Plataforma de microfluídico digital basada en electrohumección para el ensayo automatizado de inmunoabsorbentes ligados a enzimas

Resumen

El microfluídico digital basado en electrohumección es una técnica que utiliza un cambio impulsado por voltaje en el ángulo de contacto aparente de una gota de volumen de microlitros para facilitar su manipulación. La combinación de esto con perlas magnéticas funcionalizadas permite la integración de múltiples operaciones de unidades de laboratorio para la preparación de muestras y la identificación de patógenos utilizando el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Resumen

La electrohumectación es el efecto por el cual se modifica el ángulo de contacto de una gota expuesta a una carga superficial. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) explota las propiedades dieléctricas de las películas aislantes delgadas para mejorar la densidad de carga y, por lo tanto, aumentar el efecto electrohumante. La presencia de cargas resulta en una propagación inducida eléctricamente de la gota que permite una manipulación intencional a través de una superficie hidrófoba. Aquí, demostramos el protocolo basado en EWOD para el procesamiento de muestras y la detección de cuatro categorías de antígenos, utilizando una plataforma de accionamiento de superficie automatizada, a través de dos variaciones de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). El ELISA se realiza en cuentas magnéticas con anticuerpos primarios inmovilizados que se pueden seleccionar para atacar un antígeno específico. Un anticuerpo conjugado con HRP se une al antígeno y se mezcla con H₂O₂/Luminol para la cuantificación de los patógenos capturados. Se alcanzaron tiempos de finalización del ensayo de entre 6 y 10 minutos, mientras que se utilizaron volúmenes minúsculos de reactivos.

Introducción

El método propuesto tiene como objetivo facilitar la preparación automatizada de muestras para ELISA con detección cuantitativa de antígenos utilizando un enfoque basado en EWOD con microfluídico digital (DMF) y separación magnetoforética. Se ha demostrado para múltiples aplicaciones biológicas que DMF en combinación con magnetophoresis es una alternativa interesante a las aplicaciones de manipulación de líquidos¹. Más concretamente, la detección de patógenos es un aspecto implícito en muchos sectores, que van desde la sanidad² hasta la agricultura y el medio ambiente^3,4 a la seguridad nacional^5. Una tecnología de detección capaz de abordar las amenazas de patógenos debe incluir alto rendimiento (por ejemplo, tiempo de ensayo corto), eficiencia (bajo límite de detección – LoD – y alta sensibilidad) y especificidad (al tipo de patógeno objetivo) para que sea funcional⁶.

Anteriormente, dMF basado en EWOD se ha implementado con éxito para la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), la detección de un patógeno resistente a los antibióticos (Staphylococcus aureaus o MRSA resistente a la meticilina), M.pneumonia y C.albicans utilizando un chip de circuito impreso de bajo presupuesto y magnetophoresis⁷. La técnica se aplicó también para la detección de mutaciones de ácido desoxirribonucleico (ADN) a través de la pirosequencing y la detección quimioluminiscente^8. Las plataformas basadas en EWOD también amplían su funcionalidad hacia aplicaciones de inmunoensayo, lo que permite la recuperación y detección simultánea según la cual las muestras se encuentran dentro de una única plataforma integrada. Por ejemplo, un único diseño de chip EWOD se demostró con éxito con una plataforma DMF para pruebas de punto de atención para inmunoensayos basados en cuentas de troponina cardiaca I a partir de una muestra de sangre completa y como un experimento separado RT-PCR para la detección de SARM². Ese chip utiliza relleno de aceite, lo que evita la evaporación de las gotas y facilita la manipulación automatizada confiable de volúmenes de nanolitros. Se investigaron bioaplicaciones versátiles con la implementación de enfoques DMF similares que abarcaron inmunoensayos cuantitativos homogéneos y heterogéneos^9,10 incluyendo el diseño de estudios de experimentos (DoE) para la optimización de parámetros de ensayo¹¹.

A pesar de sus evidentes méritos para la intensificación del proceso debido a los volúmenes de trabajo minúsculos, una plataforma DMF llena de petróleo puede ser desafiante y requiere un cierto nivel de experiencia para operar. Los sistemas llenos de aceite, debido a que requieren componentes sellados, no son ideales para ciertas aplicaciones en el campo donde la transportabilidad del sistema es importante. Además, un sistema a base de aceite sería muy difícil, si no imposible de utilizar para algunas aplicaciones específicas, aprovechando la recolección de material seco en una superficie como la propuesta por Zhao y Cho¹², J-nsson-Niedzió-ka et al.¹³, y Foat et al.¹⁴. Por el contrario, los sistemas sin aceite son fáciles de integrar y tienen la ventaja de proporcionar una fácil traducción de muestras de chip a chip. Por estas razones, el método propuesto se desarrolló para proporcionar un inmunoensayo basado en EWOD en DMF que no requeriría aceite, simplificando efectivamente el funcionamiento del dispositivo.

En esta contribución, informamos sobre el uso de una plataforma DMF a medida, independiente y totalmente automatizada para inmunoensayos, y profundizamos en el protocolo para la detección rápida de biomoléculas, a saber: proteínas, bacterias vegetativas, esporas bacterianas y virus. La combinación de chip EWOD con partículas magnéticas para la preparación automatizada de muestras y la inmunoprecipitación ya se ha demostrado con una medición adicional de MS fuera de línea¹⁵. Recientemente, el grupo¹⁶de Wheeler ha demostrado un diagnóstico sobre el sarampión y la rubéola IgG en la población remota del noroeste de Kenia. Tanto Wheeler como nuestro sistema, siendo transportable, autónomo, totalmente automatizado con mediciones quimioluminiscentes en chip incluidas, son posiblemente uno de los sistemas de biodetección DMF más avanzados disponibles.

Los dos sistemas han sido diseñados con aplicaciones muy diferentes en mente. El sistema de Wheeler se dirige al biomarcador para permitir el diagnóstico biomédico en pacientes, mientras que nuestro sistema de biodetección se basa en los requisitos de defensa para la detección directa de patógenos previamente muestreados desde el aire. La similitud entre los dos es el principio subyacente de la actuación de gotas, que demuestra la amplia gama de sectores que influyen en la vida que la tecnología basada en EWOD puede afectar. A saber, la plataforma de detección basada en DMF y el sistema EWOD asociado podrían encontrar implicaciones clave en la salud (diagnóstico biomédico); protección militar y civil (detección de amenazas); Tecnología agropecual (monitoreo de cultivos) y seguridad en el trabajo (monitoreo controlado del medio ambiente)

El rendimiento de nuestra plataforma DMF se evalúa en función de la detección totalmente automatizada de albúmina sérica humana (HSA, una proteína globular), Escherichia coli (E. coli, una bacteria vegetativa), Bacillus atrophaeus (BG, una espora bacteriana) y MS2 (un virus bacteriófago). Más importante aún, el método DMF propuesto es extremadamente versátil en el sentido de que los anticuerpos de captura podrían intercambiarse para apuntar a la detección de otros antígenos diferentes de los cuatro que se consideran en este artículo. Al evitar por completo la detección basada en anticuerpos, la plataforma DMF podría construirse hasta una aplicación potencial basada en el bioensing de aptámeros, donde las perlas magnéticas llevan aptámeros específicos para la captura y/o detección de nucleótidos. El diseño y la realización de los diferentes componentes que constituyen la plataforma DMF integrada y completamente autónoma, incluyendo el generador de forma de onda de alta tensión y la electrónica de accionamiento se divulga en otros lugares^6.

Protocolo

1. Pasos preliminares necesarios para el ensayo

NOTA (IMPORTANTE): Todos los pasos preliminares deben llevarse a cabo en un entorno estéril para evitar contaminaciones. No se debe utilizar azida sódica para el almacenamiento, ya que inhibiría la actividad de la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP).

1. Preparar el tampón de carrera (100 mM HEPES, pH 7.5), utilizando el (4-(2-hidroxietilo)piperazina-1-ácido etanosulfónico, y añadir Tween 80 a una concentración de 0.01% (v/v).
2. Inmovilizar los anticuerpos primarios (capturar anticuerpos) en la superficie de los microperlas magnéticos activados por el NHS siguiendo el protocolo proporcionado por el proveedor. En resumen, el protocolo Magnetic IP/Co-IP Kit(Tabla de materiales)abarca los siguientes pasos.
   1. Aliquot 0,2 ml de perlas (2 mg) en un tubo de plástico y retire el sobrenadante.
   2. Lave las perlas añadiendo 1 ml de hielo-frío 1 mM HCl.
   3. Enlazar el anticuerpo seleccionado (Albúmina sérica antihumana [15C7], Rb anti-BG policlonal, Rb anti-E.coli MRE 162 policlonal o Goat anti-MS2 polyclonal), 40 g/mL en 67 mM Borate Buffer, covalentemente a las perlas durante 1 h con temblores a 37 oC. La Tabla 1 contiene la lista de todos los anticuerpos utilizados con el protocolo actual y los patógenos del antígeno^6.
   4. Lave los anticuerpos no unidos dos veces con 0,8 ml de búfer de elución.
   5. Atemple la reacción con 1 ml de tampón de enfriamiento durante 1 h.
   6. Lave las perlas una vez con el tampón de borato modificado y una vez con IP Lysis/Wash Buffer.
   7. Resuspenda las perlas en 0,5 ml de IP Lysis/Wash Buffer y guárdelas a 4oC hasta que sea necesario para su uso.
      NOTA: Para obtener mejores resultados, un nuevo lote de microperlas se acoplan a los anticuerpos el día antes del aislamiento EWOD y el chip ELISA. Sin embargo, los microperlas acoplados al anticuerpo primario se pueden almacenar a 4 oC hasta un mes. En caso de aglomeración, toque el vial para romper el precipitado y resuspender las perlas en la solución.
   8. Bloquear los microperlas con el anticuerpo acoplado durante la noche, utilizando la concentración final 4 mg/ml para los microperlas, en una caseína bloqueadora (1% p/v) en solución salina con fosfato de 100 mM (PBS).
      NOTA: El paso de bloqueo siempre se lleva a cabo el día antes de la ejecución del ensayo de biodetección.
   9. Separe las perlas del Casein Bloqueador usando un imán y retire el sobrenadante.
   10. Resuspender en 1 ml de búfer en ejecución y mezclar durante 1 min.
   11. Separe las perlas con el imán y retire el sobrenadante.
   12. Repita los pasos de lavado anteriores (1.2.10 y 1.2.11) dos veces.
       NOTA: Tres pasos de lavado son suficientes para reducir la adhesión de las perlas a la superficie y para facilitar la libre circulación de la gota.
   13. Resuspenda las perlas en el búfer de funcionamiento a una concentración de 2,5 mg/ml. Esta solución de microperlas está lista para usar se puede usar con el chip EWOD.
3. Preparar una solución de la peroxidasa de rábano picante conjugada con neutravidina (HRP) y el anticuerpo biotinilado secundario a una concentración final para cada uno de 1 g/ml en el búfer de ejecución (utilizado para la detección de BG⁶).
   NOTA: Para apuntar a los antígenos (Tabla 1) se probaron con éxito diversas concentraciones de anticuerpos biotinylados secundarios, que oscilaban entre 0,5 y 4,0 g/ml.
4. Mezclar volúmenes iguales del Luminol con solución de peróxido de hidrógeno justo antes de ejecutar el ensayo
   NOTA: Luminol se utiliza para cuantificar el número de eventos de unión basados en la enzima HRP que se une covalentemente al anticuerpo secundario que se dirige al antígeno (por ejemplo, patógeno). Sin embargo, diferentes moléculas de informe y estrategias se pueden utilizar para la detección¹⁷ en lugar de la quimioluminiscencia y Luminol.

2. Fabricación y tratamiento superficial de los componentes de la viruta EWOD

NOTA: El chip EWOD consiste en una placa de accionamiento con electrodos de cromo estampados para alternar el ángulo de contacto aparente de una gota y una placa de cubierta para definir la altura de las gotas.

1. Dibuje el diseño de los electrodos y conectores en 2D utilizando el software CAD estándar. Incluir también la almohadilla de recogida de residuos con dimensiones de 5 x 5 mm² para almacenar los disolventes usados(Figura 1).
   NOTA: Para manipular las gotas utilizamos 47 electrodos, cada uno con dimensiones de 1,7 x 1,7 mm^2. Este tamaño de electrodo se adapta a los volúmenes de gotas que van de 1,5 a 3 l (para una separación de 500 m). Por experiencia, cuando se trabaja con un espacio de 500 m, 1,5 l es el tamaño mínimo de gota que se puede accionar. Corresponde aproximadamente al contorno de gotas (proyectado) que se circunscribe a la almohadilla cuadrada. Sin embargo, no hay ningún límite teórico en el tamaño que no sea causado por la resistencia (fricción) del cuerpo del fluido. No obstante, se recomienda que el volumen no supere los 3 l para un accionamiento fiable utilizando una separación de 500 m. Los electrodos son abordados por electrónica de 48 canales.
   NOTA: Las dimensiones y tamaños de diseño de las almohadillas pueden variar dependiendo de los volúmenes previstos y de las operaciones de la unidad de laboratorio (LUOs) que componen el protocolo.
2. Envíe el dibujo de diseño a un servicio de fabricación de máscaras para imprimir la máscara de cromo en un sustrato de vidrio. El espesor de la capa de cromo es de 100 nm.
   NOTA: La capa de cromo en la fotomáscara utilizada como sustrato para el chip EWOD es, por definición, opaca. El diseño de cada uno de nuestros electrodos incluye un diseño de rejilla para garantizar la semitransparencia.
3. Corte la placa a un tamaño de 56 x 56 mm² con una sierra de corte/dictado CNC de precisión.
4. Pegue la cinta adhesiva sobre los contactos eléctricos para aislarlos durante los dos pasos de recubrimiento.
5. Recubrir la placa de cromo-vidrio de la placa con una capa dieléctrica mediante el depósito de 6 m de paryleno-C en su superficie. El proceso Gorham¹⁸ se utiliza con 7,4 g de DPX-C en un sistema de deposición de parileno (Tabla de materiales).
6. Fluoropolímeros amorfos de capa giratoria(Tabla de materiales) utilizando una capa de espín a 1500 rpm durante 30 s en la parte superior de la placa y hornéala a 140 oC durante 30 minutos.
   NOTA: Esto hace que la superficie sea hidrófoba. Se puede validar si el recubrimiento se ha depositado con éxito colocando una gota de agua en la superficie. El ángulo de contacto entre la gota y la placa debe estar en la región de 110o.
7. Retire la cinta de enmascaramiento de los contactos eléctricos.
8. Fluoropolímeros amorfos de capa giratoria(Tabla de materiales) utilizando un recubrimiento de espín a 1500 rpm durante 30 s en la parte superior de la oblea de silicio de 4 pulgadas y hornéalo a 140 oC durante 30 minutos.
   NOTA: Es importante que tanto las superficies de la actuación como las placas de cubierta sean hidrófobas para facilitar el movimiento suave de las gotas discretas durante el ensayo.

3. Carga, montaje y operación del chip EWOD en la plataforma DMF

NOTA: El chip EWOD funciona utilizando la configuración de placas paralelas con un espacio definido con precisión de 0,5 mm entre la placa de accionamiento y la placa de cubierta conductora y puesta a tierra. Este conjunto sándwich se describe en la sección actual.

1. Retire la tapa de la plataforma DMF⁶ y colóquela en el banco.
   NOTA: Una cámara de jaula oscura Faraday, es necesaria para evitar la luz perdida y las interferencias electromagnéticas durante la detección. No hay enclavamiento en la tapa, por lo tanto, la plataforma nos permite observar el movimiento de las gotas.
2. Coloque una placa de accionamiento limpia en la etapa giratoria, con el cromo hacia arriba. La placa debe estar alineada con la esquina superior izquierda de la etapa empotrada(Figura 2A).
3. Sujete la placa de accionamiento desde la parte superior con el panel con los 47 pines de contacto. Esto fija la placa en su lugar y facilita la alineación con los pasadores de contacto.
4. Poner la cuña de 0,5 mm y el separador de polimetilmetacrilato de 2 mm (PMMA) en la etapa giratoria, con el fin de proporcionar un espacio controlado entre la actuación y las placas de cubierta.
   NOTA: Opcionalmente, el papel absorbente se puede colocar en la almohadilla de eliminación de residuos antes de alícuota de las gotas antes del siguiente paso. A medida que avanza el ensayo, los residuos se absorben directamente en el papel que se puede retirar al final del ensayo.
5. Cargue las gotas en las almohadillas de carga propuestas(Figura 1).
   1. Aliquot cuatro gotas de 2,5-L desde el búfer de ejecución en las almohadillas denotadas por E, una gota en cada almohadilla.
   2. Alícuota 2,5 l de solución Luminol:H₂O₂ (1:1, v/v) en la almohadilla denotada en D.
   3. Aliquot 2,5 l de Neutravidin conjugado con HRP (1 g/ml) en la almohadilla denotada por F.
   4. Aliquot 2,5 l de anticuerpo secundario biotinylated (1 g/ml) sobre la almohadilla denotada en G.
   5. Aliquot 2,5 l de microperlas con anticuerpo primario conjugado (2,5 mg/ml) pasa a la almohadilla denotada por I.
   6. Aliquot 2,5 l de la muestra desconocida en la almohadilla denotada en C.
      NOTA: El patrón de carga propuesto es sólo un ejemplo de un diseño experimental, sin embargo, el patrón de carga se puede cambiar para que coincida con las necesidades de los usuarios, siempre y cuando esos cambios coincidan con la secuencia definida en el software (Archivo complementario 1).
6. Coloque la placa de cubierta en la superficie de la plataforma, además del área de empotramiento redondo, y deslícela lateralmente en el hueco y en la parte superior de la placa de accionamiento(Figura 2B).
7. Coloque el imán permanente en la parte superior de la placa de cubierta y fíjelo deslizando los dos pestillos(Figura 2C).
8. Gire el escenario 180o e inspeccione visualmente si las gotas cargadas siguen en su lugar(Figura 1C).
   NOTA: Uno debe ser capaz de mirar la posición y la forma de las gotas a través de la etapa transparente y la parte posterior de la placa de accionamiento(Figura 2D). El ensayo está listo para funcionar si se pudieran ver gotas redondas en la parte superior de las almohadillas de electrodo de carga. En caso de que una gota se desplace, se puede extraer el imán y la placa de cubierta, luego recuperar la gota desplazada con una pipeta limpia y colocarla de nuevo en la plataforma de carga.
9. Compruebe que la posición de carga de cada gota coincide con la secuencia de accionamiento programada en el software (consulte El archivo suplementario 1 para obtener más información sobre el software).
   NOTA: Para poder comprobar visualmente la posición de las gotas, es necesario desmontar el fotodetector(Figura 2D).
10. Coloque el fotodetector proyectado "lata" en la ranura de la etapa giratoria.
    NOTA: El sistema de fotodetección gira alrededor de un fotodiodo, que tiene un área de colección grande (10 x 10 mm²) para maximizar la recolección de luz sin óptica adicional, además de un amplificador de transimpedancia para minimizar el ruido^6. Sin embargo, el sistema es extremadamente sensible y puede recoger señales diminales. Para reducir el nivel de ruido, se implementaron una serie de estrategias basadas en electrónica (por ejemplo, el sistema de fotodetección estaba protegido poniéndolo en una jaula de Faraday, una carcasa metálica conocida como "puede").
11. Conecte el cable al fotodetector de lata de color apantallado.
    NOTA: Una vez que el chip EWOD está alineado con el fotodetector, la plataforma DMF está completamente montada y ahora está lista para funcionar.
12. Coloque la tapa sobre la plataforma DMF e inicie la secuencia del programa utilizando la interfaz de software desarrollada en la Universidad de Hertfordshire.
    NOTA: Se utiliza un software adicional para leer y grabar la luminiscencia de la gota en función del tiempo en un archivo CSV (consulte Archivo complementario 2).
    1. Asegúrese de que los mensajes de solicitud de la secuencia programada (consulte Archivo suplementario 1) aparezcan en la interfaz para informar al operador de que "La gota de luminol está lista para recoger los perlas magnéticas extraídas" o "La gota de detección está lista para moverse al sitio de detección." En ambos casos, se requiere la confirmación del operador para continuar con la secuencia.

4. Funcionamiento en modo visual (Opcional para la optimización de protocolos)

NOTA: Si lo desea, para visualizar cada operación basada en gotas, el ensayo se puede utilizar omitiendo los pasos 3.10-3.12 y sustituyéndolos por las siguientes operaciones.

1. Inicie la secuencia del programa utilizando la interfaz de software.
   NOTA: El movimiento de las gotas se puede observar mientras se opera en modo visual, lo que resulta útil durante la optimización del protocolo. En primer lugar, comprobar la reproducibilidad de la operación de separación magnética. Por ejemplo, si la cantidad de perlas utilizadas es demasiado baja, la separación magnética no ocurrirá, viceversa, si la cantidad de perlas es demasiado alta, la gota puede ser inmovilizada por el pellet de perla. En segundo lugar, para determinar la fiabilidad de un nuevo ensayo, ya que alguna formulación de gotas puede causar deterioro de la acción que puede ser detectado por observación.
2. Monte el fotodetector proyectado "lata" en la ranura de la etapa giratoria, cuando se le solicite.
3. Conecte el cable al fotodetector de lata de color arenado, insertando los pines en la toma.
4. Coloque la tapa sobre la plataforma DMF y reanude el ensayo.
   NOTA: Utilice el software adicional para leer y grabar la luminiscencia de la gota en función del tiempo en un archivo CSV (consulte Archivo complementario 2)

5. Extracción de residuos líquidos y limpieza de la viruta

ADVERTENCIA: Asegúrese de que el equipo esté apagado y desconectado de las fuentes de alimentación (ordenador, principal) antes de la limpieza. Use guantes, una capa de laboratorio y gafas de vidrio protector (PPE) al quitar muestras biológicas del chip!

1. Para acceder a los electrodos y los disolventes utilizados en la placa de accionamiento, abra la tapa de la plataforma DMF y gire la etapa 180o.
2. Desenganche la carcasa del imán, retire el imán de la etapa giratoria y colóquelo en el banco.
3. Retire la placa de cubierta, oblea de silicio, de la hendidura con un par de pinzas, enjuáguela con agua DI, séquela con aire comprimido y colóquela en una placa Petri, donde la oblea se puede almacenar y reutilizar.
4. Utilice un micropipeta para mover los residuos líquidos de la almohadilla sin tocar la superficie.
5. Limpie la superficie eliminando el líquido de la placa de accionamiento utilizando papel absorbente (material de filtro).
   NOTA: Mantener la superficie intacta aumentará la longevidad de la placa de accionamiento, que permite múltiples usos.
6. Limpie la placa de accionamiento barriendo suavemente la superficie de los electrodos con una gota de agua DI limpia utilizando una pipeta limpia. A continuación, retire la gota con papel absorbente (material de filtro).
   ADVERTENCIA: Deseche los tejidos, papeles, pipetas y guantes que estén contaminados con material biológico en el contenedor de biorresiduos.
7. Utilice la placa de accionamiento para un ensayo diferente o retírela de la plataforma DMF para almacenarla o reciclarla.

Resultados

Se investigó el impacto de la tensión de accionamiento con el fin de dilucidar cuáles eran las condiciones óptimas para realizar los ensayos. Una gota del búfer fue impulsada en varios voltajes de accionamiento y su movimiento fue grabado. Los hallazgos demostraron(Figura 3) existía una correlación entre la tensión de accionamiento cuadrado media raíz (V_rms)y la velocidad media. Sin embargo, la longevidad de una placa de accionamiento se redujo cuando se utilizaron valores altos para V_rms. Sobre la base de estos resultados, 105 V_rms fue elegido como la tensión de accionamiento estándar, 120 V_rms se encontró para funcionar mejor para la gota H₂O₂/ Luminol y 165 V_rms se implementó para la extracción LUO. Estos voltajes se incluyeron en la secuencia de programación automatizada(Archivo suplementario 1).

Dos inmunoensayos(Figura 4) se probaron con éxito utilizando el chip EWOD con la plataforma DMF para cuatro patógenos diferentes (Tabla 1). El chip EWOD facilitó el movimiento consecutivo de las gotas desde las almohadillas de carga a la región de mezcla y finalmente a los residuos. Hubo dos LUOs básicos que se repitieron a lo largo del protocolo para completar ELISA. El primero fue la extracción LUO; Brevemente descrito aquí, la gota que contiene las cuentas suspendidas fue conducida al sitio de separación en el medio de la zona de mezcla, el imán se activó automáticamente para acercarse al chip y agrupar las cuentas magnéticas en un pellet(Figura 5). A continuación, la gota se movió hacia la plataforma de residuos, dejando las cuentas en la placa de accionamiento, concluyendo así la extracción DE LUO. La mezcla fue la siguiente clave de LUO que tuvo lugar en el chip EWOD. La muestra de analito con una concentración desconocida de patógenos se trasladó a las perlas mediante electrohumectación. A continuación, las cuentas se resuspendieron moviendo la gota con las cuentas agrupadas sobre el área de mezcla (10 almohadillas en total). Estos dos LUOs fueron esenciales ya que facilitaron un procesamiento de muestras miniaturizado, rápido y reproducible con detección consecutiva de los patógenos en 6 a 10 min. La Figura 6 muestra la secuencia completa de LUOs de un inmunoensayo realizado con el chip EWOD.

Para cumplir con los niveles deseados de automatización, se podrían introducir variaciones en el protocolo. Por ejemplo, las cuentas se separaron de la gota agotada del antígeno, que luego se transfirió a la plataforma de residuos, repitiendo la extracción básica DE LUO. En esta etapa, el protocolo podría ramificarse dependiendo de si el anticuerpo de detección ya se conjugan con el HRP, utilizando efectivamente ocho LUOs en total para la detección de los diferentes antígenos(Figura 7A-C). En estos casos, la gota con el anticuerpo de detección fue llevada a las cuentas y luego mezclada por accionamiento. Alternativamente, la unión del anticuerpo de detección al conjugado Neutravidin-HRP podría realizarse secuencialmente in situ en el chip EWOD, como se demostró para la cuantificación de E. coli (Figura 7D). Ambos protocolos, el ELISA de ocho y diez pasos(Figura 4),produjo la detección reproducible de antígenos.

Los tiempos de incubación y las concentraciones conjugadas fueron variados para encontrar experimentalmente las condiciones óptimas para el ensayo(Figura 7A). Se encontró que el tiempo de incubación de 160 s y la concentración conjugada de 2 g/ml lograron la mejor relación señal-ruido con un aumento del 36% de la intensidad de la señal y prácticamente ningún cambio en los niveles de ruido de fondo. Todas las cifras y datos utilizados en la sección de resultados representativos se modificaron de un trabajo anterior⁶.

Primario / Capturar anticuerpo	Anticuerpo de detección	Antígeno
Albúmina sérica antihumana [15C7] (anti-HSA, Abcam ab10241)	Horse Radish Peroxidase (HRP) etiquetado anti-HSA [1A9] (Abcam ab24438)	Albúmina sérica humana (HSA, Abcam)
Rb anti-BG policlonal	Biotinylated Rb anti-BG policlonal	B. globigii (BG) esporas
Rb anti-E.coli MRE 162 policlonal	Biotinylated Rb anti-E.coli 162 MRE policlonal	E. coli MRE 162
Cabra anti-MS2 policlonal	Biotinylated Rb anti-MS2 policlonal	Virus bacteriófago MS2

Tabla 1: Antígenos y anticuerpos probados con este protocolo. Se utilizaron cuatro tipos de antígenos patógenos para demostrar las capacidades del chip EWOD con la plataforma DMF.

Figura 1: Diseño de la placa EWOD. (a ) Notación esquemática de la placa de accionamiento EWOD con conectores (cuadrados, superior) que están vinculados (líneas) a los electrodos (cuadrados, inferior). A cada pad se le asigna un número y se puede dirigir desde el código de software(Archivo complementario 1). Las almohadillas de electrodo de carga están marcadas por flechas y denotadas por una letra mayúscula por encima o por debajo de cada almohadilla. Una característica clave para la plataforma DMF es la zona de mezcla compuesta por diez pads (No 31, 32, 33, 36, 37, 42, 43, 44, 46, 47). Como guía visual, la zona de mezcla se marca con un rectángulo rojo. (b) Micrografía del diseño de la microred de las almohadillas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Componentes y etapas clave para el ensamblaje del sistema microfluídico digital (DMF). (A) Fije la placa de accionamiento EWOD, coloque la talla sobre la etapa giratoria y cargue las gotas. (B) Coloque la placa de cubierta. (C) Monte la caja del imán, fije los pestillos y gire el escenario 180o. (D) El imán automatizado apunta hacia abajo. Inspeccione la posición y la forma de las gotas, compruebe que los pines de la placa de circuito impreso (PCB) están alineados con los contactos en el chip EWOD, conecte el fotodetector y colóquelo en la ranura del fotodetector. Después de conectar la electrónica de control a un ordenador, el sistema está listo para ejecutar el ensayo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Uso repetitivo de las placas de accionamiento y el impacto en la tensión de accionamiento. La velocidad media de una gota desde el búfer de funcionamiento se traza en función de la tensión de accionamiento (círculos azules) y la desviación estándar de tres mediciones independientes (N . 3). Aquí el número de ensayos por placa (barras grises) indica una mayor descomposición de la superficie a tensiones más altas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Diagrama de los inmunoensayos probados con EWOD. Cada círculo de este diagrama representa un volumen de 2,5 l cargado en el chip EWOD. El primer protocolo (en el lado izquierdo) muestra ocho LUOs usando conjugado de anticuerpos-HRP premezclado; mientras que el segundo protocolo abarca diez LUOs, añadiendo por separado el anticuerpo de detección biotinilado, la extracción de cuentas y la unión consecutiva del conjugado Neutravidin-HRP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Extracción magnética de perlas. Este proceso se descompone en (a-c) accionando la gota con las cuentas magnéticas suspendidas en el sitio de separación magnética en el medio de la zona de mezcla (pad No. 33), (d, e) el imán se está moviendo en posición enfocando las perlas, (f, g, h) las cuentas se mantienen en su lugar por la fuerza magnética mientras que la gota es accionada por EWOD hacia la almohadilla de desecho (pad No. 41). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Secuencia completa de inmunoensayo sin salida con EWOD, que muestra los reactivos, la carga de muestras y las operaciones de la unidad de laboratorio. Cada fila contiene una secuencia de imágenes de muestra de las operaciones de característica en una gota. Las operaciones se dividen en columnas. La mezcla no se realiza para las cuentas en suspensión, presentadas por una línea rota negra. Las direcciones de las gotas se indican con flechas azules, las cuentas se resaltan en una de las imágenes mediante una flecha naranja. El cuadro gris (esquina inferior derecha) separa las dos imágenes que representan el movimiento y la posición en el área de detección, el círculo de línea rota resalta el área de detección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Curvas de calibración de inmunoensayos realizados en chip EWOD con la plataforma DMF. Como se informó anteriormente⁶ las tensiones de salida (mV) frente a las concentraciones se muestran para: (A) Albúmina sérica humana, que se utiliza para estudiar el efecto de la concentración de anticuerpos conjugados [C] y el tiempo de incubación, t_inc, medido a partir de la mezcla de las perlas con analito conocido hasta la extracción LUO, (B) B. atrophaeus (BG) esporas que muestran la reproducibilidad del inmunoensayo, (C) MS2 bacterphage inmunoensayo, y (D) E. coli. Abreviaturas: unidades formadoras de colonias (cfu), unidades formadoras de placas (pfu), número de experimentos independientes (N), operación de unidades de laboratorio (LUO). Figura modificada de la publicación anterior⁶. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo Suplementario 1: Secuencia completa para ejecutar la plataforma DMF para el ensayo ELISA automatizado con Neutravidin-HRP como conjugado. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Se muestra la GUI para la medición de la quimioluminiscencia y un ejemplo de una medición con el software. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El protocolo de inmunoensayo EWOD es flexible y puede incluir un número diverso de operaciones de unidades de laboratorio (por ejemplo, antígeno de captura, mezcla, incubación, extracción de cuentas, lavado) dependiendo del tipo de reactivo, estabilidad y requisitos de uso definidos por el protocolo de ensayo. Como prueba de principio, en el artículo actual, se consideran dos protocolos de inmunoensayo que muestran la implementación de ocho o diez LUOs (Figura 4) con el chip EWOD descrito. Esta miniaturización merece del microlitro, volúmenes discretos de reactivos/analitos que aumentan la eficacia del ELISA reduciendo tanto el consumo de reactivos, el tiempo requerido por operación, esencialmente, el tiempo experimental total (6 a 10 min). Además, el ensayo se automatiza con manipulación cronometrada de las gotas que disminuye las variaciones y mejora la precisión del inmunoensayo^17. En su formato actual, el experimento implica el manejo manual de gotas al principio de cada ensayo, que es un punto para seguir discutiendo en la siguiente sección.

Un paso crítico en el método DMF actual es la dispensación de las gotas en la superficie del chip EWOD. Normalmente, se utiliza un micropipeta con una punta desechable para medir el volumen exacto y cargarlo. Sin embargo, puede llegar a ser difícil inmovilizar la gota en la superficie hidrófoba de la placa de accionamiento debido a las interacciones entre la gota y la superficie cargada de la punta desechable. Como resultado, la gota puede disparar hacia arriba siguiendo la superficie exterior de la punta en lugar de permanecer en la placa. Para evitar esto, el micropitón debe mantenerse en posición vertical, perpendicular a la superficie de la viruta, sin tocarla, entonces la gota se puede dispensar en la plataforma de carga poniéndola en contacto con la superficie. Si la gota se pega a la punta de la pipeta, devuélvala a la solución de stock, cambie la punta y vuelva a depositar una gota nueva. En un desarrollo posterior del actual sistema de prueba de concepto, se puede prever la entrega automática de gotas.

Otro paso crítico, antes de ejecutar el ensayo, es cerrar la tapa del conjunto de placas paralelas. Como se indicó anteriormente en el protocolo, la tapa debe deslizarse en la parte superior de la placa de accionamiento. La superficie hidrófoba de la tapa evita la distorsión y el desplazamiento de las gotas que se sientan en la placa de accionamiento. Para garantizar el movimiento suave de la gota, se recomienda utilizar una placa de accionamiento prístina, la carga correcta de las gotas y el conjunto de la viruta. La reutilización de las placas de accionamiento es posible; sin embargo, el número de ciclos depende de las tensiones de accionamiento(Figura 3) y la deposición de analito/reactivo sobre la superficie, también conocida como biofouling. La plataforma presentada utilizaba chip EWOD impreso en cromo, que podría ser reutilizado de forma fiable para mediciones consecutivas hasta cuatro veces en voltaje de funcionamiento de 120 V y limpieza de placas intermedias después de cada experimento. Las placas se reciclaron, para reducir el costo por experimento, descontaminando (cepillar la superficie con agente limpiador sin diluir antes de enjuagar a fondo) los fluoropolímeros amorfos biofouled(Tabla de Materiales)recubriendo y recubriendo un nuevo en la parte superior de la placa. Sin embargo, el reciclaje de placas de accionamiento requiere manipulación manual, costosos reactivos (fluoropolímeros amorfos(Tabla de materiales))y equipos especializados (revestimiento de espín). Los chips EWOD alternativos se investigan con éxito con sustratos rentables como papel^19,películas de acetato o placas de circuito impreso (PCB)^20,21. Estos consumibles desechables pueden facilitar un uso fiable y asequible de la plataforma DMF y pueden proporcionar medios para evitar el problema del biofouling.

El biofouling es la principal limitación de EWOD para aplicaciones biológicas^22,23. Estudios anteriores sobre DMF han identificado dos mecanismos que contribuyen al biofouling, a saber, la adsorción pasiva debido a interacciones hidrofóbicas, y una adsorción impulsada electrostáticamente que se manifiesta cuando se aplica un campo eléctrico²⁴. Los hallazgos en el artículo actual son consistentes con esta teoría, ya que se documentó la reusabilidad de la placa de accionamiento disminuye en voltajes de accionamiento altos. Una posible explicación es que las proteínas se absorben fácilmente en superficies recubiertas de fluoropolímero (como teflón) y se agregan más rápido en fouled en comparación con superficies prístinas²⁴. Como consecuencia, los ensayos relacionados con proteínas en DMF son difíciles de cuantificar y pueden experimentar pérdida de analito, contaminación cruzada y disminución de la precisión¹⁷. El peor de los casos es cuando una cantidad crítica de adsorbes de proteínas, lo que hace que el dispositivo sea inútil. Para minimizar el biofouling, se han investigado varios enfoques desde la minimización del tiempo de residencia de la gota en el chip, a través de recubrimientos^23,hasta aditivos (es decir, tensioactivos o ácido plurónico) en las gotas de^{biomateriales cargados 6,22}. Por lo tanto, un aspecto importante del ensayo de inmunoensayo en EWOD es elegir estrategias antibiofouling que sean compatibles con el protocolo específico en cuestión.

La plataforma DMF automatizada está diseñada para realizar una sola prueba ELISA de sándwich por carrera mientras se utilizan volúmenes de microlitros tanto para reactivos como para analitos. Cuando se requiere, existen kits ELISA sándwich convencionales basados en placas pre-recubiertas de 96 o 384 pocillos que en combinación con equipos de laboratorio auxiliares dan como resultado un mayor rendimiento por carrera; Basado en el precio de los reactivos solamente, el costo aproximado por ensayo/pozo es de 6.04 USD (580 USD/96) y 0.33 USD (2-580 USD/384) respectivamente. Esto hace que los métodos ELISA convencionales sean ideales para un gran número de muestras procesadas típicamente por personal técnico capacitado en instalaciones de laboratorio centralizadas. Sin embargo, en ubicaciones remotas, el análisis detallado de los costos de ELISA para el monitoreo ambiental mostró que cuando los costos de capital (es decir, los costos de operación de laboratorio, los costos recurrentes, el transporte de muestras, los suministros y el personal) se incluyeron el precio real por ELISA era de 60 USD de los cuales 34 USD eran para suministros por muestra²⁵. Por el contrario, la plataforma DMF propuesta es portátil, requiere un entrenamiento mínimo para operar y con cuentas pre-recubiertas puede proporcionar análisis de muestra a respuesta en cuestión de minutos. Por lo tanto, la tecnología presentada se puede implementar en ubicaciones de puntos de necesidad y complementar los análisis disponibles de otro modo en laboratorios centralizados.

En la sección de resultados representativos, se utilizó la plataforma de inmunoensayo SMF automatizada para la detección directa de patógenos para la aplicación de defensa. Otras aplicaciones posibles para la plataforma DMF abarcan, pero no se limitan a, biodiagnóstico, monitoreo continuo y muestreo automatizado. Potencialmente, el DMF podría afectar a diversos sectores, desde el punto de atención para la atención sanitaria personalizada, así como la vigilancia controlada del medio ambiente para la protección de los pacientes de la infección adquirida hospitalaria, hasta el sistema de monitoreo de cultivos para la agricultura y la agricultura y producción de alimentos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES	Sigma-Aldrich	H9897
Anti-Human Serum Albumin [15C7]	Abcam	ab10241
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP)	Abcam	ab24438
B. atrophaeus (BG) spores	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Blocker Casein	Thermo Scientific	TFS 37582
CNC Dicing/Cutting Saw	MTI Corp, USA	SYJ-400
Cytop	AGC, Japan	CTL-809M	Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating.
E. coli MRE 162	Dstl, UK	N/a
Goat anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Hamamatsu photodiode	Hamamatsu, Japan	S9270
Hidrochloric acid (32%)	Sigma-Aldrich	W530574
Mask manufacturing service	Compugraphics, Scotland, UK	N/a
MS2 virus	Dstl, UK	N/a
Parylene-C, DPX-C	Specialty Coating System, USA	CAS No.: 28804-46-8
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit	Thermo Scientific	88828	Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C.
Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS	Abcam	ab201876
SCS Parylene Deposition System	Specialty Coating System, USA	2010
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm	Pi Kem Ltd	N/a
Spin Coater	SÜSS MicroTec AG, Germany
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo Scientific	37075	It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C.
Tween 80	Thermo Scientific	28328	The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution.