قياس سرعة انتشار النبض، وقابلية التشتت والسلالة في نموذج الماوس الأبهري البطني

Summary

تصف هذه المخطوطة بروتوكولًا مفصلًا لاستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية عالي التردد لقياس القطر اللموي وسرعة انتشار النبض ووضوح القابلية والضغط الشعاعي على نموذج الماوس من تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني.

Abstract

يُعرَّف تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني (AAA) بأنه تمدد موضعي للأبهر البطني يتجاوز القطر اللاالفيللي الأقصى (MILD) بمقدار 1.5 مرة من حجمه الأصلي. وقد أظهرت الدراسات السريرية والتجريبية أن تمدد الأوعية الدموية الصغيرة قد تمزق, في حين أن السكان الفرعية من تمدد الأوعية الدموية الكبيرة قد تبقى مستقرة. وهكذا، بالإضافة إلى قياس قطر الأورمنالمنتال من الأورطان، معرفة الصفات الهيكلية للجدار السفينة قد توفر معلومات هامة لتقييم استقرار AAA. وقد برز مؤخرا تصلب الأبهر كأداة موثوق بها لتحديد التغيرات المبكرة في جدار الأوعية الدموية. سرعة انتشار النبض (PPV) جنبا إلى جنب مع عدم القابلية وسلالة شعاعي هي طرق مفيدة للغاية الموجات فوق الصوتية القائمة على ذات الصلة لتقييم تصلب الأبهر. الغرض الأساسي من هذا البروتوكول هو توفير تقنية شاملة لاستخدام نظام التصوير بالموجات فوق الصوتية للحصول على الصور وتحليل الخصائص الهيكلية والوظيفية للأورطام على النحو الذي يحدده MILD ، PPV ، عدم القابلية للإجهاد والإجهاد الشعاعي.

Introduction

يمثل تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني (AAA) مرضًا كبيرًا في القلب والأوعية الدموية يتميز بتمدد موضعي دائم للأبهر يتجاوز قطر الوعاء الأصلي بمقدار 1.5 مرة¹. AAA تحتل المرتبة بين أعلى 13 أسباب الوفيات في الولايات المتحدة². ويعزى تطور AAA إلى انحطاط الجدار الأبهري وتجزئة الإيلاستين، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى تمزق الأبهر. قد تحدث هذه التغييرات في الجدار الأبهري دون زيادة كبيرة في القطر اللامنشهر الحدالأقصى (معتدل)، مما يشير إلى أن خفيفة وحدها ليست كافية للتنبؤ شدة المرض³. لذلك ، يجب تحديد عوامل إضافية للكشف عن التغيرات الأولية في الجدار الأبهري ، والتي قد توجه خيارات العلاج المبكر. الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير دليل عملي لتقييم الخصائص الوظيفية الأبهرية باستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية كما تتميز قياسات سرعة انتشار النبض (PPV) ، وعدم القابلية للإجهاد والسلالة الشعاعية.

نموذج تجريبي يتميز بشكل جيد لدراسة AAA ، الذي وصفه لأول مرة Daugherty وزملاؤه ، ينطوي على ضخ تحت الجلد من الأنجيوتنسين الثاني (AngII) عبر مضخات تناوليكية في Apoe^-/- الفئران⁴. وكان القياس الدقيق للخفيفة باستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية مفيدة في توصيف AAA في هذا النموذج الماوس⁵. على الرغم من أن التغيرات النسيجية أثناء تطوير AAA قد درست على نطاق واسع، والتغيرات في الخصائص الوظيفية للجدار السفينة مثل تصلب الأبهر لم يتم توصيفها بشكل جيد. يؤكد هذا البروتوكول على استخدام الموجات فوق الصوتية عالية التردد في تركيبة مع التحليلات المتطورة كأدوات قوية لدراسة التقدم الزمني لـ AAA. على وجه التحديد، هذه النهج تسمح لنا لتقييم الخصائص الوظيفية للجدار السفينة كما تقاس PPV، عدم قابلية التحمل وسلالة شعاعي.

الدراسات السريرية الحديثة في البشر مع AAA, وكذلك في نموذج AAA اليورين الناجم عن الإيلاسا, تشير إلى وجود علاقة إيجابية بين تصلب الأبهر والأبهر يقطر^6,7. PPV، وهو مؤشر على صلابة الأبهر، يتم قبوله كقياس ممتاز لقياس التغيرات في تصلب في جدار السفينة^6،8. يتم حساب PPV عن طريق قياس وقت عبور شكل الموجة النبضية في موقعين على طول الأوعية الدموية ، وبالتالي توفير تقييم إقليمي للتصلب الأبهري. لقد أثبتنا مؤخرا أن زيادة صلابة الأبهر كما تقاس PPV، وعلى المستوى الخلوي على النحو المحدد باستخدام المجهر القوة الذرية، ويرتبط بشكل إيجابي مع تطوير تمدد الأوعية الدموية⁹. علاوة على ذلك ، تشير الأدبيات إلى أن تصلب الأبهر قد يسبق تمدد الأوعية الدموية ، وبالتالي قد يوفر معلومات مفيدة حول الخصائص الجوهرية الإقليمية لجدار السفينة أثناء تطوير AAA^10. وبالمثل، فإن قياسات عدم القابلية للإجهاد والسلالة هي أدوات القياس الكمي لقياس التغيرات السابقة في اللياقة الشريانية. الشرايين الصحية مرنة ومرنة ، في حين أنه مع زيادة صلابة ومرونة أقل ، يتم تقليل عدم القابلية للإجهاد والإجهاد. هنا ، نقدم دليلًا عمليًا وبروتوكولًا تدريجيًا لاستخدام نظام الموجات فوق الصوتية عالي التردد لقياس MILD و PPV وعدم القابلية للإجهاد والإجهاد الشعاعي في الفئران. ويوفر البروتوكول النُهج التقنية التي ينبغي استخدامها بالاقتران مع المعلومات الأساسية التي توفرها الأدلة الخاصة بأدوات التصوير بالموجات فوق الصوتية المحددة والبرنامج التعليمي المصاحب للفيديو. الأهم من ذلك ، في أيدينا بروتوكول التصوير الموصوف يوفر بيانات قابلة للاستنساخ ودقيقة التي تبدو قيمة في دراسة تطور وتطور AAA التجريبية.

لمزيد من إظهار فائدة التصوير بالموجات فوق الصوتية ، نقدم مثالًا على الصور والقياسات المأخوذة من دراساتنا الخاصة التي تهدف إلى استخدام النهج الدوائية لمنع AAA^{التجريبية 11.} على وجه التحديد ، وقد اقترح إشارة الشق للمشاركة في جوانب متعددة من تطور الأوعية الدموية والتهاب^12. باستخدام الجين haploinly ونهج الدوائية، وقد أثبتنا سابقا أن تثبيط نوتش يقلل من تطور AAA في الفئران عن طريق منع تسلل الضامة في موقع إصابة الأوعية الدموية^13،14،15. للمادة الحالية، وذلك باستخدام النهج الدوائي ة لتثبيط نوتش نركز على العلاقة بين تصلب الأبهر والعوامل المتعلقة AAA. توضح هذه الدراسات أن تثبيط نوتش يقلل من تصلب الأبهر ، وهو مقياس للتقدم AAA^11.

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكول التعامل مع الفئران والتصوير بالموجات فوق الصوتية من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية في جامعة ميسوري واستخدامها (البروتوكول الحيواني رقم 8799) وأجريت وفقًا لـ AALac International.

1. إعداد المعدات وإعداد الفئران

1. إعداد المعدات
   1. بدوره على أداة الموجات فوق الصوتية، هلام الموجات فوق الصوتية أكثر دفئا ووسادة التدفئة.
   2. افتح برنامج الموجات فوق الصوتية وأدخل اسم الدراسة والمعلومات الوصفية لكل فأر.
   3. حدد التطبيق كتصوير عام.
   4. اختيار محول المناسبة لتصوير البطن(الشكل 1B، C). في هذه التجربة، يتم استخدام محول MS400.
   5. تأكد من أن الإيولوفلوران التخدير ومستويات الأكسجين كافية لكل جلسة تجريبية.
   6. تنظيف منصة التصوير الحيواني بالموجات فوق الصوتية.
2. إعداد الماوس
   1. ضع قفص الماوس فوق وسادة التدفئة (36.5 إلى 38.5 درجة مئوية).
   2. عقد بلطف الماوس من قاعدة الذيل ووضع في غرفة isoflurane مليئة بالأكسجين.
   3. توجيه isoflurane وتدفق الأكسجين إلى غرفة التعريفي.
   4. بدوره على المبخر isoflurane وتعيين مستوى الإيفولران إلى 1-2٪ فول / فول. بدوره على ضغط خزان الأكسجين إلى 1-2 لتر / دقيقة.
   5. بعد ~ 2 دقيقة، تأكد من عمق كاف من التخدير من خلال عدم وجود ردود الفعل الانسحاب على قرص وسادة القدم من الماوس.
   6. بعد ذلك، قم بإيقاف تشغيل فرع إمداد غرفة التعريف وشغّل الفرع الموجه إلى مخروط الأنف التخديري.
   7. نقل الفأر من غرفة التعريفي إلى مرحلة التصوير بالموجات فوق الصوتية ووضع مخروط التخدير على أنف الحيوان.
   8. إمالة منصة التصوير الحيواني حول 10 درجة إلى الزاوية اليمنى السفلى للمسح الأمثل(الشكل 1B).
   9. وضع قطرة واحدة من محلول العيون المعقم في كلتا العينين من الفئران لمنع التجفيف تحت التخدير.
   10. وضع الماوس في موقف supine مع أنفه إدراجها في مخروط التخدير.
   11. تطبيق جل القطب على جميع الكفوف الأربعة باستخدام مسحة القطن والشريط الكفوف إلى يؤدي النحاس على منصة التصوير الحيواني لقراءات تخطيط القلب(الشكل 1C).
   12. استخدام المقصات لحلاقة الشعر في موقع التصوير ومن ثم تطبيق كريم إزالة الشعر لإزالة الفراء المتبقية. يترك لمدة أقل من 1 دقيقة.
   13. مسح بلطف قبالة كريم والشعر مع منشفة ورقية رطبة.
   14. مراقبة التنفس وضمان الحفاظ على معدل ضربات القلب بين 450-550 نبضة / دقيقة. إذا كان أقل من هذا المستوى، والحد من تدفق الإيلوفلوران والانتظار حتى يتعافى معدل ضربات القلب.
   15. تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية المُدفئة (37 درجة مئوية) على موقع البشرة المعدة وإرفاق محول إلى حاملها وأسفل إلى أسفل حتى يلامس الجل(الشكل 1C).

2. التصوير بالموجات فوق الصوتية للأورطا البطني

1. ضع المحول أفقيًا (أي عمودي على خط الوسط للفأرة).
2. على نحو سلس هلام الموجات فوق الصوتية وإزالة فقاعات باستخدام عصا الخشب من مسحة القطن.
3. خفض محول ووضع 0.5 - 1 سم تحت الحجاب الحاجز بعد لمس الجل. الآن البدء في مراقبة الصور.
4. تصور الأورطا البطني في عرض المحور القصير(الشكل 1C).
   ملاحظة: B-mode هو الوضع الافتراضي والأكثر فعالية لتحديد موقع الأورطا تشريحياً ووضع المحول. يتم تحديد الأبهر البطني من خلال وجود تدفق النابض باستخدام اللون دوبلر والسلطة دوبلر وسائط في المحور القصير (أي، المقطع العرضي محيطي من الأبهر). ضبط micromanipulators على مرحلة الحيوان ومحول لجلب المقطع العرضي من الأبهر إلى وسط الصورة.
5. تدوير بلطف محول 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة، وضبط ببطء مقبض micromanipulator محور س لتصور الأبهر في عرض محور طويل (المقطع الطولي من الأبهر).
   ملاحظة: في كثير من الحالات، قد تتداخل الغازات المعدية المعوية مع الصورة، أو قد لا يكون الأورطان في الزاوية المثلى للسماح بعرض محور طويل واضح. ضبط زاوية المحول ببطء وأفقيا حتى يتم الحصول على عرض محور طويل مقبول. إذا استمرت المشاكل، ورفع محول، والتحقق من فقاعات الهواء تحت محول، وضبط طفيف زاوية إمالة من مرحلة الحيوان، وإعادة تطبيق المواد الهلامية، وتكرار جميع الخطوات مرة أخرى.
6. تعيين منطقة التركيز والعمق في منطقة الأورطان باستخدام منطقة التركيز وتبديل عمق التركيز، على التوالي. ضبط المنزلق تعويض كسب الوقت يدويا ً لتعتيم تجويف الأورطان لتحقيق التباين الأمثل من جدار الأورتا.
7. ضبط المتلاعب ص محور لتصور النقاط المتفرعة من الارسالية متفوقة والشرايين الكلوية اليمنى. استخدام الشريان الكلوي الأيمن كمعلم لالتقاط صورة من الشريان الأورطا فوق الكلى(الشكل 2A).
8. سجل ما لا يقل عن 100 إطار من الصور B-mode على الشريان الأورطا فوق الكلى.
9. اضغط cinestore لحفظ الصور B-الوضع.
10. اضغط على زر وضع M على لوحة مفاتيح الجهاز لتمكين تسجيل وضع M. لفة الكرة المؤشر لتحقيق خط المؤشر الأصفر إلى أقسام الأبهر العادي مع صورة واضحة جدار السفينة، أو إلى المقاطع حيث لوحظ القطر الأقصى من تمدد الأوعية الدموية.
11. اضغط على تبديل SV/gate وضبط كرة المؤشر لضمان تضمين جدران السفينة في قوس القياس. اضغط على التحديث لتسجيل قياسات وضع M واضغط cinestore لالتقاط(الشكل 2A, B).
    ملاحظة: قد لا يكون القطر الأقصى لتمدد الأوعية الدموية في نفس مستوى التصوير كعرض المحور الطويل الأمثل للأورطام. ضبط مقبض المتلاعب x محور قليلاً لكل قياس M-وضع لضمان أن يتم التقاط خفيفة من كل قسم.
12. للحصول على صور تصور كيلوهيرتز (EKV) ببوابة ECG، اضغط على زر وضع B للعودة إلى تسجيل وضع B.
    ملاحظة: إذا لم تكن الصور حادة، قم بضبط مناور المحور x لتحقيق الصورة الأكثر حدة للجدار العلوي للتجويف على طول مقطع (أي أكثر من 6 مم).
13. اضغط على زر إعدادات Physio على لوحة المفاتيح وحدد التنفس جاتينغ. ضبط تأخير ونافذة الجاتينغ يدويا لتسجيل البيانات فقط خلال أجزاء تملق من موجة التنفس. سيتم عرض أقسام التسجيل ككتل ملونة على تتبع موجة التنفس.
    ملاحظة: بدون تعديل التكبير التنفس، سيتم طمس صور EKV بسبب الحركة الطبيعية للللحيوانات أثناء التنفس.
14. اضغط على زر EKV لتمكين وضع EKV. في القائمة المناسبة، حدد الدقة القياسية ومعدل الإطار 3000 أو أعلى. حدد المتابعة لتسجيل صور EKV. اضغط cinestore لحفظ الصور. استخدم صورة وضع EKV للحصول على قياسات لسرعة انتشار النبض (PPV) وقابلية التشتت والسلالة الشعاعية.
    ملاحظة: قد يفشل تسجيل EKV إذا كانت هناك تقلبات غير طبيعية في التنفس، أو أن الحيوان يطمح بسرعة كبيرة، أو أن إعدادات معدلات الإطارات مرتفعة للغاية. في هذه الحالة، تعيين معدل الإطار أقل وانتظر التنفس الحيواني لتحقيق الاستقرار. عادة ما يكون تحديد معدل الإطار عند 3000 مناسبًا لكل من الفئران والجرذان.

3. خطوات ما بعد التصوير

1. مسح بلطف هلام الموجات فوق الصوتية من منطقة البطن من الماوس مع منشفة ورقية مبللة بالماء الدافئ.
2. وضع الماوس مرة أخرى في قفص المنزل على وسادة التدفئة.
3. إيقاف تشغيل آلة isoflurane، وتنظيف منصة التصوير الحيواني ومحول مع مناديل رطبة.
4. نقل بيانات الصورة التي تم جمعها أثناء الفحص بالموجات فوق الصوتية إلى القرص الصلب.
5. إيقاف تشغيل أداة الموجات فوق الصوتية.
6. بعد أن يتعافى الفأر من التخدير ويكون في حالة تأهب، وإزالة وسادة التدفئة والعودة القفص إلى رف الإسكان الحيوان.

4. تحليل الصور الأبهرالبطني

1. تحليل صور وضع M لقياس MILD
   1. افتح برنامج الموجات فوق الصوتية وأدخل اسم الدراسة والمعلومات الوصفية لكل فأر.
   2. افتح بيانات الموجات فوق الصوتية في برنامج التحليل وافتح صورة M-mode وأوقف نبضات القلب مؤقتًا.
   3. انقر على القياسات.
   4. حدد حزمة الأوعية الدموية من الخيارات المنسدلة. انقر على العمق ورسم خط عبر تجويف الأبهر تمتد من الجدار الداخلي إلى الجدار(الشكل 2C، D).
      ملاحظة: من أجل الاتساق، يجب أن تؤخذ القياسات في المرحلة الانقباضي من دورة القلب عندما يتم توسيع الأورطا إلى أقصى حد. رسم ثلاثة خطوط عبر ثلاث دقات قلب مختلفة للحصول على قياسات دقيقة ومتوسط من MILD. في AAA ، يتم أخذ القياسات في التوسع الأقصى للأورطام. من المستحسن أيضًا صيام الحيوانات 4-6 ساعة قبل جمع الصور لتجنب التداخل من حركية الأمعاء وضمان وضوح الصورة.
2. تحليل سرعة انتشار النبض (PPV)
   1. افتح صورة EKV وأوقف نبضات القلب مؤقتًا.
   2. افتح نافذة جديدة على برنامج التحليل (على سبيل المثال، Vevo Vac) بالنقر على رمز الاسم.
   3. انقر على خيار PPV (السهم في الشكل 3D). ستظهر نافذة صغيرة مع صورة الأورطا.
   4. رسم مربع مستطيلة عن طريق النقر على جدار السفينة العلوي وسحب المؤشر لحوالي 4 ملم تغطي جدران الشريان الأورطاني فوق الكلى.
      ملاحظة: حافظ على طول المربع متناسقًا (~4 مم) لجميع الصور. يمكن للمستخدم ضبط مربع مستطيلة عن طريق تدوير لمحاذاة مربع واختيار الخط ثم سحب إلى موقف جديد على السفينة التي يجري تحليلها للحصول على تصريف أنسب وواضحة من موجة النبض. سيتم عرض الخطوط الرأسية للبيانات من المستطيل وتحديدها على أنها اليسار (الصورة العلوية) واليمين (الصورة السفلية) على عائد الاستثمار. للحصول على تصور أفضل لتصريف موجة النبض ، من المفيد أحيانًا مربع الرسم فقط على الجدار العلوي كما هو موضح في الشكل 3. سيقوم البرنامج تلقائيا بحساب PPV (م / س). ومع ذلك ، فمن الأفضل دائمًا ضبط الخطوط الأرجوانية يدويًا لتعيين نقطة الانقلاب الدقيقة على موجات النبض وستتغير PPV وفقًا لذلك.
   5. وأخيراً، حدد الأمر قبول لحفظ قيم PPV. تصدير الأرقام والبيانات إلى محرك تخزين البيانات.
3. تحليل للتعصّب والسلالة الشعاعية
   1. افتح صورة EKV وأوقف نبضات القلب مؤقتًا.
   2. انقر على أيقونة البرنامج. البرنامج سيفتح نافذة جديدة.
   3. انقر على تتبع العائد على الاستثمار الجديد ورسم مربع مستطيلة على كل من جدران السفينة. سيقوم البرنامج بتتبع الجدران العلوية والسفلية للسفينة تلقائيًا. يمكن للمستخدم ضبط التتبع لمحاذاة على الجدار عن طريق النقر على النقاط الخضراء(الشكل 4A، B).
   4. الآن قبول التتبع. سيقوم البرنامج بحساب عدم القابلية (1/Mpa) في عائد الاستثمار المحدد.
   5. لقياس السلالة الشعاعية، حدد خيار السلالة المناسب من أشرطة القائمة في أعلى اليسار. سيتم فتح الصور للسلالة الشعاعية والإجهاد العرضي.
   6. الحصول على قيمة السلالة الشعاعية (٪ ) عن طريق تحريك المؤشر على ذروة المنحنى. تصدير البيانات كصور أو في شكل فيديو(الشكل 4A, B).

النتائج

تظهر صور M-mode التمثيلية لأورطا البطني العادي وتمدد الأوعية الدموية من الفئران في الشكل 2A والشكل 2B، على التوالي. يتم تحديد الشريان الأورطيا البطني فوق الكلى من خلال موقعه بجوار الشريان الكلوي الأيمن والشريان الميسنتيك المتفوق(...

Discussion

التصوير بالموجات فوق الصوتية يوفر تقنية قوية لتحديد الخصائص الوظيفية للأورطام من خلال قياسات PPV، وقابلية التشتت والسلالة الشعاعية. هذه القياسات مفيدة بشكل خاص لدراسة نماذج الماوس من AAA ونهج في الجسم الحي يسمح لجمع البيانات الطولية التي يحتمل أن تكون مهمة لفهم التطور الزمني للأمراض الأبه?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotensin II	Sigma	A9525
Apoe-/- mice	The Jackon lab
Clippers	WAHL	1854
Cotton swab	Q-tips
DAPT	Sigma	D5942
Depilatory cream	Nair	LL9038
Electrode cream	Sigma	17-05
Gel warmer	Thermasonic (Parker)	82-03 (LED)
Heating pad	Stryker	T/pump professional
Isoflurane	VetOne	Fluriso TM
Isoflurane vaporizer	Visualsonics	VS4244
Lubricating ophthalmic ointment	Lacri-lube
Osmotic pumps	Alzet	Model 2004
Oxygen tank	Air gas
Tranducer	Visualsonics	MS-400 or MS550D
Ultrasonic gel	Parker	Aquasonic clear
Ultrasound Imaging System	Visualsonics	Vevo 2100
Vevo Vasc Software	Visualsonics