منصة Microfluidics الرقمية المستندة إلى الكهربية للعينات المناعية المناعية المرتبطة بالإنزيمات الآلية

Summary

microfluidic الرقمية القائمة على الكهربية هي تقنية تستخدم تغييرًا مدفوعًا بالجهد في زاوية الاتصال الظاهرة لقطرة بحجم ميكرولتر لتسهيل التلاعب بها. الجمع بين هذا مع الخرز المغناطيسي وظيفية تمكن من دمج عمليات وحدة مختبرية متعددة لإعداد عينة وتحديد مسببات الأمراض باستخدام الانزيم المرتبطة المناعة الاختزال (ELISA).

Abstract

الكهربية هو التأثير الذي يتم من خلاله تعديل زاوية الاتصال للقطرة المعرضة لشحنة سطحية. Electrowetting على عازل (EWOD) يستغل خصائص عازلة من الأفلام رقيقة عازل لتعزيز كثافة الشحن ، وبالتالي تعزيز تأثير الكهربية. ويؤدي وجود الشحنات إلى انتشار القطرة الناجمة عن ذلك بالكهرباء مما يسمح بالتلاعب الهادف عبر سطح مسعور. هنا، نُظهر بروتوكولًا قائمًا على EWOD لمعالجة العينات والكشف عن أربع فئات من المستضدات، باستخدام منصة تشغيل سطحية آلية، من خلال نوعين مختلفين من طرق الفحص المناعي المرتبط بالإنزيمات (ELISA). يتم تنفيذ ELISA على الخرز المغناطيسي مع الأجسام المضادة الأولية المشلولة التي يمكن اختيارها لاستهداف مستضد معين. يرتبط الجسم المضاد المترافق مع HRP بالمستضد ويتم خلطه مع H₂O₂/Luminol للقياس الكمي لمسببات الأمراض التي تم التقاطها. تم تحقيق أوقات الانتهاء من الدراسة بين 6 و 10 دقيقة ، في حين تم استخدام كميات ضئيلة من الكواشف.

Introduction

وتهدف الطريقة المقترحة إلى تسهيل إعداد العينات الآلية لـ ELISA من خلال الكشف الكمي عن المستضدات باستخدام النهج القائم على EWOD مع الموائع الدقيقة الرقمية (DMF) والفصل المغناطيسي. وقد ثبت للتطبيقات البيولوجية المتعددة أن DMF في تركيبة مع magnetophoresis هو بديل مثير للاهتمام لتطبيقات التعامل مع السائل¹. وبشكل أكثر تحديدا، فإن الكشف عن مسببات الأمراض هو جانب ضمني في العديد من القطاعات، بدءا من الرعاية الصحية² إلى الزراعة والبيئة^3،4 إلى الأمن القومي^5. يجب أن تتميز تقنية الكشف القادرة على التصدي للتهديدات الناجمة عن مسببات الأمراض بإنتاجية عالية (مثل وقت إجراء تحليل قصير) وكفاءة (الحد المنخفض للكشف - LoD - والحساسية العالية) وخصوصية (لنوع مسببات الأمراض المستهدفة) لتكون وظيفية^6.

سابقا، وقد تم تنفيذ DMF EWOD المستندة بنجاح لالنسخ العكسي البوليمرات سلسلة التفاعل (RT-PCR)، والكشف عن مسببات الأمراض المقاومة للمضادات الحيوية (Methicillin مقاومة المكورات العنقودية أو MRSA)، M.pneumonia و C.albicans باستخدام منخفضة الميزانية، وطباعة الدوائر الكهربائية رقاقة والمغناطيسيوفوريس⁷. تم تطبيق هذه التقنية أيضا للكشف عن الحمض النووي deoxyribonucleic (الحمض النووي) الطفرات من خلال البيروالتسلسل والكشف chemiluminescent⁸. كما تعمل المنصات القائمة على EWOD على توسيع وظائفها نحو تطبيقات المناعة ، وبالتالي تمكين استرداد العينات واكتشافها في وقت واحد جميعًا داخل منصة واحدة متكاملة. على سبيل المثال ، تم إثبات تصميم واحد لرقاقة EWOD بنجاح مع منصة DMF لاختبار نقطة الرعاية لكل من الاختبارات المناعية المستندة إلى الحبوب من تروبونين القلب الأول من عينة دم كاملة وكتجربة منفصلة RT-PCR للكشف عن MRSA². هذه الشريحة تستخدم حشو الزيت، الذي يمنع تبخر القطرات ويسهل التلاعب الآلي الموثوق به لأحجام النانولتر. تم التحقيق في التطبيقات الحيوية المتعددة الاستخدامات مع تنفيذ نهج DMF مماثلة تغطي الاختبارات المناعية الكمية المتجانسة وغير المتجانسة^9،10 بما في ذلك تصميم الدراسات التجارب (DoE) لتحسين معلمة التحليل¹¹.

على الرغم من مزاياه الواضحة لمعالجة التكثيف بسبب أحجام العمل الضئيلة ، فإن منصة DMF المليئة بالنفط يمكن أن تكون صعبة وتتطلب مستوى معينًا من الخبرة للعمل. الأنظمة المملوءة بالنفط، لأنها تتطلب مكونًا مختومًا، ليست مثالية لتطبيق معين في الميدان حيث تكون قابلية نقل النظام مهمة. وبالإضافة إلى ذلك، سيكون من الصعب جداً، إن لم يكن من المستحيل، استخدام نظام قائم على النفط في بعض التطبيقات المحددة التي تستفيد من جمع المواد الجافة على سطح مثل ما اقترحه تشاو وتشو^12،ويونسون - نيدزيولكا وآخرون^13،وفوات وآخرون^14. في المقابل ، أنظمة خالية من النفط بسيطة لدمج ولها ميزة توفير سهلة رقاقة إلى رقاقة الترجمة عينة. ولهذه الأسباب، تم تطوير الطريقة المقترحة لتوفير عملية تقييم للمناعة المستندة إلى EWOD على DMF والتي لا تتطلب النفط، مما يبسط عملية الجهاز بشكل فعال.

في هذه المساهمة ، نقدم تقريرًا عن استخدام منصة DMF مخصصة وقائمة بذاتها ومؤتمتة بالكامل للاختبارات المناعية ، ونوضح بروتوكول الكشف السريع للجزيئات الحيوية ، وهي: البروتينات والبكتيريا النباتية والجراثيم البكتيرية والفيروسات. وقد ثبت بالفعل مزيج من رقاقة EWOD مع الجسيمات المغناطيسية لإعداد العينة الآلي والهطول المناعي مع قياس MS إضافية خارج الخط^15. في الآونة الأخيرة ، تم إثبات التشخيص الميداني ضد الحصبة والحصبة الألمانية IgG في سكان شمال غرب كينيا النائية من قبل مجموعة ويلر¹⁶. كل من ويلر ونظامنا ، ويجري نقلها ، مكتفية ذاتيا ، مؤتمتة بالكامل مع وشملت على رقاقة ، والقياسات chemiluminescent في الوقت الحقيقي يمكن القول من بين أنظمة DMF الكشف الحيوي الأكثر تقدما المتاحة.

وقد تم تصميم النظامين مع تطبيقات مختلفة جدا في الاعتبار. يستهدف نظام ويلر العلامات الحيوية للسماح بالتشخيص الطبي الحيوي على المرضى في حين أن نظام الكشف الحيوي لدينا مبني حول متطلبات الدفاع للكشف المباشر عن مسببات الأمراض التي تم أخذ عينات منها سابقًا من الهواء. والتشابه بين الاثنين هو المبدأ الأساسي لتشغيل القطرات، الذي يبين النطاق الواسع للقطاعات المؤثرة على الحياة التي يمكن أن تؤثر فيها التكنولوجيا القائمة على EWOD. وعلى وجه التحديد، يمكن لمنصة الكشف القائمة على حركة الدوحة للأمراض ونظام EWOD المرتبط بها أن تجد آثاراً رئيسية في مجال الصحة (التشخيص الطبي الحيوي)؛ الحماية العسكرية والمدنية (الكشف عن التهديدات)؛ التكنولوجيا الزراعية (رصد المحاصيل) وسلامة العمل (مراقبة البيئة الخاضعة للرقابة)

يتم تقييم أداء منصة DMF لدينا مقابل الكشف الآلي بالكامل عن الزلال المصل البشري (HSA ، بروتين كروي) ، Escherichia coli (E. coli، بكتيريا نباتية) ، عصيات atrophaeus (BG، بوغ بكتيري) و MS2 (فيروس البكتريا). والأهم من ذلك ، فإن طريقة DMF المقترحة متعددة الاستخدامات للغاية بمعنى أنه يمكن تبادل الأجسام المضادة للالتقاط لاستهداف اكتشاف مستضدات أخرى مختلفة عن الأربعة التي يتم النظر فيها في هذه المقالة. تجنب الاستشعار القائم على الأجسام المضادة تماما، يمكن أن منصة DMF بناء لتطبيق محتمل على أساس الاستشعار عن الموجات aptamer، حيث الخرز المغناطيسي تحمل aptamers محددة لالتقاط و / أو الكشف عن النيوكليوتيدات. يتم الكشف عن تصميم وتحقيق المكونات المختلفة التي تشكل منصة DMF متكاملة ومكتفية ذاتياً تمامًا ، بما في ذلك مولد الموجي عالي الجهد وإلكترونيات القيادة في مكان آخر^6.

Protocol

1. الخطوات الأولية اللازمة للدراسة

ملاحظة (هام): يجب إجراء جميع الخطوات الأولية في بيئة معقمة لتجنب التلوث. لا ينبغي استخدام أزيد الصوديوم للتخزين لأنه يمنع نشاط إنزيم البيروكسيديز الفجل (HRP).

1. إعداد تشغيل المخزن المؤقت (100 mM HEPES, pH 7.5), باستخدام (4-(2-هيدروكسيثيل)حمض piperazine-1-ethanesulfonic, وإضافة Tween 80 إلى تركيز 0.01% (v/v).
2. شل الأجسام المضادة الأولية (التقاط الأجسام المضادة) على سطح الميكروبات المغناطيسية التي تم تنشيطها من قبل دائرة الصحة الوطنية باتباع البروتوكول المقدم من المورد. وباختصار، يشمل بروتوكول IP/Co-IP المغناطيسي(جدول المواد)الخطوات التالية.
   1. Aliquot 0.2 مل من الخرز (2 ملغ) في أنبوب من البلاستيك وإزالة supernatant.
   2. غسل الخرز عن طريق إضافة 1 مل من الجليد البارد 1 mM HCl.
   3. ربط الأجسام المضادة المختارة (الألبومين المصل المضاد ة للإنسان [15C7]، RB المضادة لBG بوليكلونال، Rb المضادة-E.coli MRE 162 متعدد النسيلة أو الماعز المضادة MS2 بوليكلونال)، 40 ميكروغرام/مل في 67 mM بورات العازلة، covalently إلى الخرز لمدة 1 ساعة مع اهتزاز في 37 درجة مئوية. يحتوي الجدول 1 على قائمة بجميع الأجسام المضادة المستخدمة مع البروتوكول الحالي ومسببات الأمراض المستضدية⁶.
   4. غسل الأجسام المضادة غير المنضمة مرتين مع 0.8 مل من العازلة Elution.
   5. إخماد رد الفعل مع 1 مل من العازلة إخماد ل1 ساعة.
   6. غسل الخرز مرة واحدة مع تعديل بورتي العازلة ومرة واحدة مع IP Lysis / غسل العازلة.
   7. إعادة تعليق الخرز في 0.5 مل من ليسيس الملكية الفكرية / غسل المخزن المؤقت وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى المطلوبة للاستخدام.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، يتم اقتران دفعة جديدة من الميكروبات بالأجسام المضادة في اليوم السابق لعزل EWOD وELISA على الشريحة. ومع ذلك ، يمكن تخزين الميكروبات المقترنة بالأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية حتى شهر واحد. إذا حدث التكتل، اضغط على القارورة لكسر الراسب وإعادة تعليق الخرز في الحل.
   8. منع الميكروبات مع الأجسام المضادة مقرونة بين عشية وضحاها، وذلك باستخدام التركيز النهائي 4 ملغ /مل للميكروبات، في كيسين مانع (1٪ ث / v) في 100 mM الفوسفات العازلة المالحة (PBS).
      ملاحظة: يتم إجراء دائماً خطوة حظر اليوم قبل تشغيل إجراء الكشف الحيوي.
   9. فصل الخرز من كيسين مانع باستخدام المغناطيس وإزالة supernatant.
   10. إعادة تعليق في 1 مل من تشغيل المخزن المؤقت ومزيج لمدة 1 دقيقة.
   11. فصل الخرز باستخدام المغناطيس وإزالة supernatant.
   12. كرر خطوات الغسيل المذكورة أعلاه (1.2.10 و 1.2.11) مرتين.
       ملاحظة: ثلاث خطوات الغسيل كافية للحد من التصاق الخرز إلى السطح وتسهيل حرية حركة قطرات.
   13. إعادة تعليق الخرز في المخزن المؤقت قيد التشغيل بتركيز 2.5 ملغم/مل. هذا الحل من الميكروبات جاهزة للاستخدام مع رقاقة EWOD.
3. إعداد حل من البيروكسيديز الفجل المترافق نيوترافيدين (HRP) والأجسام المضادة biotinylated الثانوية إلى تركيز نهائي لكل من 1 ميكروغرام / مل في تشغيل المخزن المؤقت (المستخدمة للكشف BG⁶).
   ملاحظة: لاستهداف المستضدات(الجدول 1)تم بنجاح اختبار تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة الثانوية البُنية، التي تتراوح بين 0.5 و4.0 ميكروغرام/مل.
4. مزيج كميات متساوية من Luminol مع حل بيروكسيد الهيدروجين فقط قبل تشغيل الخفض
   ملاحظة: يستخدم Luminol لتحديد عدد الأحداث الملزمة استنادًا إلى إنزيم HRP المرتبط بالكالفية للجسم المضاد الثانوي الذي يستهدف المستضد (على سبيل المثال، العامل الممرض). ومع ذلك، يمكن استخدام جزيء الإبلاغ المختلفة والاستراتيجيات للكشف¹⁷ بدلا ً من الكيمياء ولومينول.

2. تصنيع ومعالجة السطح من مكونات رقاقة EWOD

ملاحظة: تتكون شريحة EWOD من لوحة تنشيط مع أقطاب الكروم المنقوشة لتبديل زاوية الاتصال الظاهرة للقطرة ولوحة الغطاء لتحديد ارتفاع القطرات.

1. رسم تصميم الأقطاب الكهربائية والموصلات في 2D باستخدام برنامج كندي القياسية. وتشمل أيضا لوحة جمع النفايات مع أبعاد 5 × 5 ملم² لتخزين المذيبات المستخدمة(الشكل 1).
   ملاحظة: لمعالجة قطرات نستخدم 47 أقطاب كهربائية، كل مع أبعاد 1.7 × 1.7 ملم². يستوعب حجم القطب الكهربائي هذا أحجام قطرات تتراوح بين 1.5 ميكرولتر إلى 3 ميكرولتر (لفجوة 500 ميكرومتر). من التجربة ، عند العمل مع فجوة 500 ميكرومتر ، 1.5 ميكرولتر هو الحد الأدنى لحجم القطرات التي يمكن أن تعمل. وهو يتوافق تقريبا مع كفاف قطرات (المتوقعة) التي يتم تقييدها إلى لوحة مربعة. ومع ذلك ، لا يوجد أي حد نظري في الحجم بخلاف ما تسببه مقاومة (احتكاك) جسم السائل. ومع ذلك، يوصى بأن لا يتجاوز الحجم 3 ميكرولتر للتنشيط الموثوق به باستخدام فجوة 500 ميكرومتر. يتم معالجة الأقطاب الكهربائية من قبل 48 قناة الالكترونيات.
   ملاحظة: يمكن أن تختلف أبعاد التصميم وأحجام الوسادات وفقًا للأحجام المقصودة وعمليات وحدة المختبر (LUOs) التي يتألف منها البروتوكول.
2. إرسال الرسم تصميم إلى قناع خدمة التصنيع لطباعة قناع الكروم على الركيزة الزجاجية. سمك طبقة الكروم هو 100 نانومتر.
   ملاحظة: طبقة الكروم على قناع الضوئي المستخدمة كركيزة لرقاقة EWOD هو، بحكم التعريف، مبهمة. يتضمن تصميم كل من أقطابنا تخطيط ًا للشبكة لضمان شبه الشفافية.
3. قطع لوحة إلى حجم 56 × 56 ملم² مع الدقة التصنيع باستخدام الحاسب الآلي التقطيع / منشار.
4. عصا اخفاء الشريط على الاتصالات الكهربائية من أجل عزلهم خلال خطوتين الطلاء.
5. معطف لوحة الكروم الزجاج مع طبقة عازلة عن طريق إيداع 6 ميكرومتر Parylene-C على سطحه. يتم استخدام عملية غورهام¹⁸ مع 7.4 غرام من DPX-C في نظام ترسب الباريلين(جدول المواد).
6. تدور معطف المفلور غير متبلور(جدول المواد)باستخدام تدور معطف في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 30 عاما على رأس لوحة وخبز في 140 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: هذا يجعل سطح مسعور. يمكن للمرء التحقق من صحة ما إذا كان قد تم إيداع الطلاء بنجاح عن طريق وضع قطرة من الماء على السطح. يجب أن تكون زاوية الاتصال بين القطرة واللوحة في منطقة 110 º.
7. قم بإزالة شريط الإخفاء من جهات الاتصال الكهربائية.
8. تدور معطف المفلور غير متبلور(جدول المواد)باستخدام تدور معطف في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 30 عاما على رأس رقاقة السيليكون 4 في وخبز عليه في 140 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: من المهم أن يكون كل من أسطح المنشّط والغطاء مسعورين من أجل تسهيل الحركة السلسة للقطرات المنفصلة أثناء إجراء التناول.

3. تحميل وتجميع وتشغيل رقاقة EWOD على منصة DMF

ملاحظة: تعمل شريحة EWOD باستخدام تكوين لوحة متوازية مع فجوة محددة بدقة 0.5 مم بين لوحة التشغيل ولوحة الغطاء الموصلة المطحونة. يتم وصف هذا التجمع شطيرة في القسم الحالي.

1. قم بإزالة الغطاء من منصة DMF⁶ ووضعه على مقاعد البدلاء.
   ملاحظة: غرفة قفص فاراداي المظلمة، ضرورية لمنع الضوء الضال والتداخل الكهرومغناطيسي أثناء الكشف. لا يوجد أي تشابك على الغطاء ، وبالتالي ، فإن المنصة تسمح لنا بمراقبة حركة القطرات.
2. وضع لوحة تشغيل نظيفة على مرحلة الدورية، والكروم التي تواجه صعودا. يجب محاذاة اللوحة مع الزاوية اليسرى العليا من المرحلة الاستراحة(الشكل 2A).
3. المشبك لوحة الأكتر من أعلى باستخدام لوحة مع دبابيس الاتصال 47. هذا يؤمن لوحة في مكانها ويسهل المحاذاة مع دبابيس الاتصال.
4. وضع 0.5 مم الشيم و2 مم فاصل بولي ميثيل ميثاكريلات (PMMA) على مرحلة الدورية، من أجل توفير فجوة تسيطر عليها بين التشغيل ولوحات الغطاء.
   ملاحظة: اختياريا، يمكن وضع ورق الفتل على وسادة التخلص من النفايات قبل aliquoting قطرات قبل الخطوة التالية. ومع تقدم الفحص، يتم امتصاص النفايات مباشرة في الورق الذي يمكن إزالته في نهاية الفحص.
5. تحميل قطرات على منصات التحميل المقترحة(الشكل 1).
   1. Aliquot أربعة قطرات 2.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت قيد التشغيل على منصات B-، A-، R-، E-المشار إليها، قطرة واحدة على كل وسادة.
   2. Aliquot 2.5 μL من Luminol: H₂O₂ (1:1، v/v) حل على لوحة D-المشار إليها.
   3. Aliquot 2.5 μL من Neutravidin مترافق ة إلى HRP (1 ميكروغرام / مل) على لوحة F-المشار إليها.
   4. Aliquot 2.5 μL من الأجسام المضادة الثانوية Biotinylated (1 ميكروغرام / مل) على لوحة G المشار إليها.
   5. Aliquot 2.5 μL من الميكروبات مع الأجسام المضادة الأولية مترافقة (2.5 ملغم / مل) تذهب إلى لوحة يشار إليها I-المشار إليها.
   6. Aliquot 2.5 μL من العينة غير معروف على لوحة C المشار إليها.
      ملاحظة: نمط التحميل المقترح هو مثال واحد فقط من تخطيط تجريبي، ومع ذلك، يمكن تغيير نمط التحميل لتتناسب مع احتياجات المستخدمين، طالما أن هذه التغييرات تتطابق مع التسلسل المحدد في البرنامج(الملف التكميلي 1).
6. ضع لوحة الغطاء على سطح الحفارة ، إلى جانب منطقة الاستراحة المستديرة ، وقم بتمريرها بشكل قطعي في الاستراحة وعلى رأس لوحة التحريك(الشكل 2B).
7. وضع المغناطيس الدائم على رأس لوحة الغطاء وتأمينه عن طريق انزلاق اثنين من المزالج(الشكل 2C).
8. تدوير المرحلة من قبل 180 درجة وفحص بصريا إذا كانت قطرات محملة لا تزال في مكانها(الشكل 1C).
   ملاحظة: ينبغي للمرء أن تكون قادرة على مقلة العين موقف وشكل قطرات من خلال مرحلة شفافة والجزء الخلفي من لوحة التفعل(الشكل 2D). ويكون الاختبار جاهزاً للتشغيل إذا كان من الممكن رؤية القطرات المستديرة على قمة منصات التحميل. في حالة، يتم إزاحة قطرة واحدة يمكن إزالة المغناطيس ولوحة الغطاء، ثم استرداد قطرات المشردين مع ماصة نظيفة ووضعها مرة أخرى على لوحة التحميل.
9. تأكد من أن موضع التحميل لكل قطرة يطابق تسلسل التشغيل المبرمج في البرنامج (انظر الملف التكميلي 1 للحصول على تفاصيل حول البرنامج).
   ملاحظة: لتكون قادرة على التحقق بصريا من موقف قطرات، يجب أن يتم إلغاء تحميل كاشف الصور(الشكل 2D).
10. ضع كاشف الصور الذي تم فحصه "CAN" في فتحة مرحلة الدوران.
    ملاحظة: يتمحور نظام الكشف الضوئي حول الصمام الثنائي الضوئي، الذي يحتوي على مساحة تجميع كبيرة (10 × 10 مم²⁾لزيادة مجموعة الضوء دون بصريات إضافية، بالإضافة إلى مكبر صوت عبر المعاوقة لتقليل الضوضاء⁶. ومع ذلك ، فإن النظام حساس للغاية ويمكن جمع إشارات دقيقة. وللحد من مستوى الضوضاء، تم تنفيذ عدد من الاستراتيجيات القائمة على الإلكترونيات (على سبيل المثال، تمت حماية نظام الكشف الضوئي عن طريق وضعه في قفص فاراداي، وهو غلاف معدني يعرف باسم "علبة").
11. توصيل الكابل إلى كاشف الصور فرزها "يمكن".
    ملاحظة: بمجرد محاذاة شريحة EWOD مع كاشف الصور ، يتم تجميع منصة DMF بالكامل وهي الآن جاهزة للعمل.
12. ضع الغطاء فوق منصة DMF وابدأ تسلسل البرنامج باستخدام واجهة البرامج التي تم تطويرها في جامعة هيرتفوردشاير.
    ملاحظة: يتم استخدام برامج إضافية لقراءة وتسجيل التلألؤ من القطرة كدالة للوقت في ملف CSV (انظر الملف التكميلي 2).
    1. تأكد من أن التسلسل المبرمج (انظر الملف التكميلي 1)تظهر الرسائل الفورية في الواجهة لإعلام المشغل بأن "قطرة اللومينول جاهزة لجمع الخرز المغناطيسي المستخرج" أو "قطرة الكشف جاهزة لنقلها إلى موقع الكشف". في كلتا الحالتين، مطلوب تأكيد من المشغل للمضي قدما في التسلسل.

4. تعمل في الوضع البصري (اختياري لتحسين البروتوكولات)

ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، من أجل تصور كل عملية تستند إلى قطرة، يمكن تشغيل الفحص عن طريق تخطي الخطوات 3.10-3.12 واستبدالها بالعمليات التالية.

1. بدء تسلسل البرنامج باستخدام واجهة البرنامج.
   ملاحظة: يمكن ملاحظة حركة القطرات أثناء العمل في الوضع المرئي، وهو أمر مفيد أثناء تحسين البروتوكول. أولا، للتحقق من استنساخ عملية الفصل المغناطيسي. على سبيل المثال، إذا كانت كمية الخرز المستخدمة منخفضة جدا، فإن الفصل المغناطيسي لا يحدث، والعكس بالعكس، إذا كانت كمية الخرز عالية جدا، قد يتم شل القطرات من قبل بيليه حبة. ثانياً، للتأكد من موثوقية فحص جديد لأن بعض تركيبة القطرات قد تسبب ضعف في الكفاءة يمكن اكتشافه عن طريق الملاحظة.
2. جبل كاشف الصور فرزها "يمكن" في شق المرحلة الدورية، عندما يطالب.
3. قم بتوصيل الكبل بكاشف الصور الذي تم فحصه "can"، عن طريق إدخال الدبابيس في المقبس.
4. ضع الغطاء فوق منصة DMF واستأنف إجراء الإعادة.
   ملاحظة: استخدم البرنامج الإضافي لقراءة وتسجيل التلألؤ من القطرة كدالة للوقت في ملف CSV (انظر الملف التكميلي 2)

5. إزالة النفايات السائلة وتنظيف الشريحة

تنبيه: تأكد من إيقاف تشغيل المعدات وفصلها عن مصادر الطاقة (الكمبيوتر والرئيسية) قبل التنظيف. ارتداء قفازات، ومعطف المختبر ونظارات واقية الزجاج (PPE) عند إزالة العينات البيولوجية من رقاقة!

1. للوصول إلى الأقطاب الكهربائية والمذيبات المستخدمة على لوحة التشغيل، افتح غطاء منصة DMF وقم بتدوير المرحلة 180 درجة.
2. فك غلاف المغناطيس، وإزالة المغناطيس من مرحلة الدورية ووضعه على مقاعد البدلاء.
3. إزالة لوحة الغطاء، رقاقة السيليكون، من الشق مع زوج من ملاقط، شطف ه بالماء DI، وتجفيفه مع الهواء المضغوط ووضعه في طبق بيتري، حيث يمكن تخزين رقاقة وإعادة استخدامها.
4. استخدام ميكروبيبيت لنقل النفايات السائلة من لوحة دون لمس السطح.
5. تنظيف السطح عن طريق فتل قبالة السائل من لوحة التشغيل باستخدام ورقة ماصة (تصفية المواد).
   ملاحظة: الحفاظ على السطح سليمة سوف تزيد من طول عمر لوحة التنشيط، التي تسمح استخدامات متعددة.
6. تنظيف لوحة التعمل عن طريق كنس بلطف سطح الأقطاب الكهربائية مع قطرة ماء DI نظيفة باستخدام ماصة نظيفة. ثم قم بإزالة القطرة بورق الفتل (مادة التصفية).
   تنبيه: التخلص من الأنسجة والأوراق ونصائح الماصات والقفازات الملوثة بالمواد البيولوجية في سلة النفايات الحيوية.
7. استخدم لوحة التشغيل للحصول على جهاز آخر أو قم بإزالته من منصة DMF للتخزين أو إعادة التدوير.

النتائج

تم التحقيق في تأثير الجهد الكهربي من أجل توضيح الظروف المثلى لإجراء المقالات. تم دفع قطرة من المخزن المؤقت في مختلف الفولتية الفولتية الفولتية وسجلت حركتها. وأظهرت النتائج(الشكل 3)وجود ارتباط بين الجهد الجذر المتوسط للتشغيل التربيعي (V_rms)ومتوسط السرعة. ومع ذلك، تم تقليل طول عمر لوحة التشغيل عند استخدام قيم عالية_{لـ V rms.} وبناء على هذه النتائج، تم اختيار 105 V_rms كجهد التشغيل القياسي، ووجد أن 120_{V rms} تعمل بشكل أفضل لقطرة H₂O₂/Luminol وتم تنفيذ 165 V_rms لاستخراج LUO. تم تضمين هذه الفولتية في تسلسل البرمجة الآلي(الملف التكميلي 1).

تم اختبار اثنين من المناعة(الشكل 4)بنجاح باستخدام رقاقة EWOD مع منصة DMF لأربعة مسببات أمراض مختلفة(الجدول 1). سهلت رقاقة EWOD الحركة المتتالية للقطرات من منصات التحميل إلى منطقة الخلط وأخيراً إلى النفايات. وكان هناك اثنين من المنظمات الأساسية التي تكررت في جميع أنحاء البروتوكول لإكمال ELISA. الأول كان استخراج LUO; وصف ها هنا، تم دفع قطرات تحتوي على الخرز المعلق إلى موقع الفصل في منتصف منطقة الخلط، تم تنشيط المغناطيس تلقائيا للاقتراب من رقاقة وتجميع الخرز المغناطيسي في بيليه(الشكل 5). بعد ذلك ، تم نقل القطرات نحو وسادة النفايات ، وترك الخرز على لوحة التشغيل ، وبالتالي الانتهاء من استخراج LUO. وكان خلط LUO الرئيسية التالية التي تجري على رقاقة EWOD. تم نقل عينة التحليل مع تركيز غير معروف من مسببات الأمراض على الخرز عن طريق الكهربة. ثم تم إعادة تعليق الخرز عن طريق تحريك القطرات مع الخرز المقطوع فوق منطقة الخلط (10 منصات في المجموع). وكان هذان الـ LUOs ضروريين حيث يسّران معالجة عينة مصغرة وسريعة وقابلة للاستنساخ مع الكشف المتتالي عن مسببات الأمراض في 6 إلى 10 دقيقة.

ولتلبية المستويات المطلوبة من التشغيل الآلي، يمكن إدخال اختلافات في البروتوكول. على سبيل المثال ، تم فصل الخرز عن القطرة المستضدة المستنفدة ، والتي تم نقلها بعد ذلك إلى وسادة النفايات ، مكررة LUO الاستخراج الأساسي. في هذه المرحلة ، يمكن للبروتوكول أن يتفرع اعتمادًا على ما إذا كان الجسم المضاد للكشف مترافقًا مع HRP بالفعل ، باستخدام ثمانية من LUOs بشكل فعال في المجموع للكشف عن المستضدات المختلفة(الشكل 7A-C). في هذه الحالات ، تم إحضار القطرات مع الجسم المضاد للكشف إلى الخرز ثم مختلطة عن طريق التشغيل. بدلاً من ذلك، يمكن ربط الأجسام المضادة للكشف باقتران Neutravidin-HRP بالتتابع في الموقع على رقاقة EWOD، كما تم إثباتها للقياس الكمي للكولاي (الشكل 7D). كلا البروتوكولين ، وثمانية وعشر خطوات ELISA(الشكل 4)، وأسفرت عن الكشف عن المستضدات استنساخها.

تم تنوع أوقات الحضانة وتركيزات الاقتران للعثور تجريبيًا على الظروف المثلى للمقاة(الشكل 7A). ووجد أن وقت الحضانة من 160 s وتركيز ملاقاة من 2 ميكروغرام/مل حققت أفضل إشارة إلى نسبة الضوضاء مع زيادة 36٪ من قوة الإشارة وتقريبا أي تغيير في مستويات الضوضاء الخلفية. تم تعديل جميع الأرقام والبيانات المستخدمة في قسم النتائج التمثيلية من عمل سابق⁶.

الابتدائي / التقاط الأجسام المضادة	الكشف عن الأجسام المضادة	Antigen
لمكافحة الإنسان مصل الألبومين [15C7] (المضادة HSA، Abcam ab10241)	الحصان الفجل بيروكسيديز (HRP) الموسومة المضادة HSA [1A9] (Abcam ab24438)	ألبوم المصل البشري (HSA, Abcam)
RB المضادة لBG polyclonal	Biotinylated Rb المضادة لBG polyclonal	ب. جلوببيجي (BG) الجراثيم
Rb مكافحة E.coli MRE 162 polyclonal	Biotinylated Rb المضادة للكولاي 162 MRE polyclonal	E. coli MRE 162
الماعز المضادة MS2 متعدد الكلونة	Biotinylated Rb المضادة MS2 متعدد الكلونة	فيروس البكتيريا MS2

الجدول 1: المستضدات والأجسام المضادة التي تم اختبارها باستخدام هذا البروتوكول. تم استخدام أربعة أنواع من مستضدات مسببات الأمراض لإظهار قدرات رقاقة EWOD مع منصة DMF.

الشكل 1: تصميم لوحة EWOD. (أ)التدوين التخطيطي للوحة تشغيل EWOD مع موصلات (مربعات ، أعلى) التي ترتبط (خطوط) إلى الأقطاب (المربعات ، القاع). يتم تعيين رقم لكل لوحة ويمكن معالجتها من رمز البرنامج(الملف التكميلي 1). يتم وضع علامة على منصات التحميل الكهربائي بواسطة الأسهم ويشار إليها بحرف كبير فوق أو تحت كل لوحة. ومن السمات الرئيسية لمنصة DMF منطقة الخلط المكونة من عشر منصات (رقم 31، 32، 33، 36، 37، 42، 43، 44، 46، 47). كدليل مرئي، يتم وضع علامة على منطقة الخلط بمستطيل أحمر. (ب)ميكروغراف لتصميم الشبكة الدقيقة للمنصات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: المكونات والمراحل الرئيسية لتجميع نظام الموائع الإلكترونية الرقمية (DMF). (أ) إصلاح لوحة تشغيل EWOD، ووضع الشيم على مرحلة الدورية وتحميل قطرات. (ب) وضع لوحة الغطاء. (C) جبل حالة المغناطيس، وربط المزالج وتدوير المرحلة 180 درجة. (د) المغناطيس الآلي يشير إلى الأسفل. تفقد موضع وشكل القطرات، وتحقق من أن يتم محاذاة لوحة الدوائر المطبوعة (PCB) دبابيس مع جهات الاتصال على رقاقة EWOD، وربط كاشف الصور ووضعه في فتحة كاشف الصور. بعد توصيل إلكترونيات التحكم بجهاز كمبيوتر، يكون النظام جاهزًا لتشغيل النسخة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: الاستخدام المتكرر للوحات التشغيل والتأثير على جهد التشغيل. يتم رسم متوسط سرعة قطرة من المخزن المؤقت قيد التشغيل كدالة لجهد التشغيل (الدوائر الزرقاء) والانحراف المعياري عن ثلاثة قياسات مستقلة (N = 3). هنا يشير عدد المقايسات لكل لوحة (القضبان الرمادية) إلى الاضمحلال المعزز للسطح في الفولتية الأعلى. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: رسم تخطيطي للأدوات المناعية التي تم اختبارها باستخدام EWOD. تمثل كل دائرة في هذا الرسم التخطيطي حجم 2.5 ميكرولتر محملة على شريحة EWOD. البروتوكول الأول (على الجانب الأيسر) يظهر ثمانية LUOs باستخدام الأجسام المضادة المختلطة مسبقا- HRP مرابطة; في حين أن البروتوكول الثاني يشمل عشرة LUOs ، إضافة بشكل منفصل من الأجسام المضادة للكشف biotinylated ، استخراج خرزة وملزمة متتالية من Neutravidin - HRP ملاطة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: استخراج البزة المغناطيسية. يتم تقسيم هذه العملية إلى (a-c) تنشيط القطرة مع الخرز المغناطيسي المعلق إلى موقع الفصل المغناطيسي في منتصف منطقة الخلط (لوحة رقم 33)، (د، ه) المغناطيس يتحرك في موقف التركيز الخرز، (و، ز، ح) يتم عقد الخرز في مكان من قبل القوة المغناطيسية في حين يتم تنشيط قطرات بعيدا من قبل EWOD نحو لوحة النفايات (وسادة رقم 41). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تسلسل كامل للاقاعي باستخدام EWOD، مع إظهار الكواشف، وتحميل العينات وعمليات وحدة المختبر. يحتوي كل صف على سلسلة من صور العينة من العمليات المميزة على قطرة. وتنقسم العمليات إلى أعمدة. لا يتم إجراء خلط للحبات في تعليق، التي قدمها خط مكسورة سوداء. ويشار إلى الاتجاهات قطرة بواسطة الأسهم الزرقاء، يتم تسليط الضوء على الخرز في واحدة من الصور من قبل سهم برتقالي. يفصل المربع الرمادي (الزاوية اليمنى السفلى) بين الصورتين اللتين تمثلان الحركة والموقع في منطقة الكشف ، وتبرز دائرة الخط المكسور منطقة الكشف. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: منحنيات المعايرة من الاختبارات المناعية التي أجريت على رقاقة EWOD مع منصة DMF. كما ذكرت سابقا⁶ يتم عرض الفولتية الناتج (mV) مقابل تركيزات ل: (A) الألبومين المصل الإنسان، الذي يستخدم لدراسة تأثير تركيز الأجسام المضادة مُقازة [C] ووقت الحضانة، t_inc،يقاس من خلط الخرز مع analyte المعروفة حتى استخراج LUO، (B) B. atrophaeus (BG) الجراثيم التي تظهر استنساخ المناعة، (C) MS2 bacteriophage المناعي، و (D) عشرة-LUOs نتائج البروتوكول ل إي كولاي. الاختصارات: وحدات تشكيل المستعمرة (cfu) ، وحدات تشكيل البلاك (pfu) ، عدد التجارب المستقلة (N) ، تشغيل الوحدة المختبرية (LUO). الشكل المعدل من المنشور السابق⁶. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف تكميلي1: تسلسل كامل لتشغيل منصة DMF لELISA اختبار الآلي مع Neutravidin-HRP كما مُلمع. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: يتم عرض واجهة المستخدم الرسومية لقياس الكيمياء ومثال من قياس مع البرنامج. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

بروتوكول EWOD المناعة مرنويمكن أن تشمل عددا ً من عمليات الوحدات المختبرية (على سبيل المثال، التقاط المستضد، والاختلاط، والحضانة، واستخراج الخرز، والغسيل) اعتماداً على نوع الكاشف، والاستقرار ومتطلبات الاستخدام المحددة من قبل بروتوكول الفحص. كدليل على المبدأ ، في المادة الحالية ، يعتبر بروتوكولان مناعيين يظهران تنفيذ ثمانية أو عشرة من الـ LUOs(الشكل 4)مع شريحة EWOD الموصوفة. مثل هذه المزايا miniaturization من microliter، مجلدات منفصلة من الكواشف / analyte التي تزيد من فعالية ELISA عن طريق الحد من كل من استهلاك الكواشف، والوقت اللازم لكل عملية، أساسا، الوقت التجريبي الكلي (6 إلى 10 دقيقة). وعلاوة على ذلك، يتم إجراء اختبار الآلي مع التلاعب في الوقت المناسب من قطرات مما يقلل من الاختلافات ويحسن دقة مناعي¹⁷. تتضمن التجربة في شكلها الحالي معالجة يدوية للقطرات في بداية كل عملية اختبار، وهي نقطة لمزيد من المناقشة في القسم التالي.

خطوة واحدة حاسمة في طريقة DMF الحالية هو الاستغناء عن قطرات على سطح رقاقة EWOD. عادة، يتم استخدام ميكروبيبيت مع طرف المتاح لقياس حجم الدقيق وتحميله. ومع ذلك ، يمكن أن يصبح من الصعب شل القطرة على سطح الكاره للماء من لوحة التشغيل بسبب التفاعلات بين القطرة والسطح المشحون للطرف القابل للتصرف. ونتيجة لذلك، يمكن أن تقذف قطرات متابعة السطح الخارجي للطرف بدلاً من البقاء على لوحة. لتجنب هذا ، يجب أن تعقد micropipette في وضع تستقيم ، عمودي على سطح رقاقة ، دون لمسها ، ثم يمكن الاستغناء عن قطرات على لوحة التحميل عن طريق جعلها في اتصال مع السطح. وينبغي أن عصا قطرات إلى طرف ماصة، وإعادته إلى حل الأسهم، وتبادل تلميح وإعادة إيداع قطرة جديدة. وفي تطور آخر لنظام إثبات المفهوم الحالي، يمكن تصور التسليم التلقائي للقطرات.

خطوة أخرى حاسمة، قبل تشغيل الحسب، هو إغلاق غطاء التجميع لوحة متوازية. كما ذكر سابقا في البروتوكول، يجب أن ينزلق الغطاء على رأس لوحة التشغيل. يمنع السطح الكاره للماء للغطاء تشويه وإزاحة القطرات الجالسة على لوحة التشغيل. لضمان الحركة السلسة للقطرات ، يوصى بشدة باستخدام لوحة التشغيل البكر ، والتحميل الصحيح للقطرات وتجميع الشرائح. إمكانية إعادة استخدام لوحات التشغيل ممكن; ومع ذلك ، فإن عدد الدورات يعتمد على الفولتية الفولتية الفولتية(الشكل 3)وترسب analyte / كاشف على السطح ، ويعرف أيضا باسم biofouling. استخدمت المنصة المقدمة رقاقة EWOD المطبوعة بالكروم ، والتي يمكن إعادة استخدامها بشكل موثوق للقياسات المتتالية تصل إلى أربع مرات في الجهد التشغيلي من 120 V وتنظيف اللوحة المتوسطة بعد كل تجربة. تم إعادة تدوير لوحات، للحد من تكلفة التجربة الواحدة، عن طريق إزالة التلوث (تنظيف السطح بالتنظيف مع عامل التنظيف غير مخفف قبل الشطف بدقة) وbiofouled المفلورة غير متبلور(جدول المواد)طلاء وتدور طلاء واحد جديد على رأس لوحة. ومع ذلك ، يتطلب إعادة تدوير لوحة التشغيل مناولة يدوية ، وكواشف مكلفة (البوليمرات الفلورية غير المتبلور(جدول المواد))والمعدات المتخصصة (spin-coater). يتم التحقيق في رقائق EWOD البديلة بنجاح مع ركائز فعالة من حيث التكلفة مثل الورق¹⁹، أفلام خلات أو لوحات الدوائر المطبوعة (PCBs)^20،21. ويمكن لهذه المواد الاستهلاكية التي يمكن التخلص منها أن تيسر الاستخدام الموثوق والميسور التكلفة لمنصة DMF ويمكن أن توفر وسائل لتجنب مسألة القاذورات البيولوجية.

القذورات الحيوية هو القيد الرئيسي لEWOD للتطبيقات البيولوجية^22,23. وقد حددت الدراسات السابقة على DMF آليتين تساهمان في القاذورات الحيوية ، وهما الامتزاز السلبي بسبب التفاعلات الكارهة للماء ، والامتزاز الذي يحركه امتالية كهربائية ثابتة تظهر عند تطبيق حقل كهربائي^24. النتائج في المادة الحالية تتسق مع هذه النظرية كما تم توثيق لوحة قابلية الاستخدام يقلل من الفولتية تشغيل عالية. أحد التفسيرات الممكنة هو أن البروتينات الممتزة بسهولة على أسطح فلووبوليمر المغلفة (مثل تفلون) والتجميع بشكل أسرع على كريهة بالمقارنة مع الأسطح البكر²⁴. ونتيجة لذلك، من الصعب تحديد الاختبارات المتعلقة بالبروتين على DMF وقد تواجه فقدان تحليل النفس والتلوث المتبادل والدقة المتضائلة^17. السيناريو الأسوأ هو عندما كمية حرجة من امتصاص البروتين مما يجعل الجهاز عديم الفائدة. لتقليل القذورات الحيوية ، تم التحقيق في العديد من النهج من تقليل وقت الإقامة للقطرة على الشريحة ، من خلال الطلاء²³، إلى المواد المضافة (أي المواد السطحية أو حمض البلوروينك) في قطرات المواد الحيوية المحملة^6،22. ومن ثم فإن أحد الجوانب الهامة في عملية إجراء المناعة على EWOD هو اختيار استراتيجيات مضادة للقاذورات الحيوية التي تتوافق مع البروتوكول المحدد في متناول اليد.

تم تصميم منصة DMF الآلية لإجراء اختبار ELISA واحد لكل شوط من السندويشات مع استخدام وحدات تخزين ميكرولتر لكل من الكواشف وanalyte. عندما يكون مطلوبا، ساندويتش التقليدية مجموعات ELISA موجودة على أساس لوحات مغلفة مسبقا 96-well أو 384-well التي تؤدي إلى تركيبة مع معدات المختبرات المساعدة في إنتاجية أعلى لكل شوط؛ على أساس سعر الكواشف فقط ، فإن التكلفة التقريبية للكمية / البئر هي 6.04 دولار أمريكي (580 دولارأمريكي / 96) و 0.33 دولار أمريكي (2 × 580 دولارأمريكي / 384) على التوالي. وهذا يجعل أساليب ELISA التقليدية مثالية لعدد كبير من العينات التي يتم معالجتها عادة من قبل الموظفين التقنيين المدربين في مرافق المختبرات المركزية. غير أنه في المواقع النائية، أظهر التحليل التفصيلي لتكاليف ELISA للرصد البيئي أنه عندما أدرجت التكاليف الرأسمالية (أي تكاليف التشغيل المختبرية، والتكاليف المتكررة، ونقل العينات، والإمدادات، والأفراد) كان السعر الفعلي لكل ELISA 60 دولارا من دولارات الولايات المتحدة منها 34 دولارا للإمدادات لكل عينة²⁵. في المقابل ، فإن منصة DMF المقترحة محمولة ، وتتطلب الحد الأدنى من التدريب للعمل ، ومع الخرز المغلف مسبقًا يمكن أن يوفر تحليلًا من عينة إلى إجابة في دقائق. ومن ثم، يمكن نشر التكنولوجيا المعروضة في مواقع نقاط الاحتياج واستكمال التحليلات المتاحة في المختبرات المركزية.

في قسم النتائج التمثيلية ، تم استخدام منصة المناعة DMF الآلية للكشف المباشر عن مسببات الأمراض من أجل التطبيقات الدفاعية. وتشمل التطبيقات المحتملة الأخرى لمنصة DMF على سبيل المثال لا الحصر التشخيص الحيوي والرصد المستمر وأخذ العينات الآلية. من المحتمل أن يؤثر صندوق التنمية المستدامة على قطاعات متنوعة من نقطة الرعاية للرعاية الصحية الشخصية ، وكذلك مراقبة البيئة الخاضعة للرقابة لحماية المرضى من العدوى المكتسبة من المستشفى المحمولة جواً ، إلى نظام مراقبة المحاصيل للزراعة و إنتاج الغذاء.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES	Sigma-Aldrich	H9897
Anti-Human Serum Albumin [15C7]	Abcam	ab10241
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP)	Abcam	ab24438
B. atrophaeus (BG) spores	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Blocker Casein	Thermo Scientific	TFS 37582
CNC Dicing/Cutting Saw	MTI Corp, USA	SYJ-400
Cytop	AGC, Japan	CTL-809M	Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating.
E. coli MRE 162	Dstl, UK	N/a
Goat anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Hamamatsu photodiode	Hamamatsu, Japan	S9270
Hidrochloric acid (32%)	Sigma-Aldrich	W530574
Mask manufacturing service	Compugraphics, Scotland, UK	N/a
MS2 virus	Dstl, UK	N/a
Parylene-C, DPX-C	Specialty Coating System, USA	CAS No.: 28804-46-8
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit	Thermo Scientific	88828	Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C.
Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS	Abcam	ab201876
SCS Parylene Deposition System	Specialty Coating System, USA	2010
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm	Pi Kem Ltd	N/a
Spin Coater	SÜSS MicroTec AG, Germany
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo Scientific	37075	It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C.
Tween 80	Thermo Scientific	28328	The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution.