האלקטרו-מערכות מבוססות-פלטפורמת מיקרופלואידיקה דיגיטלית עבור מערכת חיסונית אוטומטית מקושרת אנזימים

Summary

אלקטרונואידים מבוססי מיקרופלואידיג דיגיטלי היא טכניקה העושה שינוי מונחה מתח בזווית המגע לכאורה של droplet מיקרוליטר-נפח כדי להקל על המניפולציה שלה. שילוב זה עם חרוזים מגנטיים פונקציונליזציה מאפשר שילוב של מספר מבצעים ביחידת מעבדה עבור הכנה לדוגמה וזיהוי של פתוגנים באמצעות חיסוני מקושר אנזים (אליסה).

Abstract

המתח האלקטלי הוא האפקט שעליו משתנה זווית יצירת הקשר של droplet החשופה למטען משטח. אלקטרו-בידוד (EWOD) מנצלת את התכונות הדיאלקטרי של סרטים בידוד דק כדי לשפר את צפיפות המטען ומכאן להגביר את ההשפעה החשמלית. הנוכחות של חיובים מביא התפשטות חשמלית המושרה של droplet המאפשר מניפולציה תכליתי על פני משטח הידרופובי. כאן, אנו מדגימים פרוטוקול EWOD מבוסס על עיבוד לדוגמה וזיהוי של ארבע קטגוריות של אנטיגנים, באמצעות פלטפורמת הגשמה אוטומטית משטח, באמצעות שתי וריאציות של שיטות חיסוני מקושרים אנזים (אליסה). אליסה מבוצעת על חרוזים מגנטיים עם מקיבוע נוגדנים ראשוניים אשר ניתן לבחור כדי למקד אנטיגן ספציפי. נוגדן מצומת HRP נקשר האנטיגן מעורבב עם H₂O₂/לומינול עבור קוונפיקציה של פתוגנים שנתפסו. שעות השלמת המילוי של בין 6 ו -10 דקות הושגו, בעוד כמויות זעיר של ריאגנטים היו מנוצלים.

Introduction

השיטה המוצעת שואפת להקל על הכנה לדוגמה אוטומטית עבור אליסה עם זיהוי כמותי של אנטיגנים באמצעות הגישה EWOD מבוססי עם מיקרופלואידיקה דיגיטלי (DMF) ו הפרדה magnetop,. זה הוכח עבור יישומים ביולוגיים מרובים כי DMF בשילוב עם magnetophoresis היא חלופה מעניינת יישומים טיפול נוזלי¹. ליתר דיוק, גילוי פתוגנים הוא היבט משתמע במגזרים רבים, החל בריאות² לחקלאות וסביבה^3,4 לביטחון הלאומי⁵. טכנולוגיית הזיהוי המסוגלת לטפל באיומים מפני פתוגנים חייבים לכלול תפוקה גבוהה (למשל זמן הטיפול הקצר), יעילות (גבול נמוך של זיהוי – לוד – ורגישות גבוהה) וספציפיות (לסוג הפתוגן היעד) כדי שיהיה פונקציונלי⁶.

בעבר, מבוססי EWOD מבוססת-מבוסס על בהצלחה עבור תמלול הפוכה התגובה שרשרת פולימראז (RT-PCR), זיהוי של פתוגן עמיד בפני אנטיביוטיקה (סטפילוקוקוס-עמיד בפני הבית או MRSA ), מ. דלקת ריאות ו ג. אלביאנים באמצעות שבב תקציב נמוך, מודפס מעגל לוח ו-magnetophoresis⁷. הטכניקה הוחלה גם על זיהוי של חומצה deoxyribonucleic (DNA) מוטציות באמצעות פירורצף וזיהוי כימולימינטאו1⁸. הפלטפורמה מבוססי EWOD גם להרחיב את הפונקציונליות שלהם כלפי יישומים המערכת החיסונית, ובכך מאפשר שחזור המדגם בו ואיתור כל בתוך פלטפורמת אחת, משולבת. למשל, עיצוב הewod בודד הפגינו בהצלחה עם פלטפורמת dmf עבור בדיקות נקודת הטיפול עבור המערכת הן מבוססי חרוז מבוסס על-ידי החיסוני לב טרופונין אני מדגימת דם שלמה וכניסוי נפרד RT-PCR עבור זיהוי MRSA². שבב זה מנצל שמן מילוי, אשר מונע אידוי של טיפות ומקלה על מניפולציה אוטומטית אמין של כרכים nanoliter. Bioapplications רב-תכליתי נחקרו עם יישום של גישות דומות dmf המכסים הומוגנית כמותית הטרוגנית חיסוני^9,10 כולל עיצוב של ניסויים (DoE) מחקרים עבור הפרמטר מיטוב הפרמטרים¹¹.

למרות היתרונות הבולטים שלה כדי לעבד התעצמות בשל כרכים עבודה זעיר, פלטפורמת DMF מלא שמן יכול להיות מאתגר ודורש רמת מומחיות מסוימת לפעול. מערכות שמן מלאות, כי הם דורשים רכיב אטום, אינם אידיאליים עבור יישום מסוימים בתחום שבו התחבורה המערכת חשובה. בנוסף, מערכת מבוססת נפט קשה מאוד אם לא בלתי אפשרי להשתמש עבור כמה יישומים ספציפיים לנצל את האוסף חומר יבש על פני השטח כגון הציע ז'או ו צ'ו¹², jönsson-Niedziółka ואח^',foat ואח '¹⁴. לעומת זאת, מערכות ללא שמן הן פשוטות להשתלב וליהנות ממתן תרגום קל של שבב לשבב לדוגמה. מסיבות אלה, השיטה המוצעת פותחה כדי לספק שיטת החיסונית מבוססת EWOD על DMF אשר לא ידרוש נפט, מפשט ביעילות את פעולת ההתקן.

בתרומה זו, אנו מדווחים על שימוש העידו, חופשי לעמוד, פלטפורמת DMF אוטומטית לחלוטין עבור המערכת החיסונית, ואנו לפרט על הפרוטוקול עבור גילוי מהיר של biomolecules, כלומר: חלבונים, וגטטיבי חיידקים, נבגים חיידקיים ווירוסים. שילוב של EWOD שבב עם חלקיקים מגנטיים עבור הכנה לדוגמה אוטומטית immunoprecipitation כבר הפגינו עם מדידה נוספת מחוץ לשורה MS¹⁵. לאחרונה, בתחום אבחון נגד חצבת אדמת igg כבר הפגינו באוכלוסייה מרחוק בצפון מערבי של קניה על ידי קבוצת וילר¹⁶. הן של ווילר והן של המערכת שלנו, להיות הניתנים להעברה, עצמית הכלול, אוטומטי לחלוטין עם כלול על שבב, מדידות כימי בזמן אמת הם ללא ספק בין המתקדמים ביותר DMF מערכות ביולוגי זמין.

שתי המערכות תוכננו עם יישומים שונים מאוד בראש. המערכת של וילר מטרות ביולוגיים כדי לאפשר אבחון ביו רפואי על מטופלים ואילו מערכת ביולוגית שלנו בנויה סביב דרישת ההגנה לאיתור ישיר של הפתוגן שנדגמו בעבר מהאוויר. הדמיון בין השניים הוא העיקרון הבסיסי של ה-droplet, אשר ממחיש את המגוון הרחב של מגזרים חיים המשפיעים על הטכנולוגיה מבוססת EWOD יכול להשפיע. כלומר, מבוססי DMF פלטפורמת זיהוי ומערכת EWOD הקשורים יכול למצוא משתמע מפתח בריאות (אבחון ביו רפואי); הגנה צבאית ואזרחית (גילוי איום); Agri-טק (ניטור חיתוך) ובטיחות עבודה (ניטור סביבה מבוקרת)

הביצועים של פלטפורמת DMF שלנו מוערך כנגד זיהוי אוטומטי מלא של אלבומין סרום האדם (HSA, חלבון כדורי), האנציכיה coli (E. coli, חיידקים וגטטיבי), באקלוס האטרופאג (BG, נבג בקטריאלי) ו MS2 (וירוס בקטריה). חשוב מכך, DMF המוצע-שיטה הוא תכליתי מאוד במובן כי נוגדנים ללכוד יכול להיות מוחלף כדי למקד את הזיהוי של אנטיגנים אחרים שונים מארבעת שנחשבים במאמר זה. צד מבוסס על הנוגדן המבוסס על חישה לחלוטין, פלטפורמת DMF יכול לבנות ליישום פוטנציאלי מבוסס על ביולוגית aptamer אלף, שבו חרוזים מגנטיים לשאת aptamers ספציפיים ללכוד ו/או זיהוי של נוקלאוטידים. העיצוב והמימוש של הרכיבים השונים המרכיבים את פלטפורמת DMF המשולבת, הכלולה לחלוטין באופן עצמאי, כולל מחולל צורת גל במתח גבוה ואלקטרוניקה כונן היא נחשפה במקום אחר⁶.

Protocol

1. הצעדים הראשוניים הנחוצים לצורך הסדר

הערה (חשוב): יש לנהל את כל הצעדים הראשוניים בסביבה סטרילית כדי להימנע מזהום. נתרן אזיד לא צריך לשמש אחסון כפי שהוא היה לעכב את הפעילות של peroxidase (hrp) האנזים.

1. הכנת מאגר ריצה (100 מ"מ HEPES, pH 7.5), באמצעות (4-(2-הידרוקסיל) פיפראזין-1-החומצה ethanesulfonic, ולהוסיף רצף ה80 לריכוז של 0.01% (v/v).
2. לשתק את הנוגדנים העיקריים (נוגדנים ללכוד) על פני השטח של מיקרוחרוזי מגנטי המופעל על ידי ביצוע הפרוטוקול שסיפק הספק. בקצרה, פרוטוקול IP/Co-IP המגנטי (טבלת חומרים) מקיף את השלבים הבאים.
   1. 0.2 mL של חרוזים (2 מ ג) לתוך צינור פלסטיק ולהסיר את supernatant.
   2. לשטוף את החרוזים על ידי הוספת 1 מ ל של הקרח קר 1 מ"מ HCl.
   3. אגד את הנוגדן הנבחר (חלבון אנטי-אדם אלבומין [15C7], שופני-BG רב-שבטים, Rb anti-E הקולי mre 162 שבטיים או עז ANTI-MS2 שבטים), 40 μg/mL ב 67 MM Borate מאגר, בעקשנות לחרוזים עבור 1 h עם טלטול ב 37 ° c. טבלה 1 מכילה את רשימת כל הנוגדנים הנמצאים בשימוש עם הפרוטוקול הנוכחי ופתוגנים אנטיגן⁶.
   4. רוחצים את הנוגדנים הלא מאוגדים פעמיים עם 0.8 mL של מאגר האלוטור.
   5. כיבוי התגובה עם 1 מ ל של מאגר קוצ'ינג עבור 1 h.
   6. רחץ את החרוזים פעם אחת עם מאגר Borate שונה ופעם עם הליזה IP/מאגר לשטוף.
   7. השהה מחדש את החרוזים ב-0.5 mL של מאגר לפירוק IP/שוטף את המאגר ואחסן ב-4 ° צ' עד לצורך השימוש.
      הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אצווה טרייה של חרוזי מיקרו מצמידים לנוגדנים יום לפני הבידוד של הEWOD ו-אליסה על שבב. עם זאת, המיקרוחרוזים מצמידים את הנוגדן העיקרי ניתן לאחסן ב 4 ° c עד חודש אחד. על מנת להתרחש, הקש על המבחנה כדי לשבור את הזרז ולהשעות מחדש את החרוזים בתמיסה.
   8. לחסום את המיקרוחרוזים עם הנוגדן מצמידים לילה, באמצעות ריכוז סופי 4 מ"ג/mL עבור מיקרוחרוזים, ב החוסם קזאין (1% w/v) ב 100 mM פוספט מאגור מלוחים (PBS).
      הערה: השלב החוסם מתנהל תמיד ביום לפני הפעלת הערך של זיהוי ביולוגי.
   9. הפרד את החרוזים מהקזאין של החוסם באמצעות מגנט והסר את הסופרנטאנט.
   10. השהה מחדש 1 מ ל של מאגר פועל ומערבבים עבור 1 דקות.
   11. הפרידו את החרוזים בעזרת המגנט והסירו את הסופרנטאנט.
   12. חזרו על שלבי הכביסה שלעיל (1.2.10 ו-1.2.11) פעמיים.
       הערה: שלושה צעדי כביסה מספיקים כדי להפחית את הדבקה של החרוזים על פני השטח ולהקל על התנועה החופשית של ה-droplet.
   13. השהה מחדש את החרוזים במאגר הפועל בריכוז של 2.5 מ"ג/mL. פתרון זה של מיקרוחרוזים הוא מוכן לשימוש עם שבב EWOD.
3. להכין פתרון של חזרת מneutravidin מצובית peroxidase (HRP) ואת הנוגדן biotinylated משני לריכוז הסופי עבור כל אחד μg/mL במאגר פועל (משמש לזיהוי BG⁶).
   הערה: כדי למקד את האנטיגנים (טבלה 1) ריכוזים שונים של נוגדן biotinylated משני, החל 0.5 כדי 4.0 μg/mL נבדקו בהצלחה.
4. מערבבים כמויות שוות של הלומינול עם מימן הפתרון חמצן רק לפני הפעלת התשובה
   הערה: לומינול משמש לכמת את מספר האירועים המחייבים בהתבסס על האנזים HRP כי הוא מאוגד לנוגדן המשני אשר מטרות אנטיגן (למשל, פתוגן). עם זאת, ניתן להשתמש במולקולה ובאסטרטגיות של דיווח שונה לאיתור¹⁷ במקום כימול ולומייול.

