Otomatik Enzimbağlantılı İmmünosorbent Assay için Elektrowetting tabanlı Dijital Mikroakışkanplatformu

Özet

Elektrowetting tabanlı dijital mikroakışkan, manipülasyonunu kolaylaştırmak için mikrolitre hacimli damlacıkların görünür temas açısında voltaj güdümlü bir değişiklik kullanan bir tekniktir. Bunu fonksiyonel manyetik boncuklarla birleştirmek, enzime bağlı İmmünosorbent Test (ELISA) kullanılarak numune hazırlama ve patojenlerin tanımlanması için birden fazla laboratuvar ünitesi operasyonunun entegrasyonunu sağlar.

Özet

Elektrowetting, yüzey yüküne maruz kalan bir damlacık kontak açısının değiştirildiği etkidir. Elektrowetting-on-dielectric (EWOD) yük yoğunluğunu artırmak ve dolayısıyla elektrowetting etkisini artırmak için ince yalıtkan filmlerin dielektrik özelliklerinden yararlanır. Yüklerin varlığı, hidrofobik bir yüzeyde kasıtlı manipülasyona izin veren damlacıkların elektriksel olarak yayılmasına neden olabilir. Burada, enzime bağlı İmmünosorbent (ELISA) yöntemlerinin iki varyasyonu aracılığıyla otomatik bir yüzey harekete geçme platformu kullanarak dört kategoride antijenin numune işlenmesi ve saptanması için EWOD tabanlı protokol gösteriyoruz. ELISA belirli bir antijenhedef seçilebilir immobilize primer antikorlar ile manyetik boncuklar üzerinde yapılır. HRP'ye konjuge bir antikor antijene bağlanır ve yakalanan patojenlerin sayısallaştırılması için H₂O₂/Luminol ile karıştırılır. 6 ile 10 dk arasında bir araştırma tamamlanma süreleri elde edilirken, küçük hacimlerde reaktif kullanıldı.

Giriş

Önerilen yöntem, dijital mikroakışkanlar (DMF) ve manyetoforetik ayırma ile EWOD tabanlı yaklaşım kullanarak antijenlerin kantitatif tespiti ile ELISA için otomatik numune hazırlamayı kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Bu manyetoforez ile birlikte DMF sıvı işleme uygulamaları¹ilginç bir alternatif olduğunu birden fazla biyolojik uygulamalar için gösterilmiştir. Daha spesifik olarak, patojenlerin tespiti sağlık² tarım ve çevre^3,4 ulusal güvenlik⁵arasında değişen birçok sektörde örtük bir yönüdür. Patojenlerden gelen tehditleri ele alabilen bir algılama teknolojisi,^fonksiyonelolması için yüksek verim (örn. kısa çalışma süresi), verimlilik (düşük Algılama Limiti – LoD – ve yüksek hassasiyet) ve özgüllük (hedef patojen tipine) içermelidir 6 .

Daha önce, EWOD tabanlı DMF, ters transkripsiyon polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR), antibiyotiğe dirençli patojen (Metisiline dirençli Staphylococcus aureaus veya MRSA), M.pneumonia ve C.albicans düşük bütçeli, baskılı devre-kart çipi ve manyetophorez 7 kullanılarak başarıyla uygulanmıştır. Bu teknik aynı zamanda piroksatik ve kemilüminesans tespiti ile deoksiribonükleik asit (DNA) mutasyonlarının saptanması için de uygulanmıştır⁸. EWOD tabanlı platformlar aynı zamanda immunoassay uygulamalarına yönelik işlevselliklerini genişleterek, tek bir entegre platformda eşzamanlı numune geri kazanımı ve tespitine olanak sağlar. Örneğin, tek bir EWOD-chip tasarım başarıyla bir tam kan örneği kardiyak troponin I boncuk tabanlı immünoassays için bakım noktası testi için bir DMF platformu ile gösterilmiştir ve MRSA algılama için ayrı bir deney RT-PCR^{olarak 2}. Bu çip, damlacıkların buharlaşmasını önleyen ve nanolitre hacimlerinin güvenilir otomatik manipülasyonuna olanak sağlayan yağ dolgusu kullanır. Çok yönlü biyouygulamalar, kantitatif homojen ve heterojen immünoassays 9 kapsayan benzer DMF yaklaşımlarının uygulanması ile araştırıldı^9,10 tahlil parametre optimizasyonu için deneylerin tasarımı da dahil olmak üzere (DoE) çalışmalar¹¹.

Küçük çalışma hacimleri nedeniyle yoğunlaşmayı işlemek için bariz yararları rağmen, bir yağ dolu DMF platformu zor olabilir ve çalışması için uzmanlık belirli bir düzeyde gerektirir. Yağ dolu sistemler, kapalı bileşen gerektirdiğinden, sistem taşınabilirliğinin önemli olduğu belirli saha içi uygulamalar için ideal değildir. Buna ek olarak, bir yağ tabanlı sistem zhao ve Cho¹², Jönsson-Niedziółka ve ark.¹³tarafından önerilen bir yüzeyüzerinde kuru malzeme toplama yararlanarak bazı özel uygulamalar için kullanmak imkansız değilse çok zor olurdu , ve Foat et al.¹⁴. Buna karşılık, yağsız sistemlerin entegre sayılması kolaydır ve kolay yongadan çipe numune çevirisi sağlama avantajına sahiptir. Bu nedenlerden dolayı, önerilen yöntem, dmf üzerinde yağ gerektirmeyen ewod tabanlı bir immünoassay sağlamak ve cihazın çalışmasını etkili bir şekilde basitleştirmek için geliştirilmiştir.

Bu katkıda, immünoasiler için ısmarlama, serbest duran, tam otomatik bir DMF platformu kullanarak rapor ve biyomoleküllerin hızlı tespiti için protokol üzerinde ayrıntılı, yani: proteinler, bitkisel bakteriler, bakteriyel sporlar ve virüsler. Otomatik numune hazırlama ve immünoprepitasyon için manyetik parçacıklar ile EWOD-çip kombinasyonu ek bir off-line MS ölçümü ile zaten gösterilmiştir¹⁵. Son zamanlarda, kızamık ve kızamıkçık IgG karşı alan tanı Wheeler grup¹⁶tarafından uzak Northwestern Kenya nüfusunda gösterilmiştir . Hem Wheeler's ve sistemimiz, taşınabilir olmak, kendi kendine yeten, tam otomatik çip dahil, gerçek zamanlı kemilüminesan ölçümler ilerlemiş en gelişmiş DMF biyoalgılama sistemleri arasında tartışmasız.

Bu iki sistem çok farklı uygulamalar düşünülarak tasarlanmıştır. Wheeler'ın sistemi, hastalar üzerinde biyomedikal tanıya izin vermek için biyobelirteci hedeflerken, biyoalgılama sistemimiz daha önce havadan örneklenmiş patojenin doğrudan tespiti için savunma gereksinimi etrafında inşa edilmiştir. İkisi arasındaki benzerlik, EWOD tabanlı teknolojinin etkileyebileceği çok çeşitli yaşamı etkileyen sektörleri gösteren damlacık harekete geçmenin temel prensibidir. Yani, DMF tabanlı algılama platformu ve ilgili EWOD sistemi sağlık (biyomedikal tanı) önemli ima bulabilir; askeri ve sivil koruma (tehdit tespiti); Tarım teknolojisi (mahsul izleme) ve iş güvenliği (kontrollü çevre izleme)

Bizim DMF platformunun performansı insan serum albumin (HSA, bir küresel protein), Escherichia coli (E. coli, bir vegetatif bakteri), Bacillus atrophaeus (BG, bir bakterispor) ve MS2 (bir bakteriyofaj virüsü) tam otomatik tespitine karşı değerlendirilir. Daha da önemlisi, önerilen DMF-yöntemi yakalama antikorları bu makalede kabul edilen dört farklı diğer antijenlerin tespitini hedef olarak değiştirilebilir anlamında son derece çok yönlüdür. Antikor bazlı algılamayı tamamen kenara atan DMF platformu, manyetik boncukların nükleotitlerin yakalanması ve/veya tespiti için spesifik aptamerler taşıdığı aptamer biosensing'e dayalı potansiyel bir uygulamaya neden olabilir. Yüksek gerilim dalga formu jeneratörü ve sürücü elektroniği de dahil olmak üzere entegre, tamamen bağımsız DMF platformu oluşturan farklı bileşenlerin tasarımı ve gerçekleştirilmesi^başkabir yerde 6 açıklanmıştır.

Protokol

1. Ön atama için gerekli ön adımlar

NOT (ÖNEMLİ): Kontaminasyonları önlemek için tüm ön adımlar steril bir ortamda yapılmalıdır. Sodyum azit, horseradish peroksidaz (HRP) enziminin aktivitesini inhibe edeceği için depolama için kullanılmamalıdır.

1. Çalışan tampon (100 mM HEPES, pH 7.5), (4-(2-hidroksitil) piperazin-1-etanesülfonik asit kullanarak hazırlayın ve % 0.01 (v/v) konsantrasyonuna Tween 80 ekleyin.
2. Tedarikçi tarafından sağlanan protokolü izleyerek birincil antikorları (yakalama antikorları) NHS tarafından aktive edilmiş manyetik mikroboncukların yüzeyine yerleştirin. Kısaca, Manyetik IP/Co-IP Kiti(Malzeme Tablosu)protokolü aşağıdaki adımları kapsar.
   1. Aliquot 0.2 boncuk mL (2 mg) plastik bir tüp içine ve supernatant çıkarın.
   2. 1 mL buz gibi 1 mM HCl ekleyerek boncukları yıkayın.
   3. Seçilen antikor (Anti-Human Serum Albumin [15C7], Rb anti-BG poliklonal, Rbanti-e.coli MRE 162 poliklonal veya Keçi anti-MS2 poliklonal), 40 μg/mL 67 mM Borate Tampon, 37 °C'de sallayarak 1 saat boyunca boncuklara bağlayın. Tablo 1, mevcut protokol ve antijen patojenleri 6ile kullanılan tüm antikorların listesini içerir.
   4. 0,8 mL Elütion Tampon ile bağlanmamış antikorları iki kez yıkayın.
   5. 1 mL'lik Quenching Tampon ile reaksiyonu 1 saat bastırın.
   6. Boncukları Modifiye Borat Tamponu ile bir kez ve IP Lysis/Wash Tampon ile bir kez yıkayın.
   7. 0,5 mL IP Lysis/Wash Tampon'da boncukları yeniden askıya alın ve kullanım için gerekli olana kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: En iyi sonuçlar için, mikroboncuklar taze bir toplu eWOD-izolasyon ve ELISA on-chip önceki gün antikorlar birleştiğinde. Ancak, birincil antikorile birleşen mikroboncuklar 4 °C'de bir aya kadar saklanabilir. Aglomerasyon oluşursa, çökelti kırmak ve çözeltideki boncukları yeniden askıya almak için şişeye dokunun.
   8. 100 mM fosfat tamponlu salinde (PBS) bloker kazeinde (%1 w/v) mikroboncuklar için son konsantrasyon 4 mg/mL kullanarak bir gecede birleşen antikorile mikroboncukları bloke edin.
      NOT: Engelleme adımı her zaman biyoalgılama tayini çalışmadan bir gün önce gerçekleştirilir.
   9. Bir mıknatıs kullanarak Bloker Kazein boncuk ayırın ve supernatant çıkarın.
   10. 1 mL çalışan tampon ve 1 dakika için karıştırın resuspend.
   11. Mıknatıs kullanarak boncuk ayırın ve supernatant kaldırın.
   12. Yukarıdaki yıkama adımlarını (1.2.10 ve 1.2.11) iki kez tekrarlayın.
       NOT: Boncukların yüzeye yapışmasını azaltmak ve damlacıkların serbest dolaşımını kolaylaştırmak için üç yıkama adımı yeterlidir.
   13. Çalışan tampondaki boncukları 2.5 mg/mL konsantrasyonda yeniden askıya alın. Mikroboncukların bu çözümü EWOD çipi ile kullanıma hazırdır.
3. Neutravidin konjuge horseradish peroksidaz bir çözüm hazırlayın (HRP) ve çalışan Tampon 1 μg / mL her biri için son bir konsantrasyon için ikincil biyotinylated antikor (BG algılama için kullanılan^6).
   NOT: Antijenleri hedeflemek için(Tablo 1) 0,5 ile 4,0 μg/mL arasında değişen sekonder biyotinylated antikor konsantrasyonları başarıyla test edildi.
4. Tam teşp'yi çalıştırmadan önce eşit hacimlerde Hidrojen peroksit çözeltisi ile Luminol'ü karıştırın
   NOT: Luminol, antijeni (örn. patojen) hedefleyen ikincil antikora kovalent olarak bağlı olan HRP enzimine dayalı bağlanma olaylarının sayısını ölçmek için kullanılır. Ancak, farklı raporlama molekülü ve stratejileri kemilüminesans ve Luminol yerine algılama¹⁷ için kullanılabilir.

2. EWOD yonga bileşenlerinin imalatı ve yüzey işlemesi

NOT: EWOD çipi, damlacıkların yüksekliğini tanımlamak için bir damlacık görünür temas açısını alternatif olarak desenli krom elektrotlara sahip bir aktüasyon plakası ve bir kapak plakası oluşur.

1. Standart CAD yazılımı kullanarak elektrotların ve konektörlerin tasarımını 2B olarak çizin. Kullanılan çözücüleri depolamak için 5 x 5 mm² boyutlarında atık toplama pedini de ekleyin(Şekil 1).
   NOT: Damlacıkları işlemek için her biri 1,7 x 1,7 mm²boyutlarında 47 elektrot kullanıyoruz. Bu elektrot boyutu, 1,5 μL ile 3 μL (500 μm boşluk için) arasında değişen damlacık hacimlerini karşılar. Deneyimlerinden, 500 μm boşlukla çalışırken, 1,5 μL, çalıştırılabilen minimum damlacık boyutudur. Kabaca damlacık (öngörülen) kontur kare pad ile sınırlanan karşılık gelir. Ancak, sıvı nın gövdesinin direnci (sürtünmesi) dışında herhangi bir teorik sınır yoktur. Bununla birlikte, 500 μm'lik bir boşluk kullanarak güvenilir bir aktüasyon için hacmin 3 μL'yi aşmaması önerilir. Elektrotlar 48 kanallı elektronik ile ele alınmıştır.
   NOT: Pedlerin tasarım boyutları ve boyutları, planlanan hacimlere ve protokolü oluşturan laboratuvar birimi operasyonlarına (LUOs) bağlı olarak değişebilir.
2. Krom maskesini cam bir alt tabaka üzerine yazdırmak için tasarım çizimini maske üretim hizmetine gönderin. Krom tabakasının kalınlığı 100 nm'dir.
   NOT: EWOD çipi için substrat olarak kullanılan fotomaskeüzerindeki krom tabakası tanımı gereği opaktır. Elektrotlarımızın her birinin tasarımı, yarı saydamlığı sağlamak için bir ızgara düzeni içerir.
3. Hassas bir CNC Dicing/Cutting Saw ile plakayı 56 x 56 mm² boyutuna kesin.
4. İki kaplama adımı sırasında onları izole etmek için elektrik kontağından maskeleme bandı yapıştırın.
5. Yüzeyine 6 μm Parylene-C yatırarak dielektrik bir tabaka ile plaka krom-cam plaka katlayın. Gorham prosesi^18, Parylene Biriktirme Sistemi'nde(Malzeme Tablosu)7,4 g DPX-C ile kullanılır.
6. Spin-coat amorf floropolimerler(Tablo Malzemeler) plaka üstüne 30 s için 1500 rpm bir spin-coater kullanarak ve 30 dakika boyunca 140 °C pişirin.
   NOT: Bu yüzey hidrofobik hale getirir. Kaplamanın yüzeye bir damlacık su koyarak başarılı bir şekilde yatırılıp yatırılmadığı doğrulanabilir. Damlacık ile plaka arasındaki temas açısı 110º bölgede olmalıdır.
7. Elektrik kontağından maskeleme bandını çıkarın.
8. Spin-coat amorf floropolimerler(Tablo Malzemeler) 4-in silikon gofret üstüne 30 s için 1500 rpm bir spin-coater kullanarak ve 30 dakika boyunca 140 °C'de pişirin.
   NOT: Çalışma sırasında ayrık damlacıkların düzgün hareketini kolaylaştırmak için hem aktüasyon yüzeylerinin hem de kapak plakalarının hidrofobik olması önemlidir.

3. EWOD yongasının DMF platformuna yüklenmesi, montajı ve işletilmesi

NOT: EWOD çip, aktüasyon plakası ile iletken, topraklanmış kapak plakası arasında 0,5 mm'lik tam olarak tanımlanmış bir boşlukla paralel plaka konfigürasyonu ile çalışır. Bu sandviç montajı geçerli bölümde açıklanmıştır.

1. Kapağı DMF platformu^6'dan çıkarın ve tezgahın üzerine yerleştirin.
   NOT: Karanlık bir Faraday kafes odası, algılama sırasında başıboş ışık ve elektromanyetik girişimönlemek için gereklidir. Kapakta kilitlenme olmadığı için platform damlacıkların hareketini gözlemlememizi sağlıyor.
2. Dönen sahne üzerine temiz bir aktüasyon plakası yerleştirin, krom yukarı bakacak şekilde. Plakanın gömme aşamanın sol üst köşesiile hizalanması gerekir (Şekil 2A).
3. 47 kontak pimi ile paneli kullanarak aktüasyon plakasını üstten kıskaca layın. Bu, plakayı yerine sabitler ve kontak pimleriyle hizalamayı kolaylaştırır.
4. Aktüasyon ve kapak plakaları arasında kontrollü bir boşluk sağlamak için 0,5 mm şim ve 2 mm polimetilmetakrilat (PMMA) ayırıcısını döner aşamaya yerleştirin.
   NOT: İsteğe bağlı olarak, bir sonraki adımdan önce damlacıkları takmadan önce atık bertaraf pedinin üzerine fitil kağıdı yerleştirilebilir. Tayın devam ettiği için, atık doğrudan, tayın sonunda çıkarılabilen kağıda emilir.
5. Damlacıkları önerilen yükleme pedlerine yükleyin (Şekil 1).
   1. Aliquot dört 2.5-l damlacıklar Çalışan tampon üzerine B-, A-, R-, E-ifade pedleri, her ped üzerinde bir damlacık.
   2. Aliquot 2.5 μL Luminol:H₂O₂ (1:1, v/v) çözeltisi D-ifadeli ped üzerine.
   3. Aliquot 2.5 μL Nötrravidin HRP (1 μg/mL) f-belirtilen ped üzerine konjuge.
   4. Aliquot 2.5 μL Biotinylated sekonder antikor (1 μg/mL) G-ifade li ped üzerine.
   5. Aliquot 2.5 μL konjuge primer antikorlu mikroboncuklar (2.5 mg/mL) I-belirtilen ped üzerine gider.
   6. Aliquot 2.5 μL bilinmeyen örnek Üzerine C-ifade ped.
      NOT: Önerilen yükleme deseni deneysel bir düzenin yalnızca bir örneğidir, ancak yükleme deseni, bu değişiklikler yazılımda tanımlanan diziyle eşleştikçe kullanıcıların gereksinimleriyle eşleşecek şekilde değiştirilebilir(Ek Dosya 1).
6. Kapak plakasını yuvarlak girinti alanının yanı sıra teçhizatın yüzeyine yerleştirin ve yanal olarak girintiye ve aktüasyon plakasının üstüne kaydırın(Şekil 2B).
7. Kapak plakasının üstüne kalıcı mıknatıs koyun ve iki mandal kaydırarak güvenli(Şekil 2C).
8. Sahneyi 180° döndürün ve yüklenen damlacıklar hala yerinde yse görsel olarak kontrol edin (Şekil 1C).
   NOT: Saydam sahne ve aktüasyon plakasının arka sıyrıklarından damlacıkların konumunu ve şeklini görebilmelidir (Şekil 2D). Yükleme elektrot pedlerinin üzerinde yuvarlak damlacıklar görülebilseydi, teşp çalışmaya hazırdır. Durumda, bir damlacık bir mıknatıs ve kapak plakası kaldırabilirsiniz, sonra temiz bir pipet ile yerinden damlacık kurtarmak ve yükleme pedi üzerine tekrar yerleştirin yerinden.
9. Her damlacık için yükleme konumunun yazılımdaki programlanmış aktüasyon sırasıyla eşleşin (yazılımla ilgili ayrıntılar için Ek Dosya 1'e bakın).
   NOT: Damlacıkların konumunu görsel olarak kontrol edebilmek için fotodedektörün sökülmesi gerekir (Şekil 2D).
10. "Can" ekranlı fotodedektörü dönen sahnenin yuvasına yerleştirin.
    NOT: Fotoalgılama sistemi, ek optik olmadan ışık koleksiyonunu en üst düzeye çıkarmak için geniş bir toplama alanına (10 x 10 mm²⁾sahip bir fotodiyotun etrafında döner, ayrıca gürültüyü en aza indirmek için trans-empedans amplifikatörü^6. Ancak, sistem son derece hassastır ve dakika sinyalleri toplayabilir. Gürültü seviyesini azaltmak için elektronik tabanlı stratejiler uygulandı (örneğin, fotoalgılama sistemi bir Faraday kafese koyarak korundu, taranmış "can" olarak bilinen metal bir kasa).
11. Kabloyu ekranlı fotodedektöre bağlayın "can".
    NOT: EWOD çipi fotodedektörle hizalandığında, DMF platformu tamamen monte edilir ve artık çalışmaya hazırdır.
12. Kapağı DMF platformunun üzerine yerleştirin ve Hertfordshire Üniversitesi'nde geliştirilen yazılım arabirimini kullanarak program sırasını başlatın.
    NOT: Ek yazılım, bir CSV dosyasında zamanın bir fonksiyonu olarak damlacıktan gelen Parlaklığı okumak ve kaydetmek için kullanılır (Bkz. Ek Dosya 2).
    1. Programlanmış sıranın (bkz. Ek Dosya 1)istem iletilerinin operatöre "Luminol damlacıkları çıkarılan manyetik boncukları toplamaya hazır" veya "Algılama damlacığı algılama bölgesine taşınmaya hazır" şeklinde bilgi vermek için arabirimde göründüğünden emin olun. Her iki durumda da, operatörden onay sırası ile devam etmek için gereklidir.

4. Görsel modda çalışma (Protokollerin optimizasyonu için isteğe bağlı)

NOT: İstenirse, her damlacık tabanlı işlemi görselleştirmek için, 3.10-3.12 adımlarını atlayarak ve aşağıdaki işlemlerle değiştirilerek test çalıştırılabilir.

1. Yazılım arabirimini kullanarak program sırasını başlatın.
   NOT: Damlacık hareketi, protokol optimizasyonu sırasında yararlı olan görsel modda çalışırken gözlemlenebilir. İlk olarak, manyetik ayırma işleminin tekrarlanabilirliğini kontrol etmek için. Örneğin, kullanılan boncuk miktarı çok düşükse, manyetik ayırma oluşmaz, tam tersi, boncuk miktarı çok yüksekse, damlacık boncuk peleti tarafından hareketsiz hale getirilebilir. İkinci olarak, bazı damlacık formülasyonu gözlem tarafından tespit edilebilir aktüasyon bozukluğuna neden olabilir gibi yeni bir tsay güvenilirliğini tespit etmek.
2. İstendiğinde, dönen sahnenin yarık içine "can" ekranlı fotodedektörmonte.
3. Kabloyu, pimleri sokete takarak "can" ekranlı fotodedektöre bağlayın.
4. Kapağı DMF platformunun üzerine yerleştirin ve tayın devam ına devam edin.
   NOT: Bir CSV dosyasında zamanın bir fonksiyonu olarak damlacıktan gelen Parlaklığı okumak ve kaydetmek için ek yazılımı kullanın (Bkz. Ek Dosya 2)

5. Sıvı atıkların giderilmesi ve talaşların temizlenmesi

DİkKAT: Temizlemeden önce ekipmanın kapalı olduğundan ve güç kaynaklarından (bilgisayar, ana) bağlantısının kesildiğinden emin olun. Çipten biyolojik numuneleri çıkarırken eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük koruyucu cam (PPE) takın!

1. Aktüasyon plakasındaki elektrotlara ve kullanılan çözücülere erişmek için DMF platform kapağını açın ve sahneyi 180°döndürün.
2. Mıknatıs kılıfını boşaltın, mıknatısı dönen sahneden çıkarın ve tezgahın üzerine yerleştirin.
3. Kapak plakası, silikon gofret, cımbız bir çift ile yarık çıkarın, DI su ile durulayın, basınçlı hava ile kuruve gofret saklanabilir ve yeniden bir Petri kabına yerleştirin.
4. Sıvı atıkları yüzeye dokunmadan pedden taşımak için bir mikropipet kullanın.
5. Emici kağıt (filtre malzemesi) kullanarak sıvıyı aktüasyon plakasından silerek yüzeyi temizleyin.
   NOT: Yüzeyi sağlam tutmak, birden fazla kullanım alabilen aktüasyon plakasının uzun ömürlülüğünü artıracaktır.
6. Temiz bir pipet kullanarak temiz bir DI su damlacığı ile elektrotların yüzeyini hafifçe süpürerek aktüasyon plakasını temizleyin. Daha sonra damlacık lı kağıt (filtre malzemesi) ile çıkarın.
   DİkKAT: Biyolojik madde ile kontamine olmuş dokuları, kağıtları, pipetleri ve eldivenleri biyolojik atık kutusuna atın.
7. Aktüasyon plakasını farklı bir tarar için kullanın veya depolama veya geri dönüşüm için DMF platformundan çıkarın.

Sonuçlar

Tetkiklerin yapılabilmesi için en uygun koşulların ne olduğunu açıklamak için aktüasyon gerilimi etkisi araştırıldı. Tampondan gelen bir damlacık çeşitli tahrik gerilimlerinde sürüldü ve hareketi kaydedildi. Bulgular ,(Şekil 3)kök ortalama kare aktüasyon gerilimi (V_rms)ile ortalama hız arasında bir korelasyon olduğunu göstermiştir. Ancak V_rm'ler için yüksek değerler kullanıldığında bir aktüasyon plakasının uzun ömürlülüğü azaltıldı. Bu sonuçlara göre standart aktüasyon gerilimi olarak 105 V_rms seçilmiş, H₂O₂/Luminol damlacıkiçin en iyi şekilde çalışan 120 V_rms ve ekstraksiyon LUO için 165 V_rms uygulanmıştır. Bu gerilimler otomatik programlama sıralarına dahil edilmiştir (Ek Dosya 1).

İki immünoassays(Şekil 4)dört farklı patojen için DMF platformu ile EWOD çip kullanılarak başarıyla test edilmiştir(Tablo 1). EWOD çipi, damlacıkların yükleme pedlerinden karıştırma bölgesine ve son olarak da atıklara doğru art arda hareketini kolaylaştırdi. ELISA'yı tamamlamak için protokol boyunca tekrarlanan iki temel LUO vardı. İlk çıkarma LUO oldu; burada kısaca açıklanan, askıda boncuk içeren damlacık karıştırma bölgesinin ortasında ayırma sitesine sürüldü, mıknatıs çip yaklaşım ve bir pelet içine manyetik boncuk havuzu otomatik olarak aktive edildi(Şekil 5). Daha sonra, damlacık atık yastığıdoğru taşındı, böylece çıkarma LUO sonuçlanan, aktüasyon plaka üzerine boncuk bırakarak. Karıştırma EWOD çip yer almak için bir sonraki anahtar LUO oldu. Bilinmeyen patojen konsantrasyonu olan analit örneği elektrowetleme ile boncuklara taşındı. Daha sonra boncuklar, damlacıkların karıştırılmasalan alanın üzerine (toplam 10 ped) kümelenmiş boncuklarla hareket ettirilerek yeniden askıya alındı. Bu iki LUOs 6 ila 10 dakika patojenlerin ardışık tespiti ile minyatürleştirilmiş, hızlı ve tekrarlanabilir örnek işleme kolaylaştırdı olarak gerekli ydi. Şekil 6 EWOD çip ile gerçekleştirilen bir immünoassay luos tam dizilimi gösterir.

İstenilen otomasyon seviyelerini karşılamak için protokoldeki varyasyonlar getirilebilir. Örneğin, boncuklar antijen tükenmiş damlacık, daha sonra atık ped transfer edildi, temel ekstraksiyon LUO tekrarlandı. Bu aşamada protokol, tespit antikorunun hrp'ye konjuge olup olmadığına bağlı olarak dallanabilir ve farklı antijenlerin tespiti için toplamda sekiz LUOs etkin bir şekilde kullanabilir(Şekil 7A-C). Bu gibi durumlarda, algılama antikor ile damlacık boncuk getirilen ve daha sonra aktivasyon ile karıştırılır. Alternatif olarak, algılama antikorunun Nötrravidin-HRP konjuge sinetleştirilmesi, EWOD çipinin üzerinde sırayla yerinde yapılabilir, çünkü E. coli 'nin nicelleştirilmesi nde gösterilmiştir (Şekil 7D). Her iki protokol, sekiz ve on adımlı ELISA(Şekil 4),antijenlerin tekrarlanabilir tespitine neden oldu.

Kuluçka süreleri ve eşlekap konsantrasyonları, deneyce töz için en uygun koşulları bulmak için çeşitlidir (Şekil 7A). 160 s'lik kuluçka süresi ve 2 μg/mL'lik eşleç konsantrasyonunun sinyal gücünde %36'lık bir artış ve arka plan gürültü seviyelerinde neredeyse hiç değişiklik olmaması ile en iyi sinyale ulaşıldığı saptandı. Temsili sonuçlar bölümünde kullanılan tüm rakamlar ve veriler daha önceki bir^{çalışma6'dan}değiştirilmiştir.

Birincil / Yakalama antikor	Algılama antikor	Antijen
Anti-İnsan Serum Albumin [15C7] (anti-HSA, Abcam ab10241)	At Turp Peroksidaz (HRP) anti-HSA etiketli [1A9] (Abcam ab24438)	İnsan Serum Albumin (HSA, Abcam)
Rb anti-BG poliklonal	Biyotinylated Rb anti-BG poliklonal	B. globigii (BG) sporları
Rb anti-E.coli MRE 162 poliklonal	Biyotinylated Rb anti-E.coli 162 MRE çokklonal	E. coli MRE 162
Keçi anti-MS2 poliklonal	Biyotinylated Rb anti-MS2 poliklonal	MS2 bakteriyofaj virüsü

Tablo 1: Bu protokol ile test edilen antijenler ve antikorlar. DMF platformu ile EWOD çipin in yeteneklerini göstermek için dört tip patojen antijen kullanıldı.

Şekil 1: EWOD plakatasarımı. (a) Elektrotlara (kareler, Alt) bağlı konektörlere (kareler, Üst) eWOD aktüasyon plakasının şematik gösterimi. Her pad bir numara atanır ve yazılım kodundan ele alınabilir(Ek Dosya 1). Yükleme elektrot pedleri oklarla işaretlenir ve her pedin üstünde veya altında büyük harfle gösterilir. DMF platformu için önemli bir özellik on ped (No. 31, 32, 33, 36, 37, 42, 43, 44, 46, 47) oluşan karıştırma bölgesidir. Görsel bir kılavuz olarak, karıştırma bölgesi kırmızı bir dikdörtgen ile işaretlenir. (b) Pedlerin mikroızgara tasarımının mikrografı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Dijital mikroakışkan sistem (DMF) montajı için bileşenler ve temel aşamalar. (A) EWOD aktüasyon plakasını düzeltin, şimi dönen aşamaya yerleştirin ve damlacıkları yükleyin. (B) Kapak plakasını yerleştirin. (C) Mıknatıs kılıfını monte edin, mandalları sabitle ve sahneyi 180° döndürün. (D) Otomatik mıknatıs aşağı doğru işaret ediyor. Damlacıkların konumunu ve şeklini inceleyin, baskılı devre kartı (PCB) pimlerinin EWOD çipindeki kontaklarile hizalandığından kontrol edin, fotodedektörü bağlayın ve fotodedektör yuvasına yerleştirin. Kontrol elektroniği bir bilgisayara bağlandıktan sonra, sistem titreyi çalıştırmaya hazırdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Aktüasyon plakalarının tekrarlayan kullanımı ve aktüasyon gerilimi üzerindeki etkisi. Çalışan arabellekten gelen bir damlanın ortalama hızı, aktüasyon geriliminin (mavi daireler) ve üç bağımsız ölçümden (N = 3) standart sapmanın bir fonksiyonu olarak çizilir. Burada plaka başına tahlil sayısı (gri çubuklar) yüksek gerilimlerde yüzeyin gelişmiş çürüme gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: EWOD ile test edilen immünoasilerin diyagramı. Bu diyagramdaki her daire, EWOD yongasına yüklenen 2,5 μL'lik bir hacmi temsil eder. İlk protokol (sol tarafta) premix antikor-HRP konjuge kullanarak sekiz LUOs gösterir; iken, ikinci protokol on LUOs kapsar, ayrı ayrı biyotinylated algılama antikor ekleme, boncuk çıkarma ve Nötrravidin-HRP konjuge ardışık bağlama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Manyetik boncuk çıkarma. Bu işlem (a-c) karıştırma bölgesinin ortasında manyetik ayırma sitesine askıda manyetik boncuklar ile damlacık harekete ayrılır (pad No. 33), (d, e) mıknatıs boncuk lar odaklanarak konuma hareket ediyor, (f, g, h) boncuklar yerine manyetik kuvvet tarafından tutulur ise damlacık atık ped (No 41) doğru EWOD tarafından hareket ettirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: EWOD kullanarak komple immünoassay dizisi, reaktifleri, numune yüklemeve laboratuvar ünitesi operasyonlarını gösterir. Her satır, bir damlacık üzerindeki karakteristik işlemlerden örnek görüntülerin bir dizi içerir. İşlemler sütunlara ayrılmıştır. Karıştırma süspansiyon boncuklar için yapılmaz, siyah kırık bir çizgi tarafından sunulan. Damlacık yönleri mavi oklarla gösterilir, boncuklar resimlerden birinde turuncu okla vurgulanır. Gri kutu (sağ alt köşe) algılama alanında hareketi ve konumu temsil eden iki görüntüyü ayırır, kırık çizgi daire algılama alanını vurgular. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: DMF platformu ile EWOD çip üzerinde yapılan immünoassays kalibrasyon eğrileri. Daha önce bildirildiği gibi⁶ çıkış gerilimi (mV) karşı konsantrasyonları gösterilmiştir: (A) İnsan serum albumin, konjuge antikor konsantrasyonu [C] ve kuluçka süresi, t_incetkisini incelemek için kullanılan , çıkarma LUO kadar bilinen analit ile boncuk ların karıştırılması ölçülen, (B) B. atrophaeus (BG) immünoassay reproducibility gösteren sporlar, (C) MS2 bakteriyofaj immünoassay, ve (D) on-LUOs protokol sonuçları E. coli. Kısaltmalar: koloni oluşturan birimler (cfu), plak oluşturan birimler (pfu), bağımsız deney sayısı (N), laboratuvar birimi operasyonu (LUO). Önceki yayından şekil değiştirilmiştir⁶. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Otomatik ELISA teşbiti için DMF platformlarını nötrravidin-HRP ile eşlekap olarak çalıştırmak için tam sıra. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Dosya 2: Kemilüminesans ölçümü için GUI ve yazılım la yapılan bir ölçümden bir örnek gösterilmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

EWOD immünoassay protokolü esnektir ve test protokolü tarafından tanımlanan reaktif tipine, stabilitesine ve kullanım gereksinimlerine bağlı olarak çeşitli laboratuvar birimi operasyonlarını (örn. antijen yakalama, karıştırma, kuluçka, boncuk çıkarma, yıkama) içerebilir. Prensip kanıtı olarak, mevcut makalede, iki immünoassay protokolleri açıklanan EWOD çip ile sekiz veya on LUOs(Şekil 4)uygulanmasını gösteren kabul edilir. Bu tür minyatürleştirme, elisa'nın etkinliğini azaltarak reaktiflerin tüketimini, operasyon başına gereken süreyi, aslında toplam deneysel süreyi (6 ila 10 dk) azaltarak artıran mikrolitre, ayrık hacimli reaktif/analyte'den elde edilir. Ayrıca, titreç varyasyonları azaltır ve immünoassay¹⁷hassasiyetini artırır damlacıkların zamanlanmış manipülasyon ile otomatiktir. Mevcut biçiminde, deneme, bir sonraki bölümde daha fazla tartışma noktası olan her bir tdenemenin başında damlacıkların manuel olarak işlenmesini içerir.

Mevcut DMF yönteminin kritik adımlarından biri damlacıkları EWOD çipinin yüzeyine dağıtmaktır. Tipik olarak, tek kullanımlık uçlu bir mikropipet tam hacmi ölçmek ve yüklemek için kullanılır. Ancak, damlacık ve tek kullanımlık ucu şarj yüzeyi arasındaki etkileşimler nedeniyle aktüasyon plakasının hidrofobik yüzeyinde damlacık immobilize etmek zor olabilir. Sonuç olarak, damlacık plaka üzerine kalmak yerine ucun dış yüzeyini takip ateş edebilirsiniz. Bunu önlemek için, mikropipet yonga yüzeyine dik bir konumda, dokunmadan tutulmalıdır, daha sonra damlacık yüzeyle temas ederek yükleme yastığı üzerine dağıtılabilir. Damlacık pipet ucuna yapışırsa, onu hisse senedi çözümüne geri verin, ucu değiştirin ve yeni bir damlacık yeniden yatırın. Mevcut kavram kanıtı sisteminin daha da geliştirilmesinde, damlacık otomatik teslimat öngörülebilir.

Bir diğer kritik adım, tsedayı çalıştırmadan önce paralel plaka tertibatının kapağını kapatmaktır. Protokolde daha önce belirtildiği gibi, kapak aktüasyon plakasının üzerine kaydırılmalıdır. Kapağın hidrofobik yüzeyi, aktüasyon plakası üzerinde oturan damlacıkların bozulmasını ve yer değiştirmesini önler. Damlacık pürüzsüz hareketini garanti etmek için, son derece bozulmamış aktüasyon plakası kullanılması tavsiye edilir, damlacıkları ve yonga montaj doğru yükleme. Aktüasyon plakalarının yeniden kullanılabilirliği mümkündür; ancak, çevrim sayısı aktüasyon gerilimlerine(Şekil 3)ve yüzeye analit/reaktif birikimine, diğer adıyla biofouling'e bağlıdır. Sunulan platform, her deneyden sonra 120 V çalışma geriliminde dört kata kadar art arda ölçümler ve ara plaka temizliği için güvenilir bir şekilde yeniden kullanılabilen krom baskılı EWOD yongasını kullanmaktadır. Plakalar, deney başına maliyetini azaltmak için, biofouled amorf floropolimerler(Malzeme Tablosu)kaplama ve plaka üstüne taze bir spin kaplama (iyice durulama önce seyreltilmemiş temizlik maddesi ile yüzey fırçalama) tarafından geri dönüştürüldü. Ancak, aktüasyon plakageri dönüşüm manuel kullanım gerektirir, pahalı reaktifler (amorf floropolimerler(Malzeme Tablosu)) ve özel ekipman (spin-coater). Alternatif EWOD yongaları kağıt^19,asetat filmleri veya baskılı devre kartları (PCBs)^20,21gibi maliyet-etkin yüzeyler ile başarıyla araştırılır. Bu tür tek kullanımlık sarf malzemeleri, DMF platformunun güvenilir ve uygun fiyatlı kullanımını kolaylaştırabilir ve biyofaulleme sorununu ortadan katmak için araçlar sağlayabilir.

Biofouling biyolojik uygulamalar için EWOD ana sınırlama^22,23. DMF üzerinde daha önceki çalışmalarda biyofouling katkıda iki mekanizma tespit ettik, yani, hidrofobik etkileşimleri nedeniyle pasif adsorpsiyon, ve bir elektrik alanı uygulandığında tezahür elektrostatik tahrikli adsorpsiyon²⁴. Mevcut makalede elde edilen bulgular, yüksek aktüasyon gerilimlerinde aktüasyon plakasının yeniden kullanılabilirliğinin azaldığı belgelenmiştir. Bir olası açıklama proteinler fluoropolimer kaplı (Teflon gibi) yüzeylerde kolayca adsorb ve bozulmamış yüzeylere göre kirlenmiş daha hızlı agrega²⁴. Sonuç olarak, DMF üzerinde protein ile ilgili tahliller ölçmek zordur ve analit kaybı yaşayabilir, çapraz kontaminasyon ve azalmış hassasiyet^17. En kötü durum senaryosu, kritik miktarda protein adsorblarının böylece cihazı işe yaramaz hale getirmeleridir. Biyofouling en aza indirmek için, çeşitli yaklaşımlar çip üzerinde damlacık ikamet süresini en aza indirmek, kaplamalar aracılığıyla²³, katkı maddeleri (yani, yüzey aktif maddeler veya pluronik asit) içine biyomalzeme yüklü damlacıklar^6,22. Bu nedenle EWOD üzerinde immünoassay test önemli bir yönü eldeki özel protokol ile uyumlu anti-biofouling stratejileri seçmektir.

Otomatik DMF platformu, hem reaktifler hem de analit için mikrolitre hacimleri kullanırken her çalışma başına tek bir sandviç ELISA testi gerçekleştirmek üzere tasarlanmıştır. Gerektiğinde, konvansiyonel sandviç ELISA kitleri, yardımcı laboratuvar ekipmanları ile birlikte çalışan başına daha yüksek iş artışı sağlayan önceden kaplanmış 96-iyi veya 384-kuyu plakalar dayalı mevcuttur; sadece reaktif fiyatına göre, test/kuyu başına yaklaşık maliyet sırasıyla 6,04 USD (580 USD/96) ve 0,33 USD (2×580 USD/384) olup. Bu, merkezi laboratuvar tesislerinde eğitimli teknik personel tarafından tipik olarak işlenen çok sayıda numune için geleneksel ELISA yöntemlerini ideal hale getirir. Ancak, uzak yerlerde, çevresel izleme için ELISA ayrıntılı maliyet analizi sermaye maliyetleri (yani, laboratuvar işletme maliyetleri, tekrarlayan maliyetler, numune taşıma, malzeme ve personel) dahil edildiğinde ELISA başına gerçek fiyat 60 USD olan 34 USD örnek²⁵başına tedarik için olduğunu gösterdi . Buna karşılık, önerilen DMF platformu taşınabilir, çalışması için minimum eğitim gerektirir ve önceden kaplanmış boncuklar ile dakika içinde örnek-to-cevap analizi sağlayabilir. Bu nedenle, sunulan teknoloji ihtiyaç noktalarına dağıtılabilir ve merkezi laboratuvarlarda kullanılabilir tamamlayıcı analizler.

Temsili sonuçlar bölümünde, savunma uygulaması için patojenlerin doğrudan tespiti için otomatik DMF immünoassay platformu kullanılmıştır. DMF platformu için diğer olası uygulamalar biyodiagnostik, sürekli izleme ve otomatik örneklemeyi kapsar ancak bunlarla sınırlı değildir. Potansiyel olarak DMF, kişiselleştirilmiş sağlık hizmetleri için bakım noktasından, hastaların havadaki Hastane Edinilmiş Enfeksiyondan korunması için kontrollü çevre izlemeden tarım ve tarım için mahsul izleme sistemine kadar çeşitli sektörleri etkileyebilir. gıda üretimi.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES	Sigma-Aldrich	H9897
Anti-Human Serum Albumin [15C7]	Abcam	ab10241
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP)	Abcam	ab24438
B. atrophaeus (BG) spores	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Blocker Casein	Thermo Scientific	TFS 37582
CNC Dicing/Cutting Saw	MTI Corp, USA	SYJ-400
Cytop	AGC, Japan	CTL-809M	Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating.
E. coli MRE 162	Dstl, UK	N/a
Goat anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Hamamatsu photodiode	Hamamatsu, Japan	S9270
Hidrochloric acid (32%)	Sigma-Aldrich	W530574
Mask manufacturing service	Compugraphics, Scotland, UK	N/a
MS2 virus	Dstl, UK	N/a
Parylene-C, DPX-C	Specialty Coating System, USA	CAS No.: 28804-46-8
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit	Thermo Scientific	88828	Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C.
Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS	Abcam	ab201876
SCS Parylene Deposition System	Specialty Coating System, USA	2010
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm	Pi Kem Ltd	N/a
Spin Coater	SÜSS MicroTec AG, Germany
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo Scientific	37075	It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C.
Tween 80	Thermo Scientific	28328	The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution.