contribuciones de todos los fluoróforos. En los concursos biológicos, el brillo aumentará con el aumento del número de fluoróforos que fluctúan juntos, dando información sobre el estado de oligomerización de la proteína etiquetada fluorescentemente. Las amplitudes de fluctuación en un píxel dado se miden a partir de la varianza de la señal de fluorescencia,n.o 2:
Donde la media del cuadrado de intensidad, , y el
cuadrado de la media de intensidad, , se calculan a partir de los valores de intensidad individuales en cada píxel de cada fotograma:
donde K es el número total de fotogramas de la serie temporal. Experimentalmente, es necesario calcular para toda la serie de imágenes la varianza que describe la dispersión de los valores de intensidad individuales en cada píxel de una sola imagen alrededor del valor de intensidad media. La varianza incluye todas las fluctuaciones de diferentes orígenes. En una primera aproximación, la varianza debida a las partículas difusoras en el volumen de iluminación,20, se puede separar de la varianza debido al ruido de disparo del detector,2d. Las dos varianzas son independientes; por lo tanto, la desviación total se da por su suma:
La varianza, debido a las fluctuaciones moleculares dentro y fuera del volumen de detección, depende linealmente del brillo molecular y la intensidad:
Reorganización eq. 6 según eq. 1:
Según el concepto típico en espectroscopía de correlación de fluorescencia, la ecuación 7 establece que la varianza debida al número de fluctuaciones depende del cuadrado del brillo de las partículas.
Entonces, la varianza debida a las fluctuaciones del detector es una función lineal de la intensidad detectada, bajo el supuesto de que el detector se opera por debajo de su límite de saturación19:
En el caso de los detectores de recuento de fotones a unnúmero 1 y ca 0, por lo tanto, la varianza del detector es igual a la intensidad media:
Para aplicar estos conceptos a mediciones reales en celdas vivas, Gratton y sus colegas18 definen el brillo aparente, B, para cada píxel como la proporción de la varianza sobre la intensidad media:
B es el parámetro que se mide experimentalmente. En este trabajo, las imágenes de series temporales de receptores FGFR1 en la membrana plasmática de las células HeLa son capturadas por la microscopía TIRF y el brillo aparente promedio, B, está determinado por el análisis N&B. Luego, después de la adición de FGF2, series temporales consecutivas se capturan para seguir los cambios en el autoensamblaje de las moléculas receptoras en la superficie de la membrana después de la estimulación del receptor con el ligando canónico.
Sin embargo, dado que el detector del microscopio TIRF es una cámara EMCCD, la expresión para el brillo aparente debe modificarse como19:
donde el desplazamiento es el desplazamiento de intensidad de la electrónica de detección que es una característica de la configuración del detector. La varianza y la intensidad media de un detector analógico se dan respectivamente por:
donde G es la ganancia analógica en niveles digitales (DL/fotones), S, los niveles digitales por foton19,se da por la pendiente de una intensidad frente a la varianza de la gráfica para una fuente de luz con intensidad constante (sin fluctuaciones temporales). El factor de la unidad está relacionado con la forma del volumen de detección de píxeles. Según Hassler et al.32, el factor de á es igual a 0,3 para las imágenes TIRF que funcionan con la ganancia máxima de la cámara de detección19. Los parámetros offset, S y G son características de la cámara y del microscopio. El brillo aparente, B, se obtiene reorganizando eq. 11 según eq. 12 y 13:
Experimentalmente, es una función compleja de la intensidad del láser y la eficiencia de detección del sistema. Sin embargo, puesto que B/S depende linealmente de la variable, sólo es importante determinar el valor relativo de la opción para un modo de detección determinado:
donde es proporcional a . Aún así, una calibración se realiza utilizando una referencia interna.
1. Preparación de muestras
2. TIRF Imaging — Alineación de la línea láser y optimización de la iluminación TIRF
3. TIRF Imaging: Captura de la serie temporal
4. Número y brillo (N&B): Comprobación de calidad de la serie temporal
5. Número y brillo (N&B): Determinación de los parámetros de la cámara (Desplazamiento, s y S)
6. Número y brillo (N&B): Cálculo de los valores B en la región de interés seleccionada (ROI)
Los resultados de dos células representativas de HeLa-mEGFP-FGFR1 sembradas en el mismo plato de cultivo se muestran en la Figura 5 y en la Tabla Suplementaria 1. Las dos celdas fueron capturadas en el tiempo 0 min(Figura 5A, superior) y 7 min(Figura 5A,inferior) después de la adición del ligando FGF2.
N&B requiere varias precauciones en la elección del modelo celular y la estrategia de etiquetado. Solo se puede aplicar a las celdas vivas que permanecen establemente adheridas durante el tiempo de captura de imágenes. Las fluctuaciones adicionales debidas al desplazamiento rígido de toda la celda podrían manejarse con los enfoques adecuados de restauración de imágenes38. Sin embargo, generalmente cuando una célula se mueve, la membrana celular también se deforma, y la deformación de la e...
Los autores no tienen nada que revelar.
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Albumin from Bovine Serum 98% minimun | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | A7906-100G | |
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 21063029 | Used serum free for microscopy |
DMEM high-glucose GlutaMAX I | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10566-016 | Used for complete medium |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Biowest, Nuaillé, France | X0515-500 | |
Emission splitting system Photometrics DV2 | TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA | ||
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10270106 | 10% inactivated supplement for complete medium |
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes | MatTek, Ashland, MA, USA | P35G-0.170-14-C | uncoated, glass thickness 0.17 microns |
GraphPad Prism | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | ||
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells | Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany | CB_08011102 | |
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software | Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK | This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series | |
Matlab Executable N&B routine | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia | |
MatLab v.2018b | The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA | download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x | Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA | LONZA 17-602E | supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg. |
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector | Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy | Zamai et al., 2019 | |
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
Recombinant FGF2 | PeproTech EC, Ltd., London, UK | Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA. | |
Sodium pyruvate GIBCO | ThermoFisher Scientific | 11360070 | 1mM supplement for medium |
TransIt-LT1 Transfection Reagent | MirusBio LLC, Madison, WI, USA | MIR 2300 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 25200056 | |
Type F Immersion liquid 10 mL | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513 859 | |
UltraPure BSA (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | AM2618 | 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections |
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