2. ייצור וטיפול פני השטח של רכיבי שבב EWOD

הערה: שבב EWOD מורכב צלחת הגשמה עם אלקטרודות כרום בדוגמת להחליף את זווית המגע לכאורה של droplet ו צלחת כיסוי כדי להגדיר את הגובה של טיפות.

1. ציירו את העיצוב של האלקטרודות והמחברים ב-2D באמצעות תוכנת CAD סטנדרטית. כלול גם את משטח אוסף הפסולת עם מימדים של 5 x 5 מ"מ² כדי לאחסן את ממיסים משומשים (איור 1).
   הערה: כדי לתמרן את טיפות אנו משתמשים 47 אלקטרודות, כל אחד עם מימדים של 1.7 x 1.7 mm². גודל האלקטרודה הזה מתאים לאמצעי לידה של droplet החל מ-1.5 μl עד 3 μl (עבור מרווח של 500 יקרומטר). מניסיון, בעת עבודה עם פער 500 יקרומטר, 1.5 μl הוא גודל ה-droplet המינימלי שניתן להפעיל. זה מתאים בערך droplet (מוקרן) מתאר להיות חוסם את הלוח המרובע. עם זאת, אין מגבלה תאורטית בגודל אחר מאשר נגרמת על ידי ההתנגדות (חיכוך) של גוף הנוזל. עם זאת, מומלץ שאמצעי האחסון לא יעלה על 3 μl לצורך הגשמה אמינה באמצעות פער של 500 יקרומטר. האלקטרודות מטופלות על-ידי. אלקטרוניקה 48 ערוצים
   הערה: ממדי העיצוב והגדלים של הרפידות עשויים להשתנות בהתאם לאמצעי האחסון המיועדים ולפעולות יחידת המעבדה (LUOs) המרכיבות את הפרוטוקול.
2. שלח את ציור העיצוב לשירות ייצור מסכה להדפסת מסיכת כרום על מצע זכוכית. עובי שכבת הרום הוא 100 ננומטר.
   הערה: שכבת הרום על הפושאול המשמשת כמצע לשבב ה-EWOD היא, לפי ההגדרה, אטומה. העיצוב של כל אחד אלקטרודות שלנו כולל פריסת רשת כדי להבטיח חצי שקיפות.
3. חותכים את הצלחת בגודל של 56 x 56 מ"מ² עם מראה מדויק CNC מסור/גזירה.
4. הדבק סרט מיסוך על המגעים החשמליים כדי לבודד אותם במהלך שני שלבי הציפוי.
5. מעיל צלחת זכוכית כרום עם שכבה מדידות על ידי הפקדת 6 יקרומטר פארילין-C על פני השטח שלה. תהליך גורהאם¹⁸ משמש עם 7.4 g של dpx-C במערכת התצהיר פארילין (טבלת חומרים).
6. ספין-מעיל אמורפיים fluoropolymers (טבלה של חומרים) באמצעות ספין-מאטר ב 1500 rpm עבור 30 s על גבי הצלחת ולאפות אותו ב 140 ° c עבור 30 דקות.
   הערה: זה מעבד את פני המים הידרופובי. ניתן לאמת אם הציפוי הופקד בהצלחה על ידי הצבת droplet של מים על פני השטח. זווית המגע בין ה-droplet ללוחית חייבת להיות באזור 110 º.
7. הסר את קלטת המסיכה מאנשי הקשר החשמליים.
8. ספין-מעיל אמורפיים fluoropolymers (הטבלה של חומרים) באמצעות ספין-מאטר ב 1500 rpm עבור 30 s על גבי וופל 4 ב סיליקון ואופים אותו ב 140 ° c עבור 30 דקות.
   הערה: חשוב ששני המשטחים של האקטוציה ולוחיות הכיסוי הם הידרופובי כדי להקל על התנועה החלקה של הטיפות הנפרדות במהלך הבחינה.

3. העמסה, הרכבה ותפעול של שבב EWOD בפלטפורמת DMF

הערה: שבב EWOD פועל תוך שימוש בתצורת צלחת מקבילה עם פער מוגדר במדויק 0.5 מ"מ בין הצלחת האקטואציה לבין צלחת הכריכה המנומנת והמוליך. מכלול זה כריך מתואר בסעיף הנוכחי.

1. הסירו את המכסה מרציף DMF⁶ והניחו אותו על הספסל.
   הערה: חדר כלוב של פאראדיי, הכרחי כדי למנוע התערבות של אור תועה והפרעה אלקטרומגנטית במהלך האיתור. אין משתלבים על המכסה, ולכן, הפלטפורמה מאפשרת לנו להתבונן התנועה של טיפות.
2. מניחים צלחת הגשמה נקייה על הבמה מסתובבת, כרום פונה כלפי מעלה. הלוח צריך להיות מיושר עם הפינה השמאלית העליונה של שלב שקוע (איור 2א).
3. הדק את לוחית הזיהוי מלמעלה באמצעות החלונית עם הפינים של 47 המגע. פעולה זו מאבטחת את הצלחת למקומו ומקלה על יישור עם סיכות המגע.
4. הנח את ה-0.5 מ"מ ו-2 מפריד ההפרדה (PMMA) משני מ"מ על השלב המסתובב, על מנת לספק פער מבוקר בין האקטוציה לבין לוחיות הכיסוי.
   הערה: באופן אופציונלי, נייר מחירור ניתן להציב על משטח לסילוק פסולת לפני שליצטט את טיפות לפני השלב הבא. במהלך העבודה, הפסולת נספג ישירות לתוך הנייר שניתן להסירו בסוף התיכול.
5. טען את הטיפות לרפידות הטעינה המוצעות (איור 1).
   1. מרחק 4 2.5-μL טיפות מהמאגר הפועל אל מאגר ה-B-, A-, R-, E-מסומן, droplet אחד בכל כרית.
   2. Aliquot 2.5 μL של לומייול: H₂O₂ (1:1, v/v) פתרון על משטח D-מסומן.
   3. Aliquot 2.5 μL של Neutravidin מצומנת ל HRP (1 μg/mL) על כרית F מסומנים.
   4. Aliquot 2.5 μL של נוגדן משני Biotinylated (1 μg/mL) אל הלוח מסומן G.
   5. Aliquot 2.5 μL של מיקרוחרוזים עם נוגדן ראשוני מצוב (2.5 mg/mL) ללכת על כרית מסומן.
   6. Aliquot 2.5 μL של המדגם לא ידוע על כרית C מסומן.
      הערה: תבנית הטעינה המוצעת היא דוגמה אחת בלבד לפריסה ניסיונית, אולם ניתן לשנות את תבנית הטעינה כדי להתאים לצורכי המשתמשים, כל עוד שינויים אלה תואמים לרצף שהוגדר בתוכנה (קובץ משלים 1).
6. הניחו את לוחית הכיסוי על פני המתקן, מלבד הפסקה העגולה, והחליקו אותה לתוך ההפסקה והחלק העליון של לוחית האקטולית (איור 2ב').
7. שים את המגנט הקבוע על גבי לוחית הכיסוי ולאבטח אותו על ידי הזזת שני התפסים (איור 2ג).
8. סובב את השלב על-ידי 180 ° ובדוק אם הטיפות הטעונות עדיין נמצאות במקומם (איור 1ג).
   הערה: האדם צריך להיות מסוגל לעין את המיקום ואת צורת טיפות דרך השלב השקוף ואת החלק האחורי של לוחית האקטוטית (איור 2ד). המנה מוכנה לפעול אם ניתן לראות טיפות עגולות על גבי רפידות האלקטרודות הנטענות. במקרה, droplet הוא עקורים אחד יכול להסיר את המגנט ואת לוחית הכיסוי, ואז לשחזר את droplet העקורים עם פיפטה נקי ולמקם אותו שוב על משטח הטעינה.
9. בדוק שמיקום הטעינה עבור כל droplet תואם לרצף האקטואריה המתוכנת בתוכנה (ראה קובץ משלים 1 לקבלת פרטים על התוכנה).
   הערה: כדי שתוכל לבדוק באופן חזותי את מיקום הטיפות, יש לפרוק את גלאי התמונות (איור 2ד).
10. הצב את הגלאי המוקרן "יכול" לתוך החריץ של השלב המסתובב.
    הערה: מערכת איתור התמונות מסתובבת סביב פוטודיודה, שבה יש שטח אוסף גדול (10 x 10 מ"מ²) כדי למקסם את אוסף האור ללא אופטיקה נוספת, וכן מגבר התנגדות טרנס כדי למזער את הרעש⁶. עם זאת, המערכת רגישה מאוד והוא יכול לאסוף אותות דקה. כדי להפחית את רמת הרעש, מספר אסטרטגיות מבוססות אלקטרוניקה יושמו (למשל, מערכת זיהוי תמונות היה מוגן על ידי הצבת אותו בכלוב פאראדיי, מעטפת מתכת המכונה "יכול" הוקרן).
11. חבר את הכבל לגלאי התמונות המוקרן "יכול".
    הערה: לאחר ששבב ה-EWOD מיושר עם מזהה התמונה, פלטפורמת DMF מוכנה להרכבה מלאה וכעת מוכן לפעולה.
12. מניחים את המכסה על פלטפורמת DMF ולהתחיל את רצף התוכנית באמצעות ממשק התוכנה שפותחה באוניברסיטת הארדשייר.
    הערה: תוכנות נוספות משמשות לקריאה ולהקלטה של האור מ-droplet כפונקציה של זמן בקובץ CSV (ראה קובץ משלים 2).
    1. ודא שהרצף המתוכנת (ראה קובץ משלים 1) הודעות הנחיה מופיעות בממשק כדי ליידע את המפעיל כי "הלומינול droplet מוכן לאסוף את החרוזים המגנטיים המחולצים" או "droplet הזיהוי מוכן לעבור לאתר האיתור". בשני המקרים, אישור מהמפעיל נדרש להמשיך ברצף.

4. הפעלה במצב חזותי (אופציונלי למיטוב פרוטוקולים)

הערה: במידת הצורך, על מנת להמחיש כל פעולה המבוססת על droplet, ניתן להפעיל את הבקשה על-ידי דילוג על שלבים 3.10-3.12 והחלפתו בפעולות הבאות.

1. הפעל את רצף התוכניות באמצעות ממשק התוכנה.
   הערה: ניתן לצפות בתנועת ה-droplet בעת הפעלה במצב חזותי, השימושי במהלך מיטוב הפרוטוקולים. קודם כל, כדי לבדוק את השימוש. בפעילות ההפרדה המגנטית למשל, אם כמות החרוזים בשימוש נמוך מדי, הפרדה מגנטית לא תתרחש, להיפך, אם כמות החרוזים הוא גבוה מדי, ה-droplet עשויה להיות מקיבוע על ידי הגלולה חרוז. שנית, כדי לוודא את האמינות של שיטת חדש כמו ניסוח מסוימים droplet עלול לגרום ליקוי האקטואלי כי ניתן לזהות על ידי התבוננות.
2. הר הפוטוגלאי הוקרן "יכול" לתוך החריץ של השלב המסתובב, כאשר תתבקש.
3. חבר את הכבל לגלאי התמונות המוקרן "יכול", על-ידי הוספת הפינים בשקע.
4. מניחים את המכסה על פלטפורמת DMF ולחדש את הסדר.
   הערה: השתמש בתוכנה הנוספת לקריאה והקלטה של האור מ-droplet כפונקציה של זמן בקובץ CSV (ראה קובץ משלים 2)

5. הסרת פסולת נוזלית וניקוי השבב

התראה: ודא שהציוד מכובה ומנותק ממקורות החשמל (המחשב, הראשי) לפני הניקוי. לובשים כפפות, מעיל מעבדה וזכוכית מגן (PPE) כאשר מסירים דגימות ביולוגיות מהשבב!

1. כדי לגשת לאלקטרודות ואת ממיסים משומשים על לוחית האקטואציה, לפתוח את מכסה פלטפורמת DMF ולסובב את השלב 180 °.
2. Unhinge המעטפת מגנט, להסיר את המגנט מהבמה מסתובבת ומניחים אותו על הספסל.
3. הסר את צלחת הכיסוי, סיליקון וופל, מן הסדק עם זוג מלקחיים, לשטוף אותו עם מים DI, יבש אותו עם אוויר דחוס ולמקם אותו צלחת פטרי, שם וופל ניתן לאחסן ולהשתמש בה מראש.
4. השתמש במיקרופיפטה כדי להזיז את הפסולת הנוזלית מהמשטח מבלי לגעת במשטח.
5. נקו את המשטח באמצעות החירור של הנוזל מלוחית האקטורות באמצעות נייר סופג (חומר סינון).
   הערה: שמירה על פני השטח שלמה תגדיל את תוחלת החיים של לוחית האקטוציה, המאפשרת שימושים רבים.
6. נקו את לוחית האקטואריה על ידי ניקוי עדין של פני השטח של האלקטרודות עם droplet במים נקיים די בעזרת פיפטה נקי. לאחר מכן הסר את ה-droplet בנייר מזויין (חומר סינון).
   התראה: היפטר מהרקמות, הניירות, הטיפים והכפפות הנגועים בחומר ביולוגי בסל הביו-שפכים.
7. השתמש בלוחית האקטויון לקבלת מידע שונה או הסר אותה מפלטפורמת DMF לאחסון או למיחזור.

תוצאות

השפעת המתח האקטואלי נחקרה על מנת להבהיר מה התנאים האופטימליים היו לבצע את הנאמר. Droplet מהמאגר הונחה במתח שונים והתנועה שלו נרשמה. הממצאים הפגינו (איור 3) מתאם קיים בין מתח שורש ממוצע האקטוציה מרובע (V_rms) ואת המהירות הממוצעת. עם זאת, אריכות הימים של צלחת הגשמה הופחת כאשר ערכים גבוהים עבור V_rms שימשו. בהתבסס על התוצאות הללו, 105 V_rms נבחר כמתח הופעה סטנדרטית, 120 v_rms נמצא לעבוד הטוב ביותר עבור H₂O₂/לומייול droplet ו 165 V_rms יושם עבור החילוץ לאו. המתח הזה נכלל ברצף התיכנות האוטומטי (קובץ משלים 1).

שני חיסוני (איור 4) נבדקו בהצלחה באמצעות שבב ewod עם פלטפורמת dmf עבור ארבעה פתוגנים שונים (שולחן 1). שבב EWOD הקלה על התנועה ברציפות של טיפות של רפידות הטעינה לאזור ערבוב ולבסוף לפסולת. היו שני LUOs בסיסיים שחזרו על כל הפרוטוקול כדי להשלים את אליסה. הראשון היה החילוץ לאו; תיאר כאן בקצרה, את ה-droplet המכיל את החרוזים המושהים הונחה לאתר ההפרדה באמצע אזור ערבוב, המגנט הופעל באופן אוטומטי כדי לגשת לשבב ולבריכה את החרוזים המגנטיים לתוך גלולה (איור 5). לאחר מכן, ה-droplet הוזז לעבר משטח הפסולת, מותיר את החרוזים על צלחת האקטואציה, ובכך מסכם את החילוץ לאו. הערבוב היה המפתח הבא שיתקיים בשבב EWOD. מדגם האנליטה עם ריכוז לא ידוע של פתוגנים הועבר על החרוזים על ידי בעלות חשמלית. לאחר מכן החרוזים הושעו מחדש על ידי הזזת ה-droplet עם החרוזים המקרקפות מעל אזור הערבוב (10 רפידות בסך הכל). אלה שני LUOs היו חיוניים כפי שהם הקלה מיניאטורי, עיבוד לדוגמה מהירה, לאחר החשיפה עם זיהוי עוקב של פתוגנים בתוך 6 כדי 10 דקות. איור 6 מראה את הרצף המלא של luos מתוך מערכת חיסונית שבוצעה עם שבב ewod.

כדי לענות על הרמות הרצויות של אוטומציה, ניתן להציג וריאציות בפרוטוקול. למשל, החרוזים הופרדו droplet הדלה האנטיגן, אשר הועבר לאחר מכן למשטח הפסולת, חוזר על החילוץ הבסיסי לאו. בשלב זה, הפרוטוקול יכול הענף תלוי אם הנוגדן זיהוי היה מובח כבר HRP, ביעילות באמצעות שמונה LUOs בסך הכל לאיתור אנטיגנים שונים (איור 7A-C). במקרים אלה, ה-droplet עם נוגדן הזיהוי הובא לחרוזים ולאחר מכן מעורבב על ידי הגשמה. לחילופין, קשירה נוגדן זיהוי המשלים Neutravidin-HRP יכול להתבצע באופן רציף על שבב EWOD, כפי שהוא הפגין עבור כימות של E. coli (איור 7ד). שני הפרוטוקולים, השמונה והעשרה שלבים אליסה (איור 4), הניב גילוי של אנטיגנים.

זמני הדגירה וריכוזי המשלים היו מגוונים כדי למצוא את התנאים האופטימליים לצורך שיטת (איור 7א). נמצא כי זמן הדגירה של 160 s והריכוז המשלים של 2 μg/mL השיגה את האות הטוב ביותר ליחס רעש עם 36% עלייה של עוצמת האות וכמעט אין שינוי ברמות רעש הרקע. כל האיורים והנתונים המשמשים בסעיף התוצאות המייצג שונו מעבודה קודמת⁶.

נוגדן ראשי/לכידה	נוגדן זיהוי	אנטיגן
סרום למניעת האדם [15C7] (אנטי-HSA, Abcam ab10241)	Peroxidase צנון הסוס (HRP) מתויג anti-HSA [1A9] (Abcam ab24438)	חלבון בסרום אנושי (HSA, Abcam)
רב-שבטים בין-BG	רב-שבטים ביוטילנטי	ב. גלוביגי (BG) נבגים
החיידק האנטי-הקולי MRE 162 שבטיים	החיידק הביוטיליס-נגד-אי 162	E. coli MRE 162
שבטים עזים נגד MS2	רב-שבטיים ביוטילנטי MS2	וירוס בקטMS2 ג

טבלה 1: אנטיגנים ונוגדנים שנבדקו עם פרוטוקול זה. ארבעה סוגים של אנטיגנים הפתוגן שימשו כדי להדגים את היכולות של שבב EWOD עם פלטפורמת DMF.

איור 1: עיצוב לוחית ה-EWOD. (א) סימון סכמטי של צלחת האקטואריה של ewod עם מחברים (ריבועים, למעלה) המקושרים (קווים) לאלקטרודות (ריבועים, למטה). לכל כרית מוקצה מספר וניתן לטפל בה מקוד התוכנה (קובץ משלים 1). רפידות האלקטרודות העמסה מסומנים על ידי חיצים מסומנים על ידי האות הרישית מעל או מתחת לכל כרית. תכונה מרכזית עבור פלטפורמת DMF היא אזור ערבוב המורכב מעשרה רפידות (No. 31, 32, 33, 36, 37, 42, 43, 44, 46, 47). כמדריך חזותי, אזור הערבוב מסומן במלבן אדום. (ב) מיקרוגרף של עיצוב המיקרוגריד של הרפידות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: רכיבים ושלבי מפתח להרכבת מערכת מיקרופלואידיג דיגיטלי (DMF). (א) לתקן את הצלחת הגשמה ewod, למקם את shim על הבמה מסתובבת ולטעון את טיפות. (ב) מקמו את לוחית הכיסוי. (ג) הר את המקרה מגנט, להדק את התפסים ולסובב את השלב 180 °. (ד) המגנט האוטומטי מצביע כלפי מטה. בדוק את המיקום והצורה של הטיפות, ודא שהפינים של לוח המעגלים המודפסים (PCB) מיושרים עם אנשי הקשר בשבב EWOD, חבר את מזהה התמונה ומקם אותו לתוך חריץ הפוטוגלאי. לאחר חיבור האלקטרוניקה של הבקרה למחשב, המערכת מוכנה להפעיל את הערך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: שימוש חוזר ונשנה בלוחות האקטורות ובפגיעה במתח האקטואלי. המהירות הממוצעת של droplet מהמאגר הפועל מותווית כפונקציה של מתח הגשמה (עיגולים כחולים) וסטיית התקן משלוש מדידות עצמאיות (N = 3). כאן מספר האחוזים של הלוח (פסים אפורים) מציין ריקבון משופר של פני השטח במתח גבוה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תרשים החיסוני אומר שנבדק באמצעות EWOD. כל עיגול בדיאגרמה זו מייצג נפח של 2.5 μL שנטען אל שבב ה-EWOD. הפרוטוקול הראשון (בצד שמאל) מראה שמונה LUOs באמצעות מראש נוגדן HRP המשלים; בעוד, הפרוטוקול השני כולל עשר LUOs, הוספת בנפרד של נוגדן זיהוי biotinylated, הוצאת חרוז וכריכה עוקבת של Neutravidin-HRP המשלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: הוצאת חרוזים מגנטית. תהליך זה מופר לתוך (a-c) מימוש ה-droplet עם חרוזים מגנטיים מושעה לאתר ההפרדה המגנטי באמצע אזור ערבוב (pad לא. 33), (ד, ה) המגנט הוא נע לתוך העמדה התמקדות חרוזים, (f, g, h) חרוזים מוחזקים במקום על ידי הכוח המגנטי בעוד droplet הוא למעשה משם על ידי ewod לכיוון משטח הפסולת (pad No. 41). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: השלמת רצף המערכת החיסונית באמצעות EWOD, המציגה את הריאגנטים, הטעינה לדוגמה ופעולות מעבדה. כל שורה מכילה רצף של תמונות לדוגמה מהפעולות האופייניות ב-droplet. הפעולות מחולקות לעמודות. ערבוב אינו מבוצע עבור החרוזים בהשעיה, המוצגת על ידי קו שבור שחור. כיווני Droplet מצוינים על-ידי חיצים כחולים, החרוזים מודגשים באחת התמונות על-ידי חץ כתום. התיבה האפורה (הפינה הימנית התחתונה) מפרידה בין שתי התמונות המייצגות תנועה ומיקום באזור האיתור, מעגל הקו השבור מדגיש את אזור האיתור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: כיול עקומות מתוך המערכת החיסונית שנערכה בשבב EWOD עם פלטפורמת DMF. כפי שדווח בעבר⁶ מתח הפלט (mV) לעומת ריכוזים מוצגים : (א) האדם סרום אלבומין, אשר משמש כדי ללמוד את ההשפעה של הריכוז נוגדן המשלים [C] ואת זמן הדגירה, t_inc, נמדד מערבוב של חרוזים עם אנליטה ידוע עד החילוץ לואו, (ב) ב. הנבגים (BG) מראה את השגות של שיטת האימונוגלובולין, (ג) MS2 בקטביאג החיסוני, ו (ד) 10-luos הפרוטוקול התוצאות עבור אי קולי. קיצורים: המושבה היוצרת יחידות (cfu), יחידות ליצירת פלאק (pfu), מספר הניסויים העצמאיים (N), יחידת מעבדה המבצע (הלאו). איור שונה מהפרסום הקודם⁶. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: רצף מושלם כדי להפעיל את פלטפורמת DMF עבור שיטת אליסה אוטומטית עם Neutravidin-HRP כמשלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: GUI למדידת מדידה כימית ודוגמה מדידה עם התוכנה מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

פרוטוקול המערכת החיסונית של EWOD גמיש ויכול לכלול מספר שונים של פעולות מעבדה (לדוגמה, אנטיגן לכידת, ערבוב, דגירה, מיצוי חרוזים, כביסה) בהתאם לסוג הגיב, יציבות ושימוש בדרישות המוגדרות על ידי פרוטוקול השימוש. כהוכחה לעיקרון, במאמר הנוכחי, שני פרוטוקולים של שיטת החיסונית נחשבים להצגת היישום של שמונה או עשר LUOs (איור 4) עם שבב ewod המתואר. כגון מזעור היתרונות של מיקרוליטר, כרכים בדידים של ריאגנטים/אנליטה המגבירים את היעילות של אליסה על ידי הפחתת הן הצריכה של ריאגנטים, הזמן הנדרש לכל פעולה, למעשה, הזמן ניסיוני הכולל (6 כדי 10 דקות). יתר על כן, הטיפול הוא אוטומטי עם מניפולציה מתוזמן של טיפות אשר מקטין וריאציות ומשפר את הדיוק של שיטת החיסוני¹⁷. בפורמט הנוכחי, הניסוי כולל טיפול ידני של טיפות בתחילת כל שיטת, שהיא נקודה לדיון נוסף בסעיף הבא.

צעד קריטי אחד בשיטת DMF הנוכחית מחלק את הטיפות על פני שבב ה-EWOD. בדרך כלל, מיקרופיפטה עם עצה חד פעמית משמש כדי למדוד את הנפח המדויק ולטעון אותו. עם זאת, זה יכול להיות מאתגר לשתק את ה-droplet על פני המים ההידרופובי של צלחת האקטואציה בגלל האינטראקציות בין ה-droplet לבין המשטח הטעון של הטיפ החד. כתוצאה מכך, ה-droplet יכול לצלם בעקבות המשטח החיצוני של הקצה במקום להישאר על הצלחת. כדי למנוע זאת, יש להחזיק את המיקרופיפטה בתנוחה זקופה, בניצב למשטח השבב, מבלי לגעת בו, ואז ניתן לפנות את ה-droplet למשטח הטעינה על ידי הבאת המגע עם פני השטח. אם ה-droplet נדבק לעצת הפיפטה, החזר אותה לפתרון המניה, החלף את העצה והחזר את ההפקדה הטרייה. בפיתוח נוסף של מערכת הוכחת הרעיון הנוכחית, משלוח אוטומטי של droplet ניתן לקנא.

צעד קריטי נוסף, לפני הפעלת הסדר, סוגר את המכסה של מכלול הלוחית המקבילית. כפי שצוין קודם לכן בפרוטוקול, יש להחליק את המכסה מעל לוחית האקטורות. משטח ההידרופובי של המכסה מונע עיוות ועקירה של טיפות היושבות על לוחית האקטורות. כדי להבטיח את התנועה החלקה של ה-droplet, מומלץ מאוד להשתמש בצלחת הגשמה טהורה, הטעינה הנכונה של טיפות והרכבת שבב. ניתן לשחזר את הצלחות האקטורות; עם זאת, מספר המחזורים תלוי במתח האקטואלי (איור 3) ובתצהיר האנליטה/מגיב על פני השטח, המכונה ביוקציה. הפלטפורמה המוצגת מנוצל כרום מודפס שבב EWOD, אשר ניתן להשתמש מחדש באופן אמין עבור מדידות רצופות עד ארבע פעמים במתח ההפעלה של 120 V ו צלחת ביניים ניקוי לאחר כל ניסוי. צלחות היו ממוחזרים, כדי להפחית את עלות לכל ניסוי, על ידי decontaminating (צחצוח את פני השטח עם סוכן ניקוי בלתי מדולל לפני שטיפה יסודית) fluoropolymers מאמורמים (לוח חומרים) ציפוי וציפוי ספין אחד על גבי הצלחת. עם זאת, מיחזור צלחת אקטוציה דורש טיפול ידני, ריאגנטים יקר (אמורפיים fluoropolymers (טבלת חומרים)) וציוד מיוחד (ספין-coater). שבבי ewod חלופיים נחקרים בהצלחה עם מצעים חסכוניים כגון נייר¹⁹, סרטים אצטט או לוחות^{מעגלים מודפסים}(pcb)²⁰,²¹. מתכלים אלה חד פעמיות יכול להקל על שימוש אמין ובמחיר סביר של פלטפורמת DMF והוא יכול לספק אמצעים כדי לשלב את הבעיה ביואולבינג.

ביובאינג היא המגבלה העיקרית של EWOD ליישומים ביולוגיים^{22, 23}. מחקרים מוקדמים יותר על DMF זיהו שני מנגנונים התורמים לביוקציה, כלומר, ספיחה פסיבית עקב אינטראקציות הידרופובי, ומפגינה ספיחה אלקטרוסטטית מונחה כאשר שדה חשמלי מוחל²⁴. הממצאים במאמר הנוכחי תואמים את התיאוריה הזאת כפי שהוא תיעד את הצלחת האקטואציה פוחתת התמדה במתח הגשמה גבוה. הסבר אחד אפשרי הוא כי החלבונים ספוח בקלות על Fluoropolymer מצופה (טפלון) משטחים והם מצטברים מהר יותר על עבירה בהשוואה משטחים בתוליים²⁴. כתוצאה מכך, הקשורות חלבון מוסר ב DMF קשה לכמת ועלול להיתקל באובדן של אנליטה, הזיהום הצולב ודיוק מופחת¹⁷. התרחיש הגרוע ביותר הוא כאשר כמות קריטית של החלבון adsorbs ובכך לעיבוד המכשיר חסר תועלת. כדי למזער את הביו-שיטות, הגישות השונות נחקרו מפני הפחתת זמן המגורים של ה-droplet על השבב, דרך ציפויים²³, לתוספים (כלומר, חומרים מסוררים או חומצה פלורליסטית) לתוך טיפות הביותית^{6, 22}. מכאן, היבט חשוב של שיטת החיסונית על EWOD היא לבחור אסטרטגיות אנטי-ביוגיות התואמות את הפרוטוקול הספציפי בהישג יד.

פלטפורמת DMF אוטומטית נועד לבצע בדיקת סנדוויץ ' אחד בודד לכל לרוץ תוך שימוש בכרכים מיקרו ליטר הן ריאגנטים ו-אנליטה. כאשר נדרש, כריך קונבנציונלי ערכות אליסה להתקיים מבוסס על מצופה מראש 96-טוב או 384-טוב צלחות כי בשילוב עם ציוד מעבדה עזר תוצאה תפוקה גבוהה יותר לכל הפעלה; מבוסס על מחיר ריאגנטים בלבד, עלות משוער לכל מידה/גם הוא 6.04 USD (580 USD/96) ו 0.33 USD (2 × 580 USD/384) בהתאמה. הדבר מעבד את שיטות ה-אליסה הקונבנציונליות האידיאליות עבור מספר רב של דגימות המעובדות בדרך כלל על ידי אנשי מעבדה טכניים במתקני המעבדה המרוכזים. עם זאת, במיקומים מרוחקים, ניתוח עלות מפורטת של אליסה לניטור סביבתי הראה כי כאשר עלויות ההון (כלומר, עלויות הפעלה מעבדה, עלויות חוזרות, לדוגמה הובלה, אספקה וכוח אדם) היו כלולים מחיר בפועל לכל אליסה היה 60 USD של אשר 34 USD היו עבור אספקה לכל לדוגמה²⁵. לעומת זאת, פלטפורמת DMF המוצעת היא ניידת, הדורשת הכשרה מינימלית לתפעול ומחרוזות מצופות מראש, המספקות ניתוח מדגם לתשובה בדקות. מכאן, ניתן לפרוס את הטכנולוגיה המוצגת למקומות שבהם צריך להיות נקודת הצורך וניתוחים משלימים הזמינים אחרת במעבדות ממורכזות.

בסעיף תוצאות הנציג, הפלטפורמה האוטומטית של המערכת החיסונית DMF שימש לזיהוי ישיר של פתוגנים עבור בקשה להגנה. יישומים אפשריים אחרים עבור פלטפורמת DMF מקיפים אך אינם מוגבלים, bioאבחוניים, ניטור רציפה ודגימה אוטומטית. פוטנציאל dmf יכול להשפיע מגזרים שונים מנקודת הטיפול עבור בריאות אישית, כמו גם פיקוח על הסביבה מבוקרת להגנה על חולים מפני זיהום מוטס החולים נרכש, כדי לחתוך מערכת ניטור עבור חקלאות ו ייצור מזון.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES	Sigma-Aldrich	H9897
Anti-Human Serum Albumin [15C7]	Abcam	ab10241
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP)	Abcam	ab24438
B. atrophaeus (BG) spores	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Blocker Casein	Thermo Scientific	TFS 37582
CNC Dicing/Cutting Saw	MTI Corp, USA	SYJ-400
Cytop	AGC, Japan	CTL-809M	Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating.
E. coli MRE 162	Dstl, UK	N/a
Goat anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Hamamatsu photodiode	Hamamatsu, Japan	S9270
Hidrochloric acid (32%)	Sigma-Aldrich	W530574
Mask manufacturing service	Compugraphics, Scotland, UK	N/a
MS2 virus	Dstl, UK	N/a
Parylene-C, DPX-C	Specialty Coating System, USA	CAS No.: 28804-46-8
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit	Thermo Scientific	88828	Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C.
Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS	Abcam	ab201876
SCS Parylene Deposition System	Specialty Coating System, USA	2010
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm	Pi Kem Ltd	N/a
Spin Coater	SÜSS MicroTec AG, Germany
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo Scientific	37075	It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C.
Tween 80	Thermo Scientific	28328	The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution.