基于电润的数字微流体平台，用于自动酶链接免疫吸附测定

摘要

基于电润的数字微流体技术利用微升体积液滴表面接触角的电压驱动变化，便于操作。结合功能化磁珠，能够集成多个实验室单元操作，以便使用酶相关的免疫吸附测定 （ELISA） 制备样品和识别病原体。

摘要

电润是改变暴露于表面电荷的液滴接触角度的效果。电绝缘电（EWOD）利用薄绝缘体薄膜的介电特性来提高电荷密度，从而提高电润效果。电荷的存在导致电诱导的液滴扩散，从而允许有目的地在疏水表面进行操纵。在这里，我们演示了基于EWOD的协议，通过酶链接免疫吸附测定（ELISA）方法的两种变体，使用自动表面驱动平台，对四类抗原进行样品处理和检测。ELISA 在磁珠上执行，具有固定原抗体，可以选择这些抗体来靶向特定的抗原。与HRP结合的抗体与抗原结合，并与H₂O 2/Luminol混合，用于定量捕获的病原体。测定完成时间在6至10分钟之间，同时利用了极少的试剂量。

引言

该方法旨在通过使用基于EWOD的方法对抗原进行定量检测，通过数字微流体（DMF）和磁泳分离，促进ELISA的自动样品制备。已经证明，DMF与磁光合一是液体处理应用¹的有趣替代品。更具体地说，病原体的检测是许多领域的一个隐含方面，从医疗保健²到农业和环境^3，4到国家安全^5。能够应对病原体威胁的检测技术必须具有高通量（例如，短检测时间）、效率（低检测极限 + LoD + 和高灵敏度）和特异性（对目标病原体类型），才能使其正常工作⁶。

此前，基于EWOD的DMF已成功用于逆转录化聚合酶链反应（RT-PCR），利用低预算印刷电路板芯片和磁质学7检测耐抗生素病原体（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌或MRSA）、肺炎和C.albican。 该技术还应用于通过热测序和化学发光检测⁸检测脱氧核糖核酸（DNA）突变。基于 EWOD 的平台还将其功能扩展到免疫检测应用，从而在单个集成平台内实现同步样品恢复和检测。例如，通过DMF平台成功演示了单个EWOD芯片设计，用于全血样本中基于珠的免疫检测以及MRSA检测²的单独实验RT-PCR。该芯片利用石油填料，防止液滴蒸发，促进纳米升体积的可靠自动操作。在应用类似的DMF方法（包括定量均质和异质免疫测定^9，10包括用于测定^{参数优化的实验}（DoE）研究）中，对多功能生物应用进行了研究。

尽管由于工作量小，工艺集约化具有明显的优点，但充满油的 DMF 平台可能具有挑战性，并且需要一定的专业知识才能运行。充油系统需要密封部件，因此对于某些系统可运输性很重要的现场应用来说并不理想。此外，如果不是不可能，一个石油系统将非常困难，如果不是不可能地利用赵和赵12、Jónsson-Niedziááka等人¹³和Foat等人提出的表面干燥材料收集等特定应用。相比之下，无油系统易于集成，具有提供易于芯片到芯片的样品转换的优势。出于这些原因，开发该方法是为了在DMF上提供一种基于EWOD的免疫测定，无需油，从而有效地简化了设备操作。

在本文中，我们报告使用定制的、独立、完全自动化的DMF平台进行免疫测定，并详细阐述了快速检测生物分子（即:蛋白质、植物细菌、细菌孢子和病毒）的协议。EWOD芯片与磁性颗粒的结合，用于自动样品制备和免疫沉淀已经证明与额外的线下MS测量^15。最近，惠勒小组¹⁶日在肯尼亚西北部的偏远人群中对麻疹和风疹IgG进行了现场诊断。惠勒和我们的系统，可运输，自成一体，完全自动化，包括片上，实时化学发光测量可以说是最先进的DMF生物检测系统之一。

这两个系统的设计考虑到了非常不同的应用。惠勒的系统以生物标志物为目标，允许对患者进行生物医学诊断，而我们的生物检测系统则围绕直接检测以前从空气中取样的病原体的防御要求而构建。两者之间的相似性是滴驱动的基本原理，它证明了基于EWOD的技术可以影响的广泛影响生命的部门。即，基于DMF的检测平台和相关EWOD系统可以发现对健康的关键影响（生物医学诊断）;军事和民事保护（威胁探测）;农业技术（作物监测）和工作安全（受控环境监测）

我们的DMF平台的性能根据人类血清白蛋白（HSA，球状蛋白）、大肠杆菌（大肠杆菌、植物菌）、肌钙杆菌（BG、细菌孢子）和MS2（噬菌病毒）的全自动检测来评估。更重要的是，建议的DMF方法用途非常广泛，因为捕获抗体可以交换，以检测与本文中考虑的四种不同的其他抗原。DMF 平台完全避开了基于抗体的传感，可以构建一种基于 aptamer 生物传感的潜在应用，其中磁珠携带特定的贴切剂，用于捕获和/或检测核苷酸。构成集成、完全独立的DMF平台的不同组件，包括高压波形发生器和驱动电子装置的设计与实现，在其他地方^{被披露为6。}

研究方案

1. 测定所需的初步步骤

注（重要）:所有初步步骤必须在无菌环境中进行，以避免污染。阿齐德钠不应用于储存，因为它会抑制马萝卜过氧化物酶 （HRP） 酶的活性。

1. 准备运行缓冲液（100 mM HEPES，pH 7.5），使用（4-（2-羟基乙酰）烟碱-1-乙酸，并加入补80，浓度为0.01%（v/v）。
2. 按照供应商提供的协议，将主要抗体（捕获抗体）固定在NHS激活的磁性微珠表面。简而言之，磁性 IP/共同 IP 套件 （材料表） 协议包含以下步骤.
   1. 将0.2 mL的珠子（2mg）放入塑料管中，并去除上清液。
   2. 通过加入 1 mL 的冰冷 1 mM HCl 来清洗珠子。
   3. 将选定的抗体（抗人类血清白蛋白[15C7]，Rb抗BG多克隆，Rb抗大肠杆菌MRE 162多克隆或山羊抗MS2多克隆），40μg/mL在67 mM硼酸盐缓冲液中，共与珠子共发1小时，在37°C下摇动。表1包含当前协议使用的所有抗体和抗原病原体⁶的列表。
   4. 用0.8 mL洗脱缓冲液洗涤未结合的抗体两次。
   5. 用1 mL的淬火缓冲液将反应淬火1小时。
   6. 用改良的硼酸盐缓冲液清洗珠子一次，用IP冲洗/清洗缓冲液清洗一次。
   7. 将珠子重新悬浮在 0.5 mL 的 IP 液平/洗涤缓冲液中，并储存在 4°C 下，直到需要使用为止。
      注:为了获得最佳效果，在EWOD隔离和ELISA片上前一天，将一批新的微珠耦合到抗体中。然而，与原抗体耦合的微珠可在4°C下储存一个月。如果发生聚集，点击小瓶以打破沉淀物，并在溶液中重新悬浮珠子。
   8. 在100mM磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的阻滞剂卡辛（1%w/v）中，使用最终浓度4mg/mL为微珠在100m磷酸盐缓冲盐（PBS）中，用耦合抗体在一夜之间阻断微珠。
      注:阻止步骤始终在生物检测检测运行的前一天执行。
   9. 使用磁铁将珠子与块状卡辛分离，并去除上清液。
   10. 在运行缓冲液的 1 mL 中重新悬浮，混合 1 分钟。
   11. 使用磁铁分离磁珠并去除上清液。
   12. 重复上述洗涤步骤（1.2.10 和 1.2.11）两次。
       注:三个洗涤步骤足以减少珠子对表面的粘附，并方便水滴自由移动。
   13. 以2.5mg/mL的浓度在运行缓冲液中重新悬浮珠子。这种微珠解决方案可与EWOD芯片一起使用。
3. 在运行缓冲液中制备中性拉丁结合马萝卜过氧化物酶 （HRP） 和二次生物素化抗体的溶液，以最终浓度为运行缓冲液中每个 1 μg/mL（用于 BG 检测⁶）。
   注:针对抗原（表1）不同浓度的二次生物浸化抗体，测试范围为0.5至4.0微克/mL。
4. 在运行测定之前，将相同体积的 Luminol 与过氧化氢溶液混合
   注:Luminol用于根据HRP酶量化结合事件的数量，该酶与针对抗原的次级抗体（例如病原体）共价结合。然而，不同的报告分子和策略可用于检测^17，而不是化学发光和明醇。

2. EWOD芯片组件的制造和表面处理

注:EWOD芯片由带有图案铬电极的驱动板组成，用于交替液滴的表观接触角，盖板用于定义液滴的高度。

1. 使用标准 CAD 软件在 2D 中绘制电极和连接器的设计。还包括尺寸为 5 x 5 mm²的废物收集垫，以存放用过的溶剂（图 1）。
   注:为了操纵液滴，我们使用47个电极，每个电极的尺寸为1.7 x 1.7 mm^2。此电极尺寸可承受从 1.5 μL 到 3 μL（对于 500 μm 间隙）的电滴体积。根据经验，当处理 500 μm 间隙时，1.5 μL 是可激活的最小滴大小。它大致对应于被限定到方形焊盘上的滴（投影）轮廓。但是，除了流体体的阻力（摩擦）之外，没有任何理论上的大小限制。尽管如此，建议体积不超过3μL，以便使用500μm间隙进行可靠的驱动。电极由 48 通道电子器件寻址。
   注: 垫片的设计尺寸和尺寸可能因预期体积和构成协议的实验室单元操作 （LUO） 而异。
2. 将设计图纸发送到面罩制造部门，用于将铬面罩打印到玻璃基板上。铬层厚度为100纳米。
   注:根据定义，用作EWOD芯片基板的光掩膜上的铬层不透明。我们每个电极的设计都包括一个网格布局，以确保半透明。
3. 使用精密 CNC 切割/切割锯将板切割到 56 x 56 mm²的尺寸。
4. 在两个涂层步骤中，将遮蔽胶带粘在电气触点上，以便将其隔离。
5. 将 6 μm Parylene-C 沉积在板面上，将平板铬玻璃板与介电层涂上。Gorham 工艺¹⁸与 7.4 g DPX-C 一起使用，用于甲苯沉积系统（材料表）。
6. 在板顶部使用 1500 rpm 的旋涂层（材料表）旋转涂层非晶氟聚合物，在板顶部 30 s 上进行 30 秒的旋转涂层，并在 140°C 下烘烤 30 分钟。
   注:这会使表面疏水性。通过将水滴放在表面，可以验证涂层是否已成功沉积。滴和板之间的接触角必须位于 110o 区域。
7. 从电气触点上拆下遮蔽胶带。
8. 在 4 英寸硅晶圆顶部使用 1500 rpm 的旋涂层（材料表）旋转涂层非晶氟聚合物，在 30 s 上进行 30 秒的旋转，并在 140°C 下烘烤 30 分钟。
   注:驱动板和盖板的表面均具有疏水性，以便有助于在测定过程中离散液滴平稳移动，这一点很重要。

3. 在 DMF 平台上加载、组装和操作 EWOD 芯片

注:EWOD 芯片采用平行板配置，驱动板和导电接地盖板之间具有精确定义的间隙 0.5 mm。当前部分介绍了此三明治组件。

1. 从 DMF 平台⁶上取下盖子，并将其放在工作台上。
   注:在探测过程中，需要一个黑暗的法拉第笼室，以防止杂散光和电磁干扰。盖子上没有联锁，因此，平台允许我们观察液滴的运动。
2. 将干净的驱动板放在旋转台上，铬朝上。板需要与凹陷阶段的左上角对齐（图 2A）。
3. 使用带有 47 个触点销的面板从顶部夹紧驱动板。这样将板固定到位，便于与接触销对齐。
4. 将 0.5 mm 垫片和 2 mm 聚甲基丙烯酸酯 （PMMA） 分离器放在旋转台上，以便在驱动和盖板之间提供受控间隙。
   注:在下一步之前，在将液滴等分之前，可以将芯纸放在废物处理垫上。随着测定的进行，废物被直接吸收到纸张中，在测定结束时可以去除。
5. 将液滴加载到建议的装载垫上（图 1）。
   1. 从运行缓冲液到 B、A、R-、E 表示垫上的四个 2.5 μL 液滴，每个焊盘上一个液滴。
   2. Luminol 的 2.5 μL 铝分:H₂O₂ （1:1，v/v） 溶液到 D 表示的焊盘上。
   3. 与 HRP （1 μg/mL） 结合到 F 表示垫上的 Neutravidin 的 2.5 μL 的阿利特 2.5 μL。
   4. 对G表示垫的二次抗体（1微克/mL）的阿利胶2.5μL。
   5. 与共聚原抗体（2.5 mg/mL）的微珠的Aliquote 2.5 μL进入I-表示垫。
   6. 未知样品的等量2.5 μL到C-表示垫上。
      注: 建议的加载模式只是实验布局的一个示例，但是，只要这些更改与软件中定义的序列（补充文件 1） 匹配，就可以更改加载模式以满足用户的需求。
6. 将盖板放在钻机表面，除了圆形凹槽区域外，横向将其滑入凹槽和驱动板顶部（图 2B）。
7. 将永磁体放在盖板顶部，通过滑动两个闩锁将其固定（图2C）。
8. 将舞台旋转 180°，并目视检查装载的液滴是否仍然就位（图 1C）。
   注:一个人应该能够通过透明阶段和驱动板的背面盯着液滴的位置和形状（图2D）。如果在装载电极垫上可以看到圆形液滴，则测定即可运行。在移位液滴的情况下，可以取下磁铁和盖板，然后用干净的移液器回收取落液滴，并将其再次放在装载板上。
9. 检查每个滴的加载位置是否与软件中编程的驱动顺序匹配（有关软件的详细信息，请参阅补充文件 1）。
   注:为了能够目视地检查液滴的位置，需要拆卸光电探测器（图2D）。
10. 将经过筛选的光电探测器"罐"放入旋转舞台的插槽中。
    注:光检测系统围绕光电二极管旋转，光电二极管具有较大的收集区域（10 x 10 mm^2），可在没有额外光学器件的情况下最大化光收集，外加一个跨阻抗放大器，以尽量减少噪声^6。但是，系统非常敏感，可以收集分钟信号。为了降低噪音水平，实施了一些基于电子的策略（例如，光检测系统通过将其置于法拉第笼中（一种称为屏蔽"罐"的金属外壳）加以保护。
11. 将电缆连接到经过屏蔽的"罐"的光电探测器。
    注:EWOD芯片与光电探测器对齐后，DMF 平台已完全组装完毕，现在可以运行。
12. 将盖子放在 DMF 平台上，使用赫特福德郡大学开发的软件界面启动程序序列。
    注:附加软件用于读取和记录从滴中的发光作为 CSV 文件中的时间函数（参见补充文件 2）。
    1. 确保接口上出现已编程的序列（参见补充文件 1）提示消息，以通知操作员"发光醇滴已准备好收集提取的磁珠"或"检测滴已准备好移动到检测站点"。在这两种情况下，都需要操作员确认才能继续序列。

4. 在可视模式下操作（可选用于优化协议）

注: 如果需要，为了可视化每个基于滴的操作，可以通过跳过步骤 3.10-3.12 操作，并用以下操作替换它们来操作。

1. 使用软件接口启动程序序列。
   注: 在可视模式下操作时，可以观察到滴运动，这在协议优化期间非常有用。首先，检查磁分离操作的可重复性。例如，如果使用的珠子量过低，就不会发生磁分离，反之亦然，如果珠子量过高，则珠子颗粒可能会固定。其次，确定新测定的可靠性，因为某些滴分配方可能导致驱动损伤，可以通过观察检测。
2. 在提示时将经过筛选的光电探测器"罐"安装到旋转阶段的狭缝中。
3. 通过将针脚插入插座，将电缆连接到经过屏蔽的"罐"的光电探测器。
4. 将盖子放在 DMF 平台上，然后恢复测定。
   注: 使用附加软件读取和记录来自滴中的发光作为 CSV 文件中的时间函数（请参阅补充文件 2）

5. 清除液体废物并清洁芯片

注意:在清洁之前，请确保设备已关闭并断开与电源（计算机、主电源）的连接。从芯片中取出生物样品时，请戴上手套、实验室外衣和护目镜防护罩 （PPE） ！

1. 要访问驱动板上的电极和用过的溶剂，请打开 DMF 平台盖并旋转 180° 的阶段。
2. 解开磁铁外壳，将磁铁从旋转舞台上取下，并将其放在工作台上。
3. 用一对钳子从狭缝中取出盖板硅片，用DI水冲洗，用压缩空气干燥，然后放入培养皿中，在那里可以储存和重复使用晶圆。
4. 使用微移液器在不接触表面的情况下将液体废物从焊盘中移动。
5. 使用吸水纸（过滤材料）从驱动板上吸出液体，清洁表面。
   注:保持表面完好无损将提高驱动板的寿命，允许多种使用。
6. 使用干净的移液器用干净的 DI 水滴轻轻扫过电极表面，清洁驱动板。然后用芯纸（过滤材料）取出滴。
   注意:将被生物材料污染的纸巾、纸张、移液器尖端和手套放入生物垃圾箱。
7. 使用驱动板进行不同的测定，或将其从 DMF 平台中取出，以便存储或回收。

结果

研究了驱动电压影响，以阐明执行测定的最佳条件。缓冲液中的液滴在各种驱动电压下驱动，并记录其运动。结果表明（图3）根均方驱动电压（V_rms）与平均速度之间存在相关性。然而，当使用V_rms的高值时，驱动板的寿命会缩短。根据这些结果，选择105 V_rms作为标准驱动电压，120 V_rms被认为最适合 H₂O₂/Luminol 滴，165 V_rms用于萃取 LUO。这些电压包含在自动编程序列 （补充文件 1） 中。

两种免疫测定（图4）使用EWOD芯片和DMF平台对四种不同病原体进行了成功测试（表1）。EWOD 芯片有助于液滴从装载垫到混合区域，最后到废物的连续移动。在整个协议中重复了两个基本的 LUO 来完成 ELISA。第一种是提取 LUO;这里简要描述，含有悬浮珠子的滴被驱动到混合区中间的分离点，磁体被自动激活，接近芯片，并将磁珠集中到颗粒中（图5）。接下来，滴移向废垫，将珠子留在驱动板上，从而完成提取 LUO。混合是 EWOD 芯片上下一个关键 LUO。病原体浓度不明的Anlyate样品通过电润移被移到珠子上。然后，通过将带结块珠子的滴子移到混合区域（共 10 个焊盘）来重新悬浮。这两个 LUO 至关重要，因为它们在 6 到 10 分钟内连续检测病原体，促进了小型化、快速和可重复的样品处理。图 6显示了使用 EWOD 芯片完成的免疫测定的 LUO 的完整序列。

为了满足所需的自动化水平，可以引入协议中的变体。例如，珠子从抗原耗尽的滴中分离，然后转移到废垫上，重复基本的萃取LUO。在此阶段，该协议可以根据检测抗体是否已与HRP结合，有效地使用8个LUO检测不同的抗原（图7A-C）。在这些情况下，带有检测抗体的滴被带到珠子上，然后通过驱动混合。或者，将检测抗体与Neutravidin-HRP结合物结合可以在EWOD芯片上按位原位进行，正如证明大肠杆菌的定量（图7D）所示。这两种方案，即八步和十步ELISA（图4），产生了抗原的可重复检测。

孵育时间和结合浓度各不相同，以在实验上找到测定的最佳条件（图7A）。结果发现，160s的孵育时间和2μg/mL的偶联浓度达到最佳信号噪声比，信号强度提高了36%，背景噪声水平几乎没有变化。代表结果部分中使用的所有数字和数据均从先前的工作⁶中进行了修改。

原发性/捕获抗体	检测抗体	抗原
抗人类血清白蛋白 [15C7] （抗HSA， Abcam ab10241）	马萝卜过氧化物酶 （HRP） 标记抗 HSA [1A9] （Abcam ab24438）	人血清白蛋白（HSA，Abcam）
Rb 抗 BG 多边克隆	生物素化Rb抗BG多边克隆	B. 球状（BG）孢子
Rb 抗大肠杆菌 MRE 162 多克隆	生物素化 Rb 抗大肠杆菌 162 MRE 多克隆	大肠杆菌 MRE 162
山羊抗MS2多边克隆	生物素化Rb抗MS2多克隆	MS2噬菌体病毒

表1:使用本方案测试的抗原和抗体。使用四种病原体抗原来演示EWOD芯片与DMF平台的能力。

图1:EWOD板的设计。（a） EWOD 驱动板的示意图，带有与电极（方形、底部）相连的连接器（方形、顶部）。每个键盘都分配了一个号码，可以从软件代码（补充文件1）寻址。装载电极垫用箭头标记，每个焊盘上方或下方用大写字母表示。DMF 平台的一个关键功能是由 10 个焊盘（31、32、33、36、37、42、43、44、46、47）组成的混合区。作为视觉指南，混合区域用红色矩形标记。（b） 垫片微电网设计的显微图。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:数字微流体系统（DMF）组件和关键阶段。（A）固定 EWOD 驱动板，将板型板放在旋转舞台上并装载液滴。（B）放置盖板。（C）安装磁铁壳，固定闩锁并旋转舞台 180°。（D）自动磁体指向下方。检查液滴的位置和形状，检查印刷电路板 （PCB） 引脚是否与 EWOD 芯片上的触点对齐，连接光电探测器并将其放入光电探测器插槽中。将控制电子装置连接到计算机后，系统已准备好运行测定。请点击此处查看此图的较大版本。

图3:驱动板的重复使用及其对驱动电压的影响。运行缓冲液液滴的平均速度绘制为驱动电压（蓝色圆圈）和三个独立测量值（N = 3）的标准偏差的函数。此处，每板（灰条）的测定数表示在较高电压下表面的衰减增强。请点击此处查看此图的较大版本。

图4:使用EWOD测试的免疫测定图。此图中的每个圆圈表示加载到 EWOD 芯片上的 2.5 μL 的体积。第一个协议（左侧）显示8个使用预混合抗体-HRP结合的LUO;同时，第二个协议包括10个LUO，分别添加生物素化检测抗体、珠子提取和Neutravidin-HRP结合的连续结合。请点击此处查看此图的较大版本。

图5:磁珠提取。此过程被分解为（a-c）将带悬浮磁珠的滴激活到混合区中间的磁分离点（第 33 号垫），（d， e）磁体移入聚焦磁珠的位置，（f、g、h）磁珠被磁力保持到位，而流滴则由 EWOD 向废垫（垫号 41）激活。请点击此处查看此图的较大版本。

图6:使用EWOD完成免疫测定序列，显示试剂、样品加载和实验室单元操作。每行包含来自滴上特征操作的一系列示例图像。操作分为列。不为悬架上的珠子进行混合，由黑色折断线呈现。滴路方向由蓝色箭头指示，珠子在其中一个图像中用橙色箭头突出显示。灰色框（右下角）分隔表示检测区域中移动和位置的两个图像，断线圆圈突出显示检测区域。请点击此处查看此图的较大版本。

图7:使用DMF平台在EWOD芯片上进行的免疫测定校准曲线。如先前报告^的那样，输出电压 （mV） 与浓度的显示为: （A）人血清白蛋白， 用于研究结合抗体浓度 [C] 和孵育时间（t_inc），从将珠子与已知分析物混合到提取 LUO、（B） B. 萎缩原（BG） 孢子显示免疫测定的可重复性，（C） MS2 噬菌体免疫测定和（D）十 LUO 协议结果大肠杆菌.缩写:菌群形成单元（cfu）、斑块形成单元（pfu）、独立实验数（N）、实验室单元操作（LUO）。从上一个出版物⁶中修改的图 。请点击此处查看此图的较大版本。

补充文件1:以Neutravidin-HRP为结合的自动ELISA测定运行DMF平台的完整序列。请点击此处下载此文件。

补充文件2:显示了化学发光测量的GUI和软件测量的实例。请点击此处下载此文件。

讨论

EWOD 免疫测定方案非常灵活，可以包括各种数量的实验室单元操作（例如，捕获抗原、混合、孵育、珠子提取、洗涤），具体取决于检测协议定义的试剂类型、稳定性和使用要求。作为原则证明，在本篇文章中，两个免疫测定协议被认为显示使用EWOD芯片实现的八或十个LUO（图4）。这种小型化的优点来自微升、离散试剂/解毒剂体积，通过减少试剂的消耗、每次手术所需的时间（基本上为总实验时间（6至10分钟）来提高ELISA的功效。此外，通过定时操作液滴，测定是自动化的，减少了变异，提高了免疫测定¹⁷的精度。以目前的格式，该实验涉及在每个测定开始时手动处理液滴，这是下一节中进一步讨论的一点。

当前 DMF 方法的一个关键步骤是将液滴分到 EWOD 芯片表面。通常，带有一次性尖端的微移液器用于测量精确体积并加载它。然而，由于液滴与一次性尖端的带电表面之间的相互作用，在驱动板的疏水表面上固定液滴可能会变得具有挑战性。因此，水滴可以按照尖端的外表面向上射击，而不是停留在板上。为了避免这种情况，微移液器必须保持直立位置，垂直于芯片表面，无需接触，然后通过使其与表面接触，可以将液滴分配到装载板上。如果液滴粘在移液器尖端，将其返回到库存溶液，交换尖端并重新存放新的液滴。在进一步发展目前的概念验证系统时，可以设想自动交付电滴。

在运行测定之前，另一个关键步骤是关闭平行板组件的盖子。如协议前面所述，盖子必须滑到驱动板的顶部。盖子的疏水表面可防止位于驱动板上的液滴变形和位移。为了保证液滴的平稳移动，强烈建议使用原始驱动板、正确装载液滴和芯片组件。驱动板的可重用性是可能的;然而，循环次数取决于驱动电压（图3）和分析剂/试剂沉积到表面，又名生物污染。该平台采用镀铬印花EWOD芯片，可在120 V的工作电压下连续测量多达4次，每次实验后进行中间板清洗， 可可靠地重复使用。板材被回收，以降低每次实验的成本，通过去污（在彻底洗污之前用未稀释的清洁剂刷表面），生物污染的非晶状氟聚合物（材料表）涂层和旋转涂层在板的顶部新鲜。然而，驱动板回收需要手动处理、昂贵的试剂（非晶态氟聚合物（材料表））和专用设备（纺布涂层）。替代EWOD芯片成功地研究与具有成本效益的基板，如纸^19，醋酸薄膜或印刷电路板（PCB）20，21。这种一次性耗材可以促进 DMF 平台的可靠和负担得起的使用，并提供避开生物污染问题的方法。

生物污染是EWOD在生物应用中的主要限制^22，23。早期对DMF的研究已经确定了两种促进生物污染的机制，即疏水相互作用引起的被动吸附，以及施加电场时电驱动吸附的电化吸收^。本文中的发现与这一理论一致，因为据记载，驱动板在高驱动电压下可重用性降低。一个可能的解释是，蛋白质在氟聚合物涂层（类似铁氟龙）表面容易吸附，与原始表面相比，在结垢时聚合得更快^24。因此，DMF上与蛋白质相关的检测很难量化，并可能遭受分析剂损失、交叉污染和精度降低^17。最坏的情况是，当一个临界量的蛋白质吸附，从而使设备无用的。为了尽量减少生物污染，已经研究了各种方法，从最小化芯片上液滴的停留时间，通过涂层^23，到添加剂（即表面活性剂或普鲁辛酸）到生物材料载重液滴^6，22。因此，EWOD免疫测定的一个重要方面是选择与现有特定方案兼容的抗生物污染策略。

自动化 DMF 平台设计为每次运行执行单个三明治 ELISA 测试，同时对试剂和分析试剂使用微升体积。必要时，传统的三明治ELISA套件基于预涂96孔或384孔板，与辅助实验室设备相结合，可提高每次运行的吞吐量;仅根据试剂价格，每个测定/井的大致成本分别为6.04美元（580美元/96美元）和0.33美元（2~580美元/384美元）。这使得传统的ELISA方法非常适合在集中实验室设施中经过培训的技术人员处理的大量样品。然而，在偏远地区，环境监测ELISA的详细成本分析表明，当资本成本（即实验室运营成本、经常性费用、样品运输、用品和人员）包括在内时，每个ELISA的实际价格为60美元，其中34美元用于每个样品²⁵的用品。相比之下，建议的DMF平台是便携式的，需要最少的操作训练，预涂覆珠可以在几分钟内提供样品到答案的分析。因此，所提出的技术可以部署到需要点的位置，并补充中央实验室中现有的分析。

在代表性结果部分，自动化DMF免疫测定平台用于直接检测病原体，用于防御应用。DMF 平台的其他可能应用包括但不限于生物诊断、连续监控和自动采样。DMF 可能会影响不同部门，从个性化医疗保健的护理点，以及保护患者免受空气传播感染的受控环境监测，到农业和作物监测系统粮食生产。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES	Sigma-Aldrich	H9897
Anti-Human Serum Albumin [15C7]	Abcam	ab10241
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP)	Abcam	ab24438
B. atrophaeus (BG) spores	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Blocker Casein	Thermo Scientific	TFS 37582
CNC Dicing/Cutting Saw	MTI Corp, USA	SYJ-400
Cytop	AGC, Japan	CTL-809M	Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating.
E. coli MRE 162	Dstl, UK	N/a
Goat anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Hamamatsu photodiode	Hamamatsu, Japan	S9270
Hidrochloric acid (32%)	Sigma-Aldrich	W530574
Mask manufacturing service	Compugraphics, Scotland, UK	N/a
MS2 virus	Dstl, UK	N/a
Parylene-C, DPX-C	Specialty Coating System, USA	CAS No.: 28804-46-8
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit	Thermo Scientific	88828	Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C.
Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS	Abcam	ab201876
SCS Parylene Deposition System	Specialty Coating System, USA	2010
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm	Pi Kem Ltd	N/a
Spin Coater	SÜSS MicroTec AG, Germany
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo Scientific	37075	It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C.
Tween 80	Thermo Scientific	28328	The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution.